published_or_final_version / Biochemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

INTRODUÇÃO: Embora a população diabética seja extremamente significativa e crescente nos últimos anos, os estudos envolvendo regeneração nervosa e diabetes mellitus (DM) não são muitos e, frequentemente, mostram resultados conflitantes e pouco conclusivos. O objetivo deste trabalho foi estudar a regeneração nervosa em ratos diabéticos. MÉTODOS: O trabalho foi realizado no Laboratório de Microcirurgia Experimental (LIM 4) do HC-FMUSP. Utilizaram-se 40 ratos machos, que foram separados em 2 grupos principais, cada um com 20 animais: grupo controle e grupo diabetes. Cada grupo foi subdividido em 2 subgrupos de 10 animais: controle com neurorrafia término-terminal (CN), controle com enxerto de nervo (CE), diabético com neurorrafia términoterminal (DN) e diabético com enxerto de nervo (DE). A indução do DM foi feita pela inoculação de estreptozotocina na dose de 60mg/Kg, por via intraperitoneal e após 8 semanas os animais foram submetidos à cirurgia. Diversas avaliações foram feitas: massa corporal, glicemias, testes da marcha e eletrofisiológico, índice de peso do músculo tríceps sural (pata operada/não operada) e análises histomorfométricas. RESULTADOS: Ocorreram 3 óbitos, 1 no CN, 1 no DN e 1 no DE. Nas avaliações pósoperatórias o peso dos animais do grupo controle foi maior que o do grupo diabetes (p<0,05). Todos os ratos do grupo diabetes mostraram níveis glicêmicos bem superiores aos do grupo controle (p<0,05), mantendo-se sempre maiores que 200mg/dL. No 20o PO o teste da marcha foi mais próximo do normal nos animais do grupo controle do que no grupo diabetes (p<0,05), sendo melhor nos subgrupos com neurorrafia do que com enxerto de nervo (p<0,05). No 40o PO o panorama se manteve, exceto pela comparação do DN com o DE (p>0,05). Já no 60o PO o teste foi semelhante entre os animais do grupo controle (CN e CE) e o DN (p>0,05), se mostrando pior no DE (p<0,05). No teste eletrofisiológico com 60 dias de evolução, as amplitudes do potencial evocado foram semelhantes entre os subgrupos controles e diabéticos (p>0,05). O índice de peso do músculo tríceps sural foi maior no CN em comparação com os outros 3 subgrupos (p<0,05), não se verificando o mesmo nas demais comparações (p>0,05). No 60o PO não se encontraram diferenças estatisticamente significativas na comparação dos subgrupos controles e diabéticos em relação à densidade axonal, medidas das áreas das secções transversas das fibras nervosas, dos axônios e das células de Schwann. CONCLUSÕES: O teste da marcha mostrou que a recuperação funcional foi mais rápida nos animais do grupo controle, porém, com 60 dias, o DN apresentava uma recuperação semelhante aos animais controles, ao passo que o DE ainda não. A resposta da musculatura tríceps sural ao estímulo do nervo ciático com 60 dias de evolução, verificada no teste eletrofisiológico, se mostrou parecida nos animais controles e diabéticos, não havendo diferença estatística. A atrofia muscular, vista pelo índice de peso do músculo tríceps sural, foi menor em CN, porém sem diferença estatística entre CE, DN e DE. A densidade de axônios, assim como os calibres das fibras nervosas e dos axônios não foram estatisticamente diferentes nos animais diabéticos no 60o PO / INTRODUCTION: Although the diabetic population is highly significant and has been growing during the past few years, studies involving nerve regeneration and diabetes mellitus (DM) are rather uncommon, frequently demonstrating divergent results and few conclusions. The objective of this study is to evaluate nerve regeneration in diabetic rats. METHODS: The study was accomplished in the Experimental Microsurgery Laboratory (LIM 4) of the HC-FMUSP. The study included 40 male rats, separated into two main groups: 20 controls and 20 diabetic animals. Each group was then further subdivided into two subgroups with 10 animals in each: control with end-toend neurorrhaphy (CN); control with nerve graft (CE); diabetic with end-toend neurorrhaphy (DN); and diabetic with nerve graft (DE). DM was accomplished by intraperitoneal innoculation of 60mg/Kg of streptozocin and the animals underwent surgery eight weeks later. Various evaluations were performed: body mass, glycemias, walking and electrophysiology tests, triceps surae muscle weight index (operated/non-operated paw) and histomorphometric analysis. RESULTS: Three deaths occurred; one in CN, one in DN, and one in DE. In the postoperative evaluations the weight of the control animals was greater than that of the diabetic group (p<0.05). All the rats in the diabetic group demonstrated glycemic levels very superior to those of the control group (p<0.05), always remaining over 200mg/dL. On the 20th PO day, the walking test was closer to normal in the control group than in the diabetic one (p<0.05), better in the neurorrhaphy subgroups than in the nerve graft ones (p<0.05). On the 40th PO day the range was maintained, except for comparison of DN with DE (p>0.05). Already on the 60th PO day, the test was similar among the animals of control group (CN and CE) and DN (p>0.05), seeming worse on DE (p<0.05). At 60 days the potential amplitudes of the electrophysiological test were similar among the control and diabetic subgroups (p>0.05). Triceps surae muscle weight index was greater in the CN compared with the other three subgroups (p<0.05), which was not seen in the other comparisons (p>0.05). On the 60th PO day no statistically significant differences were observed when comparing the control and the diabetic subgroups regarding the axonal density, measurent of the areas of the transverse sections of the nerve fibers, axons and Schwann cells. CONCLUSIONS: The walking test showed that the functional recovery was swifter in the control group animals. At 60 days, however, DN presented a recovery similar to that of the control animals, whereas DE still did not. Triceps surae muscle response upon stimulation of the sciatic nerve at 60 days, verified by the electrophysiological test, showed it to be similar in the control and diabetic animals, without a statistical difference. The muscular atrophy observed by the triceps surae muscle weight index was less in CN, however, without a statistical difference among CE, DN and DE. The axon densities as well as the calibers of the nerve fibers and axons were not statistically different in the diabetic animals at 60 days PO

OBJETIVO: avaliar o efeito das neuregulinas 1-alfa e 1-beta na regeneração de nervos ciáticos de camundongos C57BL/6J, adultos, machos, através da técnica de tubulização. MÉTODOS: Utilizaram-se 18 animais, divididos em 3 grupos, implantando-se prótese de polietileno em falhas de 4,0 mm no nervo ciático esquerdo: grupo 1 contendo apenas colágeno purificado (Vitrogen®); grupo 2, colágeno associado a neuregulina 1-alfa; grupo 3 com colágeno e neuregulina 1-beta. O grupo controle foi formado por 6 segmentos de nervos ciáticos direitos. Após 4 semanas, os animais foram sacrificados; extraiu-se segmento do ponto médio do nervo regenerado no interior das próteses, padronizaram-se cortes histológicos e confecção das lâminas para análise histomorfométrica. Confrontaram-se os resultados estatisticamente. RESULTADOS: Os animais tratados com neuregulinas tiveram maior número de axônios mielinizados, com diferença estatisticamente significante quando comparados ao grupo colágeno. Não houve diferença estatística entre os grupos de neuregulinas 1-alfa e 1-beta. CONCLUSÃO: a adição de neuregulinas proporcionou aumento significativo do número de fibras mielinizadas. / PURPOSE: To evaluate the effect of neuregulins 1-alpha and 1-beta on the regeneration the sciatic nerves of male adult C57BL/6J mice, using the tubulization technique. METHODS: Eighteen animals were used, divided into three groups. A polyethylene prosthesis was implanted in a 4.0 mm defect of the left sciatic nerve, as follows: group 1 containing only purified collagen (Vitrogen®); group 2, collagen with neuregulin 1-alpha; group 3, collagen with neuregulin 1-beta. The control group was formed by six segments of right sciatic nerves. Four weeks later, the animals were sacrificed. A segment from the midpoint of the nerve regenerated inside the prostheses was extracted, histological sections were standardized and slides were made up for histomorphometric analysis. The results were statistically compared using the Tukey multiple comparisons test and Students t test. RESULTS: The animals treated with neuregulins had greater numbers of myelinized axons, with a statistically significant difference in relation to the collagen-only group. There was no statistical difference between the neuregulin 1-alpha and 1- beta groups. CONCLUSION: It was concluded that the addition of neuregulins provided a significant increase in the number of myelinized fibers.

Os nervos periféricos são extensões do sistema nervoso central e responsáveis pela interação das atividades das extremidades, em suas funções sensitiva e motora. São vulneráveis aos mesmos tipos de traumas que afetam outros tecidos: contusão, compressão, esmagamento, estiramento, avulsão e laceração. Desta forma, a interrupção de continuidade da estrutura do nervo, por algum tipo de trauma, resulta na interrupção de transmissão dos impulsos nervosos e na desorganização de suas atividades funcionais. Para tanto, em vista da evolução tecnológica e o desenvolvimento de equipamentos mais sofisticados, a microcirurgia vem ganhando cada vez mais espaço no campo da investigação experimental referente a recuperação de nervos periféricos lesionados. Em uma secção simples, sem perda tecidual, a neurorrafia denominada término-terminal apresenta bons resultados, contudo, quando ocorre perda de tecido nervoso ou, não se têm mais os cotos distais do nervo, outras técnicas devem ser empregadas, até porque, não se pode de modo algum tencionar o nervo numa tentativa de coaptá-lo novamente. Várias técnicas de tubulização utilizando-se materiais biológicos e não biológicos, para criar um meio por onde ocorrerá a regeneração nervosa já foram ou ainda estão sendo testados com resultados insatisfatórios sob o aspecto funcional.É sabido que em um trauma sem perda tecidual, numa neuropraxia, por exemplo, o nervo recupera espontaneamente de forma satisfatória. É sabido também que em um feixe vásculo-nervoso, o nervo periférico encontra-se em íntimo contato com a adventícia de artérias e veias. A adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidimos testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto com tubo de polietileno preenchido por tecido adiposo autólogo. Para tanto será utilizado um tubo com 12 mm de comprimento por 0,25 mm de diâmetro, com poros de 80 µm de diâmetro, preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências do referido nervo, na tentativa de se recuperar o nervo isquiático. A certificação do sucesso da recuperação do nervo será feita por meio de técnicas de microcirurgia, microscopia e morfometria. O enxerto de polietileno mostrou ter resistência a pressões, uma vez que não foi observado colapso estrutural. A gordura mostrou ser bom material trófico já que no grupo onde a utilizou apresentou resultados mais próximos do controle final. / Peripheral nerves are extensions of the central nervous system and are responsible for the interaction of the activities of the extremities in their sensory and motor function. They are vulnerable to these types of injuries that affect other tissues: contusion, compression, crush, stretch, tear and avulsion. Thus, the interruption of continuity of the nerve structure, due to some sort of trauma, results in the interruption of transmission of nerve impulses and disruption of their functional activities. Therefore, in view of technological evolution and development of more sophisticated equipment, microsurgery is gaining more space in the field of experimental research concerning the recovery of injured peripheral nerves. In a single section, without loss of tissue, called the end-terminal neurorrhaphy was also good, however, when there is loss of nervous tissue or, if not longer have the distal nerve stumps, other techniques must be employed, because, in any circumstance the nerve should be tensioned as an attempt to coaptation again. Several techniques of tubing, using biological materials and non-biological means to create a place where nerve regeneration have been or are still being tested with unsatisfactory results in the functional aspect. It is known that in a trauma without loss of tissue, a neuropraxia, for example, the nerve recovers spontaneously and satisfactorily. It is also known that in a neurovascular bundle, the peripheral nerve is in close contact with the adventitia of arteries and veins. The adventitia of the vessels is composed of loose connective tissue rich in adipocytes. Thus, in trauma, the neurites from the proximal stump of injured nerve, are directly in contact with these adipocytes. Following this reasoning, and based on previous work where it was used vein filled with fresh skeletal muscle as a graft, decided to test the possibility of axonal growth by grafting polyethylene tube filled with autologous adipose tissue. For that will be used with a tube 12 mm long and 0.25 mm in diameter, with pores of 80 microns in diameter, filled with fresh adipose tissue removed from the vicinity of that nerve, in an attempt to recover the sciatic nerve. Certification of successful nerve recovery will be done through microsurgical techniques, microscopy and morphometry. The graft polyethylene proved to have pressure resistance, since no structural collapse was observed. The fat was found to be good material as trophic group which had used the results closer to the ultimate control.

Nas lesões onde há secção de nervos o cirurgião necessita restabelecer a continuidade entre dois cotos. Apesar de ser considerado como o método padrão, a sutura com fios de náilon pode ocasionar reação inflamatória prejudicando o processo de regeneração ou ser de difícil execução, nos casos de nervos de calibres reduzidos. O reparo com adesivo de fibrina é uma opção ao reparo com sutura convencional, mas a comparação entre esses dois métodos apresenta resultados conflitantes na literatura. O objetivo deste trabalho foi comparar os parâmetros usualmente empregados na avaliação da regeneração do nervo ciático do rato previamente seccionado com a utilização do reparo com a sutura convencional, com o adesivo de fibrina ou uma combinação das duas técnicas. Previamente à secção do nervo ciático do lado direito, cada animal foi submetido à mensuração do índice funcional ciático a partir de medidas obtidas da impressão das patas traseiras durante a marcha. Após a exposição cirúrgica procedeu-se à avaliação eletrofisiológica que consistia na mensuração da latência, amplitude e velocidade de condução do potencial de ação do nervo e do potencial de ação motor. Com técnica microcirúrgica, os nervos foram seccionados e reparados de forma imediata. Três grupos com 10 animais cada foram formados de acordo com o reparo utilizado. No grupo A, o reparo foi realizado com a sutura utilizando-se quatro pontos de fio de náilon 10-0; no grupo B a coaptação dos cotos do nervo foi realizada com a aplicação do adesivo de fibrina; no grupo C o reparo foi realizado com um ponto de náilon 10-0 associado com a aplicação do adesivo de fibrina. Após 12 semanas o índice funcional ciático foi avaliado nos três grupos e a avaliação funcional da regeneração foi obtida comparando-se os valores deste índice. Após 24 semanas os animais foram reoperados para avaliação eletrofisiológica com as medidas dos mesmos parâmetros que foram avaliados antes da secção do nervo. A avaliação eletrofisiológica da regeneração comparou os valores da amplitude, latência e velocidade de condução dos potencias de ação do nervo e motor, os valores da razão entre a velocidade de condução na reoperação e a velocidade de condução antes da secção do nervo para os dois potenciais e a razão entre a amplitude na reoperação e a amplitude antes da secção dos nervos dos dois potenciais. Após esta avaliação, os nervos foram fixados e retirados para a obtenção de segmentos proximais e distais à região do reparo com a finalidade de se proceder ao estudo histomorfométrico com contagem total dos axônios regenerados, mensuração dos diâmetros desses axônios nesses segmentos e quantificação do número de axônios regenerados em situação extrafascicular no segmento distal. A análise estatística foi realizada através de comparação dos parâmetros obtidos entre os grupos com a análise de variância ou com o teste de Kruskal-Wallis. Quando era identificada uma diferença significativa entre os grupos, para p < 0,05, foi utilizado um teste de comparações múltiplas através do método de Tukey ou Duncan. Após 12 semanas do reparo os resultados do índice funcional ciático no grupo B foram superiores aos do grupo A. Não houve diferença significativa na avaliação desse parâmetro entre os grupos B e C. Os animais do grupo B apresentaram melhores resultados na regeneração em comparação com o grupo A quando avaliados a latência, a velocidade de condução após o período de observação e a razão entre a velocidade de condução realizada na reoperação e o mesmo parâmetro obtido antes da secção do nervo durante a mensuração do potencial de ação motor. Os animais do grupo C apresentaram melhores resultados na regeneração em comparação com o grupo A quando avaliada a razão entre a velocidade de condução realizada na reoperação e o mesmo parâmetro obtido antes da secção do nervo na mensuração do potencial de ação motor. Não houve diferença na regeneração avaliada pelo estudo eletrofisiológico entre os grupos B e C. Não houve diferenças significativas na avaliação histomorfométrica entre os três grupos. Considerando os resultados conclui-se que o reparo com o adesivo de fibrina forneceu as melhores condições para a regeneração em comparação com a sutura / Injuries involving nerves section require the surgeon to reestablish the continuity between the two stumps. Although direct suturing of the nerve using Nylon is considered a standard procedure, it can cause inflammatory reaction impairing the regeneration, or the procedure can be difficult due to reduced nerve caliber. The repair with fibrin glue is an alternative to the conventional suture technique, but comparison between these two techniques have presented conflicting results in the literature. The objective of this study was to compare the parameters commonly applied in assesssing the regeneration of the sectioned rat sciatic nerve, using conventional suture, fibrin glue and a combination of both techniques. Before sectioning the right sciatic nerve, the sciatic functional index of each rat was determined by measuring the printing of the posterior limbs during gait. After the surgical exposure, the electrophysiologic evaluation was performed. It consisted of measuring the latency, magnitude and conduction velocity of the nerve and muscular action potentials. Using the microsurgical techniques, the nerves were sectioned at middle and repaired immediately. Thirty rats were divided evenly into three groups accordingly to the nerve repair technique. In group A, the nerve was repaired with four-stitch suture using Nylon 10-0; in group B the stumps were united using fibrin glue; in group C, the nerve was repaired with a single-stitch suture using Nylon 10-0 and fibrin glue. After 12 weeks, the sciatic functional index of the three groups was evaluated. The functional evaluation of the nerve regeneration was obtained by comparing the sciatic functional index of the three groups. After 24 weeks, the rats underwent reoperation for electrophysiologic assessment based on the same parameters used before the nerve section. The electrophysiologic evaluation of the nerve regeneration consisted of comparing the results of the same parameters evaluated in the first surgery, the ratio between the conduction velocity of the action potential at the reoperation and the same velocity before the division of the nerve and the ratio between the magnitude of the action potential at the reoperation and before the nerve section. After electrophysiologic evaluation, the nerves were fixed and removed to obtain the proximal and the distal stumps for histomorphometric study. The histomorphometric study consisted of total count of regenerated axons, measurement of the regenerated axons diameter in both stumps, and the determination of the number of the regenerated axons in extrafascicular location in the distal stump. Statistical analysis was performed by comparing the parameters obtained from the three groups using ANOVA or the Kruskal-Wallis test. Whenever a significant difference between the groups was identified, with p<0.05, a multiple comparison test (Tukey or Duncan) was applied. With regards to the sciatic functional index 12 weeks after the repair, the rats of group B presented better outcome than those of group A. There was no significant difference between groups B and C. When latency and the nerve conduction velocity assessed at the reoperation, and the ratio between the conduction velocity at the reoperation and before the nerve division in the motor action potential evaluation were measured, the rats of group B presented better results in regeneration than those of group A. As for regeneration, with the motor action potential evaluation, rats of group C presented better results than those of group A when the ratio between the nerve conduction velocity at the reoperation and before the nerve division was considered. No difference between groups B and C was found in regeneration evaluated by means of electrophysiologic study. There were no significant differences in regard to the histomorphometric evaluation between the three groups. Based on the results, we conclude that nerve repair using fibrin glue provided the best conditions for regeneration than the suture

A subnutrição é um quadro caracterizado por escassez proteico-calórica e sua manifestação na República de Moçambique é responsável por um terço das mortes de crianças com idade inferior a 5 anos. É a responsável pela falha no crescimento nos primeiros anos de vida e no Brasil, até 2011, era considerada um problema grave de saúde pública. O objetivo deste trabalho foi investigar possíveis repercussões no tecido nervoso periférico de ratos Wistar subnutridos, comparando-os com aqueles que receberam a dieta padrão de Moçambique (baseada em proteína vegetal) e com aqueles que receberam nutrição balanceada. Para a realização deste estudo foram utilizados 15 ratos machos da linhagem Wistar e as técnicas utilizadas foram: Microscopia Eletrônica de Transmissão e Varredura, possibilitando a aquisição de dados quantitativos e qualitativos, utilizando ainda princípios estereológicos. Os resultados demonstraram alterações morfológicas nos grupos S e M, assim como diferenças quanto ao contorno das fibras nervosas e a disposição das camadas de mielina. Em relação ao peso e a ASTn, os três grupos são diferentes estatisticamente. Ao contrário, quanto à densidade de fibras nervosas mielínicas e ao número total estimado de fibras mielínicas, não houve diferença significante entre os grupos. Em relação à ASTax do nervo isquiático, houve significância entre os três grupos, já na análise da ASTbm e da ASTfm, houve diferença apenas entre os grupos S &ne; N, M &ne; N. Foi concluído, portanto que a subnutrição promoveu alterações morfológicas na estrutura do nervo isquiático e nas fibras nervosas mielínicas que podem ser irreparáveis, e numericamente gerou um mecanismo compensatório de aumento de densidade em relação a área do nervo, ou seja, um nervo de área menor, porém com fibras nervosas mais próximas, não havendo diferença na quantidade de fibras por nervo / Undernutrition is a condition characterized by protein-calorie shortage and its manifestation in the Republic of Mozambique is responsible for a third of deaths of children under the age of 5 years. It is responsible for growth failure early in life and in Brazil until 2011, was considered a serious public health problem. The objective of this study was to investigate possible effects on peripheral nerve tissue of Wistar rats undernourished, comparing them with those who received standard diet of Mozambique (based on vegetable protein) and those who received balanced nutrition. For this study were used 15 male rats of the Wistar and techniques used were: Transmission Electron Microscopy and Scanning, enabling acquisition of quantitative and qualitative data, using stereological principles. The results showed morphological changes in S and M groups as well as differences in the contour of nerve fibers and of the layers of myelin. In terms of weight and ASTn, the three groups are statistically different. Rather, density of myelinated nerve fibers and the estimated total number of myelinated fibers, not present significant difference between groups. Regarding ASTax sciatic nerve, there was significant difference between the three groups, and in the analysis of ASTms and ASTmf, there was difference only between the groups. It was concluded therefore that malnutrition promoted morphological changes in the sciatic nerve structure and myelin nerve fibers that may be irreparable, numerically generating a compensatory mechanism of density increase in relation to nerve area, in other words, a nerve smaller area but with next nerve fibers, with no difference in the number of nerve fibers by

Este trabalho teve como objetivo estudar as alterações microvasculares intraneurais agudas em nervo isquiático de rato submetido à esmagamento por diferentes cargas. Foram utilizados sessenta ratos machos da linhagem Wistar, distribuídos em dois grupos experimentais de acordo com o protocolo de injeção de vasos e subdivididos de acordo com a carga de esmagamento. Os nervos isquiáticos direitos de cada grupo experimental foram isolados e submetidos ao esmagamento com diferentes cargas (0,5 Kg, 1 Kg, 5 Kg, 10 kg e 15 kg) por 10 minutos e os nervos isquiáticos esquerdos foram utilizados como controle. Após o esmagamento, 30 animais foram submetidos ao Protocolo I, que constou de: cateterização da aorta abdominal, perfusão manual da solução composta de tinta da China e gelatina 5% em formol 10%, dissecação e retirada dos nervos direitos e esquerdos, desidratação e diafanização para análise longitudinal dos vasos intraneurais. Os outros trinta animais foram submetidos ao Protocolo II, que constou de: cateterização da aorta abdominal e perfundidos com solução composta de tinta da China e gelatina 5% em soro fisiológico e, após, mantidos em freezer -20°C por uma hora. Em seguida os nervos foram dissecados e retirados em toda a sua extensão, cortados em 3 fragmentos, congelados em isopentano em gelo seco e armazenados em freezer -70°C, seccionados em cortes transversais semi-seriados em criostato para análise e contagem dos vasos intraneurais. Os resultados mostraram regiões de hematoma endoneural e epineural nas diferentes cargas utilizadas indicando que as forças de esmagamento foram suficientes para lesar os vasos intraneurais do nervo isquiático, especialmente com cargas elevadas. A análise morfométrica mostrou um comportamento diferente nas três regiões estudadas, constatando menor número de vasos na região do esmagamento e não nas regiões acima e abaixo da mesma. Estes resultados sugerem lesão localizada dos vasos intraneurais que foi proporcional à carga de esmagamento, causando hematoma endoneural e epineural, o que criará um microambiente desfavorável para a regeneração das fibras nervosas que também foram lesadas nesse modelo. / The objective of this work was to study the acute intraneurial microvascular changes in the rat sciatic nerve submitted to a crush injury by different loads. Sixty Wistar male rats were used and distributed into two experimental groups according to vessel injection protocol and subdivided according to the crush load. The right sciatic nerves of each experimental group were isolated and submitted to crush by different loads (0,5 Kg, 1 Kg, 5 Kg, 10 kg and 15 kg) for ten minutes. The left sciatic nerves were used as controls. After the crush, thirty animals were submitted to Protocol I, which consisted of: abdominal aorta catheterization, manual perfusion withf a solution composed of China ink and gelatin 5% in formaldehyde 10%. After that the right and left nerves were collected, fixed in formaldehyde10%, dehydrated and diaphanized for longitudinal analysis of the intraneurial vessels. The other thirty animals were submitted to Protocol II, which consisted of: abdominal aorta catheterization, as described above and perfused with a solution of China ink and gelatin 5% in physiologic saline and then placed in a freezer at -20°C for one hour. After that the nerves were dissected and removed in their entire length, cut into three fragments, frozen in isopentane and dry ice and placed in a freezer at -70°C, cut in semi-serial histological transverse sections for analysis and intraneurial vessel quantification.The results showed endoneurial and epineurial haematoma areas in the different groups, indicating that the crush forces were enough to damage the intraneurial vessels, specially with high loads. The morphometrical analysis showed a different profile in the three fragments, with smaller number of vessels in the crush region then above and below, suggesting that the damage to intraneurial vessels was proportional to the crush load, causing endoneurial and epineurial haematoma, which creates an unfavorable microenvironment for the regeneration of the nerve fibers that were also damaged in that model.

Os nervos periféricos são extensões do sistema nervoso central e responsáveis pela interação das atividades das extremidades, em suas funções sensitiva e motora. São vulneráveis aos mesmos tipos de traumas que afetam outros tecidos: contusão, compressão, esmagamento, estiramento, avulsão e laceração. Desta forma, a interrupção de continuidade da estrutura do nervo, por algum tipo de trauma, resulta na interrupção de transmissão dos impulsos nervosos e na desorganização de suas atividades funcionais. Para tanto, em vista da evolução tecnológica e o desenvolvimento de equipamentos mais sofisticados, a microcirurgia vem ganhando cada vez mais espaço no campo da investigação experimental referente a recuperação de nervos periféricos lesionados. Em uma secção simples, sem perda tecidual, a neurorrafia denominada término-terminal apresenta bons resultados, contudo, quando ocorre perda de tecido nervoso ou, não se têm mais os cotos distais do nervo, outras técnicas devem ser empregadas, até porque, não se pode de modo algum tencionar o nervo numa tentativa de coaptá-lo novamente. Várias técnicas de tubulização utilizando-se materiais biológicos e não biológicos, para criar um meio por onde ocorrerá a regeneração nervosa já foram ou ainda estão sendo testados com resultados insatisfatórios sob o aspecto funcional.É sabido que em um trauma sem perda tecidual, numa neuropraxia, por exemplo, o nervo recupera espontaneamente de forma satisfatória. É sabido também que em um feixe vásculo-nervoso, o nervo periférico encontra-se em íntimo contato com a adventícia de artérias e veias. A adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidimos testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto com tubo de polietileno preenchido por tecido adiposo autólogo. Para tanto será utilizado um tubo com 12 mm de comprimento por 0,25 mm de diâmetro, com poros de 80 µm de diâmetro, preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências do referido nervo, na tentativa de se recuperar o nervo isquiático. A certificação do sucesso da recuperação do nervo será feita por meio de técnicas de microcirurgia, microscopia e morfometria. O enxerto de polietileno mostrou ter resistência a pressões, uma vez que não foi observado colapso estrutural. A gordura mostrou ser bom material trófico já que no grupo onde a utilizou apresentou resultados mais próximos do controle final. / Peripheral nerves are extensions of the central nervous system and are responsible for the interaction of the activities of the extremities in their sensory and motor function. They are vulnerable to these types of injuries that affect other tissues: contusion, compression, crush, stretch, tear and avulsion. Thus, the interruption of continuity of the nerve structure, due to some sort of trauma, results in the interruption of transmission of nerve impulses and disruption of their functional activities. Therefore, in view of technological evolution and development of more sophisticated equipment, microsurgery is gaining more space in the field of experimental research concerning the recovery of injured peripheral nerves. In a single section, without loss of tissue, called the end-terminal neurorrhaphy was also good, however, when there is loss of nervous tissue or, if not longer have the distal nerve stumps, other techniques must be employed, because, in any circumstance the nerve should be tensioned as an attempt to coaptation again. Several techniques of tubing, using biological materials and non-biological means to create a place where nerve regeneration have been or are still being tested with unsatisfactory results in the functional aspect. It is known that in a trauma without loss of tissue, a neuropraxia, for example, the nerve recovers spontaneously and satisfactorily. It is also known that in a neurovascular bundle, the peripheral nerve is in close contact with the adventitia of arteries and veins. The adventitia of the vessels is composed of loose connective tissue rich in adipocytes. Thus, in trauma, the neurites from the proximal stump of injured nerve, are directly in contact with these adipocytes. Following this reasoning, and based on previous work where it was used vein filled with fresh skeletal muscle as a graft, decided to test the possibility of axonal growth by grafting polyethylene tube filled with autologous adipose tissue. For that will be used with a tube 12 mm long and 0.25 mm in diameter, with pores of 80 microns in diameter, filled with fresh adipose tissue removed from the vicinity of that nerve, in an attempt to recover the sciatic nerve. Certification of successful nerve recovery will be done through microsurgical techniques, microscopy and morphometry. The graft polyethylene proved to have pressure resistance, since no structural collapse was observed. The fat was found to be good material as trophic group which had used the results closer to the ultimate control.

INTRODUÇÃO: Embora a população diabética seja extremamente significativa e crescente nos últimos anos, os estudos envolvendo regeneração nervosa e diabetes mellitus (DM) não são muitos e, frequentemente, mostram resultados conflitantes e pouco conclusivos. O objetivo deste trabalho foi estudar a regeneração nervosa em ratos diabéticos. MÉTODOS: O trabalho foi realizado no Laboratório de Microcirurgia Experimental (LIM 4) do HC-FMUSP. Utilizaram-se 40 ratos machos, que foram separados em 2 grupos principais, cada um com 20 animais: grupo controle e grupo diabetes. Cada grupo foi subdividido em 2 subgrupos de 10 animais: controle com neurorrafia término-terminal (CN), controle com enxerto de nervo (CE), diabético com neurorrafia términoterminal (DN) e diabético com enxerto de nervo (DE). A indução do DM foi feita pela inoculação de estreptozotocina na dose de 60mg/Kg, por via intraperitoneal e após 8 semanas os animais foram submetidos à cirurgia. Diversas avaliações foram feitas: massa corporal, glicemias, testes da marcha e eletrofisiológico, índice de peso do músculo tríceps sural (pata operada/não operada) e análises histomorfométricas. RESULTADOS: Ocorreram 3 óbitos, 1 no CN, 1 no DN e 1 no DE. Nas avaliações pósoperatórias o peso dos animais do grupo controle foi maior que o do grupo diabetes (p<0,05). Todos os ratos do grupo diabetes mostraram níveis glicêmicos bem superiores aos do grupo controle (p<0,05), mantendo-se sempre maiores que 200mg/dL. No 20o PO o teste da marcha foi mais próximo do normal nos animais do grupo controle do que no grupo diabetes (p<0,05), sendo melhor nos subgrupos com neurorrafia do que com enxerto de nervo (p<0,05). No 40o PO o panorama se manteve, exceto pela comparação do DN com o DE (p>0,05). Já no 60o PO o teste foi semelhante entre os animais do grupo controle (CN e CE) e o DN (p>0,05), se mostrando pior no DE (p<0,05). No teste eletrofisiológico com 60 dias de evolução, as amplitudes do potencial evocado foram semelhantes entre os subgrupos controles e diabéticos (p>0,05). O índice de peso do músculo tríceps sural foi maior no CN em comparação com os outros 3 subgrupos (p<0,05), não se verificando o mesmo nas demais comparações (p>0,05). No 60o PO não se encontraram diferenças estatisticamente significativas na comparação dos subgrupos controles e diabéticos em relação à densidade axonal, medidas das áreas das secções transversas das fibras nervosas, dos axônios e das células de Schwann. CONCLUSÕES: O teste da marcha mostrou que a recuperação funcional foi mais rápida nos animais do grupo controle, porém, com 60 dias, o DN apresentava uma recuperação semelhante aos animais controles, ao passo que o DE ainda não. A resposta da musculatura tríceps sural ao estímulo do nervo ciático com 60 dias de evolução, verificada no teste eletrofisiológico, se mostrou parecida nos animais controles e diabéticos, não havendo diferença estatística. A atrofia muscular, vista pelo índice de peso do músculo tríceps sural, foi menor em CN, porém sem diferença estatística entre CE, DN e DE. A densidade de axônios, assim como os calibres das fibras nervosas e dos axônios não foram estatisticamente diferentes nos animais diabéticos no 60o PO / INTRODUCTION: Although the diabetic population is highly significant and has been growing during the past few years, studies involving nerve regeneration and diabetes mellitus (DM) are rather uncommon, frequently demonstrating divergent results and few conclusions. The objective of this study is to evaluate nerve regeneration in diabetic rats. METHODS: The study was accomplished in the Experimental Microsurgery Laboratory (LIM 4) of the HC-FMUSP. The study included 40 male rats, separated into two main groups: 20 controls and 20 diabetic animals. Each group was then further subdivided into two subgroups with 10 animals in each: control with end-toend neurorrhaphy (CN); control with nerve graft (CE); diabetic with end-toend neurorrhaphy (DN); and diabetic with nerve graft (DE). DM was accomplished by intraperitoneal innoculation of 60mg/Kg of streptozocin and the animals underwent surgery eight weeks later. Various evaluations were performed: body mass, glycemias, walking and electrophysiology tests, triceps surae muscle weight index (operated/non-operated paw) and histomorphometric analysis. RESULTS: Three deaths occurred; one in CN, one in DN, and one in DE. In the postoperative evaluations the weight of the control animals was greater than that of the diabetic group (p<0.05). All the rats in the diabetic group demonstrated glycemic levels very superior to those of the control group (p<0.05), always remaining over 200mg/dL. On the 20th PO day, the walking test was closer to normal in the control group than in the diabetic one (p<0.05), better in the neurorrhaphy subgroups than in the nerve graft ones (p<0.05). On the 40th PO day the range was maintained, except for comparison of DN with DE (p>0.05). Already on the 60th PO day, the test was similar among the animals of control group (CN and CE) and DN (p>0.05), seeming worse on DE (p<0.05). At 60 days the potential amplitudes of the electrophysiological test were similar among the control and diabetic subgroups (p>0.05). Triceps surae muscle weight index was greater in the CN compared with the other three subgroups (p<0.05), which was not seen in the other comparisons (p>0.05). On the 60th PO day no statistically significant differences were observed when comparing the control and the diabetic subgroups regarding the axonal density, measurent of the areas of the transverse sections of the nerve fibers, axons and Schwann cells. CONCLUSIONS: The walking test showed that the functional recovery was swifter in the control group animals. At 60 days, however, DN presented a recovery similar to that of the control animals, whereas DE still did not. Triceps surae muscle response upon stimulation of the sciatic nerve at 60 days, verified by the electrophysiological test, showed it to be similar in the control and diabetic animals, without a statistical difference. The muscular atrophy observed by the triceps surae muscle weight index was less in CN, however, without a statistical difference among CE, DN and DE. The axon densities as well as the calibers of the nerve fibers and axons were not statistically different in the diabetic animals at 60 days PO

Peripheral nerve damage affects hundreds of thousands of people every year. This study tested the effectiveness of using lysophosphatidylcholine (LPC) in combination with nerve growth factor (NGF) to increase the healing rate of damaged left sciatic nerves in female rats. The rats were randomly divided into eight groups: Sham, Right Sciatic, Crush, LPC, LPC-NGF, Crush- LPC, Crush-NGF, and Crush-LPC-NGF. The healing of the nerves was measured by monitoring gait, electrophysiological parameters (compound muscle action potential amplitudes and nerve conductance velocities) and morphological parameters (total fascicular area, total myelinated fiber counts, fiber densities, fiber diameters, and g-ratio). Gait and electrophysiological parameters were measured three times a week. Morphological parameters were measured at three weeks and at six weeks. The LPC and LPC-NGF groups were not statistically different from the controls (Sham and Right Sciatic) at either of the morphological time points but were statistically different from the controls for the first three weeks for the electrophysiological parameters and gait. The LPC-NGF group did not differ from the LPC group at any time point for any of the parameters. Crush, Crush-LPC, Crush-NGF, and Crush-LPC-NGF groups statistically differed from the controls at week 3 for all parameters and only in the electrophysiological parameters at week 6. Crush-LPC, Crush-NGF, and Crush-LPC-NGF did not differ from each other or from the Crush group. The combination of LPC and NGF did not prove to be an effective treatment for peripheral nerve damage. Future work is recommended to test multiple injections of LPC and NGF.