Las especies reactivas del oxígeno (ROS), superóxido (O2o-), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radical hidroxilo (OHo), se generan a partir de la reducción parcial del oxígeno molecular durante procesos metabólicos como la respiración o tras la exposición a ciertos agentes ambientales como las radiaciones UV. Estas ROS pueden reaccionar con biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA e inactivar su función, por lo que las células han desarrollado actividades enzimáticas que se encargan de mantener niveles no-tóxicos de estos oxidantes. Se llama estrés oxidativo a la situación en la cual se produce un incremento en la concentración intracelular de ROS como consecuencia de un aumento en la generación o una disminución en la degradación de las mismas. En respuesta a estrés oxidativo, la célula activa rutas de señalización y factores de transcripción específicos que activan la expresión de proteínas antioxidantes encargadas de reestablecer los niveles redox intracelulares y de reparar los desperfectos causados por estos oxidantes. La levadura Schizosaccharomyces pombe es un organismo modelo ideal para el estudio de las respuestas a estrés oxidativo en las células eucariotas ya que posee sensores específicos a estrés oxidativo como el factor de transcripción Pap1 (pombe AP-1-like) y rutas de respuesta global a estrés, como las descritas en las células de mamífero, que son activadas por diferentes tipos de estrés. En el centro de esta ruta de respuesta global a estrés se encuentra la MAPK (Mitogen-activated protein kinase) Sty1. El factor de transcripción Pap1, de localización citoplasmática basal, se acumula en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo. Este cambio de localización subcelular es debido a la inhibición del exporte nuclear dependiente de Crm1, aunque se desconocía el mecanismo molecular utilizado por este factor de transcripción para sensar y responder a oxidantes como H2O2 y dietilmaleto (DEM). Los resultados obtenidos indican que H2O2 oxida de forma reversible dos residuos de cisteína de Pap1 induciendo, seguramente, la formación de un puente disulfuro intramolecular, mientras que, DEM actúa como un agente alquilante que modifica de forma irreversible los residuos de cisteína del dominio C-terminal de Pap1. El gen que codifica para el factor de transcripción Pap1 fue aislado inicialmente como un gen que, en elevado número de copias, confería a las células un fenotipo de resistencia a ciertas drogas como estaurosporina. Esto es debido a que, tras acumularse en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo, Pap1 activa la transcripción de genes implicados tanto en la respuesta antioxidante como en la resistencia a multidrogas. Todos aquellos genes que, al igual que pap1 fueron identificados por su implicación en la resistencia a multidrogas, codifican para proteínas que regulan la actividad del factor de transcripción Pap1. hba1 fue el único gen relacionado con resistencia a multidrogas, cuyo producto génico, una proteína con un dominio de unión a Ran (Ran-binding domain), Hba1, no había sido relacionado con la actividad de Pap1. Uno de los objetivos de mi trabajo experimental era el de determinar si Hba1 tenía un papel en la regulación de la actividad de Pap1. Nuestros resultados indican que la proteína Hba1, localizada en el nucleoplasma de la célula, participa en el exporte nuclear mediado por Crm1 de ciertas proteínas como el factor de transcripción Pap1 y la MAPK Sty1, aunque no de otras como la proteína PKI. Por ello, la pérdida de función de Hba1, por sobreexpresión o deleción del gen hba1, induce la localización nuclear constitutiva de Pap1 y Sty1 en ausencia de estrés. Esta localización nuclear de Pap1 es suficiente para la activación transcripcional de sus genes diana. Por lo tanto, el fenotipo de resistencia aumentada a multidrogas de las cepas en las que se ha perdido la actividad de la proteína Hba1, es debido a la acumulación de Pap1 en el núcleo en condiciones de no-estrés.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der genetischen Optimierung der Spalthefe S. pombe für die biotechnologische Produktion von Fremdproteinen. Hierbei werden vor allem zwei Aspekte näher untersucht, zum einen die Stabilität des zu produzierenden Proteins und zum anderen die Bildung von Disulfidbrücken. Von anderen Organismen ist bekannt, dass die N-terminale AS im Verbund mit einem Lysinrest ein Protein destabilisieren kann. Das Modellprotein vVEGF besitzt an Position 2 einen Lysinrest (K2) und damit ein Hauptmerkmal eines derartigen Destabilisierungselementes. Falls das Protein dem Ubiquitin-vermittelten Abbau unterliegt, ist es wahrscheinlich, dass K2 eine essenzielle Rolle für die Stabilität dieses Proteins spielt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass K2 in S. cerevisiae destabilisierend wirkt, während es in S. pombe keinen destabilisierenden Effekt hat. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass es Unterschiede im Ubiquitin-vermittelten Abbau von Proteinen in diesen beiden Hefen gibt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Analyse und Optimierung der Bildung von Disulfidbrücken in S. pombe. Disulfidbrücken stellen eines der wichtigsten Elemente der korrekten Proteinfaltung dar und werden in Eukaryonten vorwiegend im oxidierenden Milieu des ER in das naszierende Protein eingeführt. Aus diesem Grunde wurden Proteindisulfid-isomerasen (PDIs) und ER-oxidoreduktin (Ero)-ähnliche Proteine, die die Schlüssel-komponenten der Bildung von Disulfidbrücken in Eukaryonten darstellen, näher untersucht. In S. pombe finden sich insgesamt drei PDI-Homologe (SpPdi1p, SpPdi2p und SpPdi3p) sowie zwei Ero-Homologe (SpEro1a p und SpEro1b p). Mit Ausnahme des nicht glycosylierten SpPdi2p, sind alle Proteine Membran-assoziierte glycosylierte Komponenten des ER. SpPdi2p und SpPdi3p sowie SpEro1a p und SpEro1b p liegen in vivo teilweise in oxidiertem Zustand vor. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass SpEro1b p, nicht jedoch SpEro1a p in der Lage ist, die temperatursensitive S. cerevisiae ero1-1-Mutante funktionell zu komplementieren. Interessanterweise ergab die Untersuchung konservierter Cysteine mittels gerichteter Mutagenese einerseits Unterschiede zwischen SpEro1a p und SpEro1b p sowie andererseits zwischen den S. pombe Ero-Proteinen und den Ero-Proteinen anderer Spezies. Im Gegensatz zu Ero1b p wird Ero1a p durch reduzierenden Stress und Hitzestress induziert. Dies deutet darauf hin, dass SpEro1b p für die Bildung von Disulfidbrücken unter normalen Wachstumsbedingungen nötig ist, während SpEro1a p vornehmlich bei der Adaption der Zellen an Stressbedingungen erforderlich ist. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Expression von SpEro1a p und SpEro1b p zu einer deutlich erhöhten Ausbeute des disulfidhaltigen heterologen Proteins Orf19p-HA führt. Dieser Befund impliziert, dass in S. pombe die Oxidation der Disulfidbrücken für die Faltung von Proteinen vermutlich limitierend ist.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der genetischen Optimierung der Spalthefe S. pombe für die biotechnologische Produktion von Fremdproteinen. Hierbei werden vor allem zwei Aspekte näher untersucht, zum einen die Stabilität des zu produzierenden Proteins und zum anderen die Bildung von Disulfidbrücken. Von anderen Organismen ist bekannt, dass die N-terminale AS im Verbund mit einem Lysinrest ein Protein destabilisieren kann. Das Modellprotein vVEGF besitzt an Position 2 einen Lysinrest (K2) und damit ein Hauptmerkmal eines derartigen Destabilisierungselementes. Falls das Protein dem Ubiquitin-vermittelten Abbau unterliegt, ist es wahrscheinlich, dass K2 eine essenzielle Rolle für die Stabilität dieses Proteins spielt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass K2 in S. cerevisiae destabilisierend wirkt, während es in S. pombe keinen destabilisierenden Effekt hat. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass es Unterschiede im Ubiquitin-vermittelten Abbau von Proteinen in diesen beiden Hefen gibt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Analyse und Optimierung der Bildung von Disulfidbrücken in S. pombe. Disulfidbrücken stellen eines der wichtigsten Elemente der korrekten Proteinfaltung dar und werden in Eukaryonten vorwiegend im oxidierenden Milieu des ER in das naszierende Protein eingeführt. Aus diesem Grunde wurden Proteindisulfid-isomerasen (PDIs) und ER-oxidoreduktin (Ero)-ähnliche Proteine, die die Schlüssel-komponenten der Bildung von Disulfidbrücken in Eukaryonten darstellen, näher untersucht. In S. pombe finden sich insgesamt drei PDI-Homologe (SpPdi1p, SpPdi2p und SpPdi3p) sowie zwei Ero-Homologe (SpEro1a p und SpEro1b p). Mit Ausnahme des nicht glycosylierten SpPdi2p, sind alle Proteine Membran-assoziierte glycosylierte Komponenten des ER. SpPdi2p und SpPdi3p sowie SpEro1a p und SpEro1b p liegen in vivo teilweise in oxidiertem Zustand vor. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass SpEro1b p, nicht jedoch SpEro1a p in der Lage ist, die temperatursensitive S. cerevisiae ero1-1-Mutante funktionell zu komplementieren. Interessanterweise ergab die Untersuchung konservierter Cysteine mittels gerichteter Mutagenese einerseits Unterschiede zwischen SpEro1a p und SpEro1b p sowie andererseits zwischen den S. pombe Ero-Proteinen und den Ero-Proteinen anderer Spezies. Im Gegensatz zu Ero1b p wird Ero1a p durch reduzierenden Stress und Hitzestress induziert. Dies deutet darauf hin, dass SpEro1b p für die Bildung von Disulfidbrücken unter normalen Wachstumsbedingungen nötig ist, während SpEro1a p vornehmlich bei der Adaption der Zellen an Stressbedingungen erforderlich ist. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Expression von SpEro1a p und SpEro1b p zu einer deutlich erhöhten Ausbeute des disulfidhaltigen heterologen Proteins Orf19p-HA führt. Dieser Befund impliziert, dass in S. pombe die Oxidation der Disulfidbrücken für die Faltung von Proteinen vermutlich limitierend ist.

L’étude qui vous est présentée dans ce mémoire est réalisée chez l’organisme Schizosaccharomyces pombe et elle porte sur la caractérisation de la protéine Nab2, une protéine liant les queues poly(A) ainsi que sur son implication dans la régulation génique. Tout d’abord, il faut savoir qu’il existe quatre modes de régulation (transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel) dans lesquels interviennent différents types de protéines, en particulier des protéines liant les queues poly(A) des ARN, aussi connues sous le nom de PABPs. Ces protéines reconnaissent l’ARN à l’aide de différents domaines de liaison et elles se subdivisent en deux catégories : les PABPs nucléaires ou cytoplasmiques, représentées respectivement par PABPN1 et PABPC1 chez les mammifères. Comprendre la fonction des PABPs revêt un intérêt particulier puisqu’elles sont impliquées à différents stades de la régulation génique. Des maladies ont aussi été associées à deux PABPs nucléaires humaines, PABPN1 et ZC3H14, mais aucune association entre leur fonction réciproque et la maladie n’a pu être établie. Une des façons de comprendre leur rôle est d’étudier celui de leurs orthologues respectifs. Chez la levure à fission, un orthologue de PABPN1 a été caractérisé et il s’agit de Pab2. S. pombe possède cependant une seconde PABP nucléaire, Nab2, qui est caractérisée dans ces travaux. Des méthodes in vivo et in vitro ont été utilisées afin de confirmer le statut de la protéine, à savoir qu’il s’agit bel et bien d’une PABP nucléaire et que celle-ci est non essentielle. L’identification de partenaires protéiques de Nab2 par spectrométrie de masse a aussi permis de relier Nab2 avec des processus de régulation génique tels que l’épissage et la dégradation. Puisque Pab2 est aussi associée à des fonctions en lien avec la dégradation, il est possible de faire un parallèle entre ces deux protéines et de supposer qu’elles interagissent ensemble. La deuxième partie de ces travaux porte donc sur l’étude de la relation fonctionnelle entre Nab2 et Pab2 et elle a permis de montrer un mécanisme de régulation opportuniste basé sur la liaison de la cible ARN par l’une ou l’autre de ces PABPs. En effet, l’étude de la régulation du gène modèle RPL30-2 indique que Nab2 et Pab2 ont des rôles opposés puisqu’ils sont respectivement des régulateurs positifs et négatifs de l’expression de son transcrit.

Les travaux décrits dans ce mémoire visent à élucider le rôle de la protéine Pab2 dans la régulation des gènes méiotiques. La méiose est un phénomène conservé à travers l'évolution chez les organismes eucaryotes. Chez les eucaryotes unicellulaires comme la levure, la méiose accomplie [i.e. accomplit] autant un rôle de reproduction sexuelle qu'un rôle de protection de l'organisme. Chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe , le processus de méiose résultant de la reproduction de deux individus génère des spores, des structures résistantes aux conditions environnementales détrimentales. Lorsque la cellule enclenche la méiose, plusieurs centaines de gènes sont temporellement induits pour exprimer des gènes spécifiques aux processus méiotiques. Afin de s'assurer que des gènes méiotiques ne soient pas exprimés pendant la mitose au détriment de la cellule, des mécanismes de surveillance doivent rigoureusement surveiller l'expression de ces gènes. Afin d'éclaircir le rôle de Pab2 dans cette surveillance, nous avons utilisé une approche génétique combinée à des essais biochimiques. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine combinées à des essais de substitution de promoteur ont démontré que la régulation de Pab2 sur les gènes méiotiques est posttranscriptionnelle. De plus, des expériences d'immunoprécipitation de la protéine Pab2 suivies d'analyse d'ARN ont démontré que la protéine Pab2 forme un complexe in vivo avec les ARN qu'elle régule. Des analyses dans le laboratoire ont démontré que Pab2 possède une interaction fonctionnelle et physique avec des composantes de l'exosome. Afin de déterminer l'implication de l'exosome dans la régulation des gènes méiotiques, nous avons utilisé différentes souches de levure [i.e. levures] possédant des délétions dans les gènes des composantes de l'exosome ou des facteurs coopérant avec ce complexe, en présence ou absence de Pab2. Ces expériences ont démontré que l'exosome nucléaire, particulièrement la sous-unité Rrp6, était majoritairement responsable de la dégradation des transcrits méiotiques, et ce sans l'aide de complexes coopérateurs comme le TRAMP. Afin de déterminer le facteur de sélectivité de la régulation par Pab2 et par l'exosome, nous avons utilisé des souches thermosensibles pour la protéine Mmi 1, un autre agent posttranscriptionnel impliqué dans la surveillance de l'expression des gènes méiotiques. Ces expériences ont démontré que Pab2 coopère avec Mmi1 dans la dégradation des transcrits méiotiques. Notamment, l'augmentation de l'expression des gènes méiotiques en absence de Pab2 est suffisante pour contourner la voie dépendante de meiRNA, qui est un ARN non-codant essentiel à l'initiation de la méiose. Ces résultats constituent l'évidence que la protéine Pab2 liant les queues poly(A) participe au maintient du silence de l'expression des gènes méiotiques pendant la mitose.

Chez Schizosaccharomyces pombe, le cycle méiotique est le mode de division cellulaire spécialisé qui permet la formation d’ascospores résistantes à différents stress lorsque les conditions environnementales ne sont pas propices à la multiplication cellulaire. Lors de mes travaux de thèse, mes objectifs consistaient à caractériser le rôle et le mécanisme d’action de la protéine Cuf2 lors du cycle méiotique chez S. pombe. Mes résultats ont montré que le gène cuf2[indice supérieur +] était exprimé exclusivement lors des divisions méiotiques et que la protéine se co-localisait de manière constitutive avec le matériel génétique. De plus, mes résultats ont dévoilé que Cuf2 participait à l’activation et à la répression de plusieurs gènes méiotiques selon un mécanisme de nature transcriptionnelle en s’associant spécifiquement avec leur région promotrice. Par la suite, mes résultats ont mis en évidence que Cuf2 interagissait physiquement avec Mei4, un facteur de transcription méiose-spécifique, au noyau des cellules méiotiques. Notamment, mes résultats ont montré que la présence de Mei4 et de son motif de liaison à l’ADN dénommé FLEX étaient nécessaires afin que Cuf2 puisse s’associer au promoteur de son gène cible fzr1[indice supérieur +] afin d’en activer l’expression. L’ensemble de mes résultats indiquent que Cuf2 et Mei4 interagissent aux promoteurs de certains gènes lors des divisions méiotiques afin d’en co-activer l’expression. D’ailleurs, mes résultats ont également montré que la fonction de Cuf2 était importante à la formation d’ascospores et à leur viabilité ; en absence de Cuf2, la majorité des ascospores présentent diverses aberrations et plus de la moitié d’entre elles sont non-viables. Globalement, mes résultats démontrent que Cuf2 est un régulateur critique de l’expression génique lors du cycle méiotique et que cette fonction est essentielle à la sporulation chez S. pombe.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

The establishment of cell polarity is a vital requirement for cellular processes such as proper cell division, growth and movement. Cell polarization relies on different internal and external cues in order to reorient the cell growth machinery along the axis of polarity. The core mechanisms involved in establishment of polarized growth are highly conserved from yeast to humans. Cells of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe grow in a highly polarized fashion, with cell growth restricted to the cell tips, making fission yeast an excellent model system to study polarized growth. Here I describe a system for long-term live-cell imaging of fission yeast polarized growth that is stress free, physiological and accessible to media change and drug addition. I use this improved imaging system along with yeast genetics and drug perturbations to address how cell polarity is established and maintained in fission yeast. I have shown that fission yeast growth polarity depends on competition and cooperation among three distinct internal polarity cues: 1) A microtubule-based cue involving Tea1/Tea4 polarity proteins positively regulates polarized growth, initially at the “old” cell end (i.e., the end that pre-existed in the mother cell) and later at the “new” cell end (i.e. the end that is generated by septation), in order to initiate the transition from monopolar to bipolar growth (also known as New End Take-Off, or “NETO”). 2) An actin cable-based cue “clears” polarity proteins from the new end immediately after cytokinesis thereby reinforcing old-end growth. As a result perturbation of actin cable-based transport by either deleting actin cable nucleator For3 or cable-based transporter Myo52 results in premature bipolar growth. 3) A novel “memory-based” growth polarity cue helps to establish polarized growth in the absence of the microtubule-based cue. This memory-based cue is dependent on the predicted transmembrane proteins Rax1/Rax2. In the absence of both Tea1/Tea4 cue and Rax1/Rax2 cue, cells depend on septation cue and grow exclusively from the cell ends generated by septation. Furthermore, both Tea1/Tea4 and Rax1/Rax2 cue are important to maintain polarized growth under various environmental stresses. In fission yeast, during interphase, nucleus is positioned at the centre of the cell and this precise positioning of nucleus, which is important for defining the position of cytokinetic ring is thought to be exclusively MT-dependent. Here I show that MT-independent nuclear movement exists in fission yeast and this nuclear movement is mediated by actin cables and type myosin myo52. Furthermore, I show that actin cable might be important for buffering the pushing forces generated by MTs on the nucleus. In this way both microtubules and actin cables are involved in nuclear movement in fission yeast.

Compact heterochromatin is essential for genome stability and hence cell survival. Studies in many organisms including humans underline the importance of pericentromeric heterochromatin in centromere function. Fission yeast centromeres share a common structural organisation with those of their metazoan counterparts. The fission yeast model has been pivotal in understanding many key events in the pathway leading to the assembly of pericentromeric heterochromatin. In particular, studies in this system have revealed that the RNA interference (RNAi) pathway connects with the chromatin modification machinery to impart proper heterochromatin formation. Transcription of the pericentromeres by RNA polymerase II (Pol II) produces double stranded RNA (ds RNA) which is processed by Dicer(Dcr1) into small interfering RNAs (siRNAs). These siRNAs are loaded onto the Argonaute protein Ago1, and target the Ago1- containing RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing) complex to the pericentromeres via complementary base-pairing of the siRNA to the nascent centromeric transcript. RITS then recruits the sole Histone H3-K9-methyl transferase, Clr4, as part of the Clr4-complex, CLRC. The resulting H3K9-methyl marks further result in the recruitment of downstream chromatin binding proteins including the HP1- homolgue Swi6 which plays a key role in cohesin retention. Additionally, the H3K9- methyl marks are required for stabilising the association of CLRC and RITS, thereby promoting a reinforcing loop within the RNAi-mediated heterochromatin pathway. Thus crosstalk between RITS and CLRC is important in establishing and maintaining silent chromatin at the pericentromeres. Stc1 has been proposed to act as a critical link that connects the RITS and CLRC complexes. Stc1 is required for heterochromatin establishment and maintenance at the pericentromere and association of RITS with CLRC is lost in the absence of Stc1. Moreover, Stc1 directly interacts with Ago1 and is essential for siRNA production. These and other previous observations (Bayne et al. 2010) highlight the key role played by Stc1 in the RNAi-mediated heterochromatin pathway. To understand how Stc1 mediates the specific cross-talk between RNAi and chromatin modification, I have investigated the nature of Stc1 interactions with the RNAi and chromatin modification machineries. Using in-vitro binding assays, I found that Stc1 directly interacts with the CLRC subunits Dos2 and Clr4. I also identified the RITS subunit Tas3 as a potential interactor of Stc1, in addition to Ago1. A collaborating research group elucidated the structure of Stc1 using NMR (He et al. 2013) and my study provides evidence for interactions via the distinct domains of Stc1. Stc1 utilises its disordered C-terminus to bind to Dos2 while the N-terminus, which contains a tandem zinc finger domain, acts as a multi-protein interaction interface binding the CLRC subunit Clr4 and RITS subunits Ago1 and Tas3, opening up possibilities for Stc1-containing distinct-complexes. My work provides new insights into the role of Stc1 and opens up future avenues of research key to understanding how heterochromatin domains are defined and maintained.