La douleur neuropathique est fréquente, invalidante et souvent difficile à traiter avec les médicaments dont nous disposons actuellement. Une meilleure compréhension de la physiopathologie de ces douleurs et le développement de nouvelles thérapeutiques sont nécessaires. La stimulation magnétique transcrânienne (TMS) est une technique permettant d’évaluer l’excitabilité corticale et de moduler la douleur et pourrait ainsi constituer une piste intéressante. La sclérose en plaques (SEP) engendre fréquemment des douleurs neuropathiques et constitue la pathologie sur laquelle s’est focalisé ce travail. L’objectif de ce dernier était tout d’abord de définir précisément les caractéristiques des douleurs dans la SEP, ensuite de tester chez des sujets sains de nouvelles fréquences de TMS répétitives (rTMS) pour tenter d’améliorer et de mieux comprendre les effets antalgiques de cette technique et enfin, de réaliser une étude thérapeutique de l’effet de la rTMS chez des patients présentant des douleurs neuropathiques centrales en rapport avec une SEP. Durant la première partie de ce travail, nous avons conduit une enquête postale adressée à 1300 patients SEP qui a permis de montrer que 51% des patients présentaient des douleurs aux caractéristiques neuropathiques, 46% des migraines et que ces deux symptômes n’étaient pas indépendants mais semblaient médiés par des mécanismes distincts. La seconde partie de ce travail a débuté par une revue de la littérature concernant les mécanismes d’action de la rTMS utilisée à visée antalgique. Nous avons ensuite réalisé une étude impliquant 14 sujets sains, qui a permis de montrer qu’une nouvelle fréquence de rTMS, la stimulation theta burst prolongée continue (pcTBS), permettait d’obtenir une antalgie au froid plus importante que la rTMS classique à 10Hz après stimulation du cortex moteur primaire (M1) gauche. Chez ces sujets sains, l’effet antalgique n’était pas lié à une modulation de l’excitabilité du cortex moteur primaire ou à une majoration de la modulation de la douleur induite par une stimulation conditionnante. La dernière partie du travail est en cours. Elle correspond à un essai contrôlé, randomisé, en double aveugle, impliquant 3 groupes parallèles (rTMS à 10Hz, pcTBS et rTMS placebo ciblant le M1 gauche). Soixante-six patients SEP présentant des douleurs neuropathiques réfractaires seront inclus (22 par groupe). Ils bénéficieront d’une séance de rTMS par jour durant cinq jours consécutifs et seront suivis durant un mois. Le critère principal de jugement porte sur la variation de la douleur entre la semaine précédant les rTMS et le huitième jour après la première rTMS. Des objectifs secondaires physiopathologiques (imagerie et excitabilité corticale) impliquent l’inclusion de 40 patients SEP ne présentant pas de douleur (STIMASEP, NCT02059096). / Neuropathic pain is common, debilitating and often difficult to treat with the drugs we currently have. A better understanding of the pathophysiology of these pains and the development of new therapeutics are needed. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique for evaluating cortical excitability and modulating pain, and could be an interesting avenue. Multiple sclerosis (MS) frequently causes neuropathic pain and is the pathology on which this work has focused. The aim of the latter was first of all to precisely define the characteristics of pain in MS, then to test in healthy subjects new frequencies of repetitive TMS (rTMS) in an attempt to improve and better understand the analgesic effects of this technique and finally, to perform a therapeutic study of the effect of rTMS in patients with central neuropathic pain related to MS.During the first part of this work, we conducted a postal survey addressed to 1300 MS patients, which showed that 51% of patients had pain with neuropathic features, 46% of migraine headaches and that these two symptoms were not independent. but seemed to be mediated by distinct mechanisms.The second part of this work started with a review of the literature concerning the mechanisms of action of rTMS used for analgesic purposes. We then conducted a study involving 14 healthy subjects, which showed that a new frequency of rTMS, prolonged continuous theta-burst stimulation (pcTBS), made it possible to obtain a more important cold-pain treatment than the conventional 10 Hz rTMS. after stimulation of the left primary motor cortex (M1). In these healthy subjects, the analgesic effect was not related to a modulation of the excitability of the primary motor cortex or to an increase in the modulation of pain induced by conditioning stimulation.The last part of the work is in progress. It consists of a randomized, double-blind controlled trial involving 3 parallel groups (10 Hz rTMS, pcTBS and placebo rTMS targeting the left M1). Sixty-six MS patients with refractory neuropathic pain will be included (22 per group). They will receive one rTMS session per day for five consecutive days and will be followed for one month. The primary endpoint is variation in pain between the week prior to rTMS and the eighth day after the first rTMS. Secondary physiopathological objectives (imaging and cortical excitability) imply the inclusion of 40 MS patients presenting no pain (STIMASEP, NCT02059096).

Les maladies auto-immunes résultent d’un dysfonctionnement du système immunitaire. L’étiologie de la pathologie reste souvent inconnue, compliquant la conception de traitements adaptés. Ce projet de thèse s’est focalisé sur la molécule « a proliferation inducing ligand » (APRIL), facteur de survie des plasmocytes (PC) produisant les anticorps, dans l’hépatite auto-immune (HAI) et la sclérose en plaques (SEP). Dans l’HAI, une principale caractéristique histologique est la présence d’un infiltrat lymphoplasmocytaire formant une hépatite d’interface dommageable. Dans cette maladie, nous avons d’abord pu mettre en évidence une corrélation positive entre l’expression d’APRIL et l’infiltration des PC dans les espaces portes. In vitro, nous avons observé une survie augmentée des PC du foie en présence d’APRIL. La corticothérapie communément prise par les patients HAI ne cible pas directement les PC. Cependant, nous avons remarqué une réduction simultanée de la densité de PC et de l’expression d’APRIL. Ainsi, cette étude étend le rôle de facteur de survie d’APRIL aux PC du foie dans l’HAI. Les rechutes sont fréquentes après arrêt du traitement, nous indiquant que les cellules pathogènes sont épargnées par la thérapie. Nos résultats montrent que le ciblage d’APRIL pourrait être précieux dans l’HAI. Propre de son rôle sur les PC, APRIL a été ciblée avec succès dans plusieurs maladies auto-immunes. Outre ces succès, un essai clinique visant à bloquer APRIL dans la SEP à malheureusement conduit à une exacerbation inattendue de la maladie. Nous avons été capables de montrer qu’APRIL cible un nouveau type cellulaire dans le système nerveux central, les astrocytes. La fixation d’APRIL à la surface des astrocytes dépend d’un nouveau partenaire de liaison, exprimé par ces derniers, les chondroïtines sulfates protéoglycans. Cette interaction induit la production de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, conduisant à l’inhibition de, la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. L’utilisation de souris déficientes pour APRIL dans le modèle standard de la SEP nous a permis de confirmer le rôle neuro-protecteur d’APRIL. Finalement, après injection d’APRIL recombinante dans ce modèle murin, une réduction de la sévérité de la maladie a été observée. Globalement, nous avons identifié APRIL comme une molécule à double rôle dans les maladies auto-immunes. / Autoimmune diseases result from a dysfunction of the immune system. The disease etiology is often unknown, complicating the design of appropriate treatments. This thesis project focused on the molecule “a proliferation inducing ligand” (APRIL), a survival factor for antibody-producing plasma cells (PC), in autoimmune hepatitis (AIH) and multiple sclerosis (MS). In AIH, one main histological feature is the presence of a lymphoplasmacytic infiltration forming a damaging interface hepatitis. In this disease, we first noticed a positive correlation between APRIL expression and PC infiltration in portal spaces. In vitro, we further observed an extended survival of liver PC in the presence of APRIL. The corticosteroid therapy commonly applied to AIH patients does not directly target PC. However, we noticed a concomitant reduction in portal PC density and APRIL expression. Hence, this study is extending the survival role of APRIL to liver PC in AIH. Relapses are frequent after treatment withdrawal, telling us that pathogenic cells are spared by the therapy. Our results indicate that APRIL targeting might also be valuable in AIH. Own to its role on PC, APRIL has been successfully targeted in several autoimmune diseases. Besides successes, a clinical trial aiming at APRIL blockade in MS has unfortunately led to an unexpected disease exacerbation. We have been able to show that APRIL targets a new cell type in the central nervous system, the astrocyte. The APRIL binding to astrocyte surface depends on a new binding partner, expressed by the latter, the chondroitin sulfate proteoglycans. This binding induces the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10, leading to the inhibition of, self-reactive T-cell proliferation and pro-inflammatory cytokine secretion. Use of APRIL-deficient mice in the standard model of MS allowed us to confirm the neuroprotective role of APRIL. Finally, after recombinant APRIL injection in this model, a lowered disease severity was observed. Overall, we identified APRIL as a dual role molecule in autoimmune diseases.

La sclérose en plaques (SEP) est largement acceptée comme étant une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) dirigée par les cellules T auto-réactives. Cette maladie est très répandue au Canada. L'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal le plus utilisé pour l’étude de la SEP. Malgré l’importance des cellules T dans cette pathologie, il est important de souligner que ce sont les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) myéloïdes, et surtout les cellules dendritiques (CD), qui amorcent l’activation des cellules T auto-réactives dans les organes lymphoïdes secondaires ainsi que leur éventuelle réactivation dans le compartiment du SNC plus tard au cours de la maladie. Cependant, il existe une disparité dans l'identification des différentes sous-populations de CPA myéloïdes en raison de l'absence de marqueurs fiables et spécifiques, ce qui constitue une entrave dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire. Par ailleurs, les mécanismes moléculaires responsables de la régulation du recrutement des CPA myéloïdes au niveau de la vasculature cérébrale suite à l'activation de l'endothélium du SNC sont encore mal connus. L'interleukine-6 (IL-6) est une cytokine pro-inflammatoire essentielle à la différenciation des lymphocytes TH17 auto-réactifs. Ces derniers sont des régulateurs clés de l'EAE et jouent un rôle important dans la SEP. Ainsi, le premier objectif de ma thèse était de démontrer que l'IL-6 joue un second rôle dans l'EAE en stimulant l'endothélium du SNC à exprimer les molécules nécessaires au recrutement des CPA myéloïdes. Nous démontrons que : (1) les cellules endothéliales du SNC expriment le récepteur de l’IL-6 (IL-6R) ; (2) l’ablation génétique de l’IL-6R spécifiquement dans l'endothélium atténue le recrutement des neutrophiles, des macrophages et des CDs, et prévient le développement de l'EAE ; et (3) l'IL-6 stimule les cellules endothéliales à produire CXCL1 et PTGS2, des protéines impliquées dans le recrutement et l'activation des cellules myéloïdes. Le deuxième objectif général de mon étude était d'obtenir une vue d'ensemble phénotypique et fonctionnelle des sous-populations de CD présentes pendant la phase initiale d'induction de l'EAE. À cette fin, nous avons utilisé la technologie de séquençage de l'ARN unicellulaire (scRNAseq) pour comparer la signature transcriptionnelle des cellules CD11c+ issues des nœuds lymphatiques au cours de la phase préclinique de l'EAE. Nous montrons que : (1) quatre grandes sous-populations de CD sont présentes, soit les CD115+ monocytaires (mDC), les SiglecH+ plasmacytoïdes (pDC), les XCR1+ conventionnelles de type 1 (cDC1) et les CCR7+ conventionnelles de type 2 (cDC2) ; (2) les cDC2, une sous-population spécifique de CPA, présentent des niveaux transcriptonnels élevés de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-12) et de marqueurs de maturation et de co-stimulation pour la présentation des antigènes (CD80, CD83, CD86, OX40L) ; (3) miR155, un microARN connu pour son rôle dans l'EAE, est principalement exprimé dans les cDC2 ; et (4) que l'enzyme D-aminoacide oxydase (Dao), qui produit du peroxyde d'hydrogène (H2O2) à partir d’acides aminés D, est régulée à la hausse dans les cDC2 des souris miR155-/- . En résumé, mon travail de thèse met l'accent sur le rôle critique des CPA myéloïdes lors des premiers événements précliniques de l'EAE et il suggère un nouveau rôle important de la signalisation classique de l'IL-6 dans le développement de l'EAE et le recrutement des leucocytes. Finalement, il identifie en outre des cibles et des biomarqueurs potentiels à des fins diagnostiques et thérapeutiques. / Multiple sclerosis (MS) is widely accepted as an autoreactive T cells driven autoimmune disorder of the central nervous system (CNS), highly prevalent in Canada. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the established animal model for studying MS. Antigen-presenting cells (APCs) of myeloid origin, most importantly, dendritic cells initiate the priming of autoreactive T cells in the secondary lymphoid organs, and their eventual reactivation in the CNS compartment later in the disease course. However, a disparity exists in identifying myeloid APCs subsets with accuracy due to absence of reliable and specific markers, causing a hindrance in the field of cellbased immunotherapy. In addition, more needs to be deciphered on the molecular mechanisms that regulate activation of CNS endothelium for recruitment of myeloid APCs. Interleukin-6 (IL-6) is a pro-inflammatory cytokine, essential for differentiation of self-reactive TH17 lymphocytes, which are key regulators of EAE and play an important role in MS. The first objective of my thesis was to demonstrate that IL-6 plays another role in EAE by stimulating the CNS endothelium to express molecules required for the recruitment of myeloid antigen-presenting cells. We show that: (1) endothelial cells in the CNS express IL-6 receptor (IL-6R); (2) genetic deletion of IL-6R specifically in the endothelium blocks neutrophils, macrophages and dendritic cells recruitment as well as EAE development; (3) ICAM1-expressing extravascular myeloid APCs are reduced in number during the pre-onset stage of EAE; and (4) IL-6 stimulates endothelial cells to produce CXCL1 and PTGS2, which are involved in recruitment and activation of myeloid cells. The second general objective of my study was to get a phenotypic and functional overview of DC subsets present during the initial induction phase of EAE. For that purpose, we used the single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology to compare the transcriptional signature of CD11c+ cells from lymph nodes during the pre-clinical phase of EAE. We show that: (1) four major subsets of DCs are present: CD115+ monocytic DC (mDC), SiglecH+ plasmacytoid DC (pDC), XCR1+ conventional DCs type-1 (cDC1) and CCR7+ conventional DCs type-2 (cDC2); (2) cDC2 exhibit elevated expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12), maturation marker (CD83) and costimulatory molecules for antigen presentation (CD80, CD86, OX40L); (3) miR155, a microRNA known to have a role in EAE, is predominantly expressed in cDC2; (4) the enzyme D-amino acid oxidase (Dao), that produces hydrogen peroxide (H2O2) from D-amino acids, is upregulated in cDC2 of miR155-/- mice. In summary, my thesis work emphasizes on the critical role of myeloid APCs during initial pre-clinical events of EAE. Moreover, it suggests additional important role of classical IL-6 signaling in EAE development and leukocyte recruitment. It further identifies potential targets and biomarkers for diagnostics and therapeutic purposes.

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central qui touche beaucoup de jeunes adultes dans le monde entier. Malgré les efforts de recherche, la cause demeure inconnue. Afin de développer de meilleurs traitements et de trouver un remède, les modèles animaux sont utilisés pour identifier des biomarqueurs cellulaires. La caractérisation de ces modèles est essentielle afin de bien transposer les résultats à la maladie humaine et de tester de nouveaux médicaments. Cette thèse est le résultat d'un projet de maîtrise au Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec (CRIUSMQ) qui visait à étudier la barrière hématoencéphalique en tant que biomarqueur possible chez un modèle animal de la sclérose en plaques. Le chapitre 1 présente les différents thèmes abordés dans ce projet. Les chapitres 2, 3 et 4 se concentrent sur les méthodes choisies, tandis que le chapitre 5 présente les résultats obtenus. / Multiple sclerosis is an inflammatory disease of the central nervous system that affects many young adults worldwide. Despite research efforts, the cause of the disease remains unknown. In order to develop better therapies and ultimately find a cure, animal models are used to identify cellular biomarkers. Characterizing these models is essential in order to properly relate findings to the human disease and test possible medications. This thesis is the result of a three-year Master's project at Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec (CRIUSMQ) that aimed to study the blood-brain barrier as a possible biomarker of disease pathology in a multiple sclerosis animal model. Chapter 1 introduces the different themes addressed in this project. Chapters 2, 3 and 4 focus on the materials and methods chosen, while chapter 5 presents the results obtained. These findings are discussed in chapter 6.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / La rupture de la barrière hémoencéphalique (BHE) ainsi que l’infiltration cellulaire sont des évènements pathophysiologiques caractéristiques de la sclérose en plaques et de son modèle animal, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Cependant, leur relation avec l’évolution de l’EAE est obscure, notamment car les préparations histologiques standards recquièrent le sacrifice des animaux et nous privent d’informations cruciales quant à l’initiation, au développement et à la progression de la maladie. Nous utilisons le modèle EAE chez la lignée de souris lys-GFP ki, chez laquelle les cellules myéloïdes (i.e. neutrophiles et monocytes) expriment eGFP. De l’imagerie intravitale est effectuée à des moments précis, ce qui permet l’étude de l’infiltration cellulaire en plus de l’évaluation de l’intégrité de la barrière hémo-encéphalique (BHE) au cours de la pathologie. Les séances d’imagerie non-terminales offrent un contexte temporel considérable, puisqu’il est possible de suivre le développement de la maladie chez un animal qui a été précédemment imagé. La première étape a donc consisté à établir que la chirurgie et la séance d’imagerie n’avaient aucune influence sur le développement de l’EAE chez les animaux expérimentaux. Les résultats obtenus à l’aide d’imagerie intravitale tendent à démontrer qu’un affaiblissement de la BHE envers les molécules de petite taille (760 Da) est corrélé à l’infiltration de cellules GFP-positive dans la moelle épinière. Il est d’autant plus intéressant de constater que cette invasion cellulaire arrive en même temps que l’apparition des symptômes cliniques chez les animaux atteints d’EAE. Nous avançons l’hypothèse que les neutrophiles sont les cellules myéloïdes responsables de brèches initiales dans la BHE, qui influençent son intégrité aux stades précoces de la maladie. Des expériences de déplétion envers les neutrophiles ont donc été effectuées chez des animaux EAE afin de confirmer notre hypothèse. Les résultats suggèrent que les neutrophiles influencent l’initiation de la maladie et sa sévérité totale, en plus d’être intimement liés à l’état de la BHE tôt dans la pathologie. / Blood-spinal cord barrier (BSCB) disruption and immune cell infiltration are early pathophysiological hallmarks of multiple sclerosis (MS) and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Their relationship with the course of EAE remains unclear, however, notably because histological tissue preparations involve sacrifice and inherently result in the loss of crucial information regarding the initiation or development and progression of the disease. We use the EAE model in the lys-GFP ki mouse strain, in which blood-borne myeloid cells (i.e. neutrophils and monocytes) express eGFP. Intravital two-photon microscopy is performed at selected time points, enabling the investigation of cellular infiltration together with the assessment of the blood- barrier (BBB) integrity over the course of the pathology. Non-terminal imaging sessions offer extensive temporal context as it is possible to follow the development of the disease in an animal which has been previously imaged. One can appreciate the advantage of such a method as it is possible to relate, in the same animal, previous observations with clinical outcome. The first step thus consisted in establishing that the surgery and imaging session did not affect the development of EAE in experimental animals. Results obtained demonstrate that the permeability of the BBB to small molecular tracers (760 Da) correlates with the infiltration of GFP-positive myeloid cells into the spinal cord parenchyma. Interestingly, this cellular invasion is reminiscent of the appearance of clinical symptoms displayed by EAE animals. We put forward the hypothesis that neutrophils are the myeloid cells responsible for initial breaches in the BBB, influencing the latter’s integrity at early stages of the disease. Neutrophil depletion experiments have thus been performed in EAE mice in order to confirm this hypothesis. Results suggest that neutrophils influence the initiation and total severity of the disease, as well as being intimately linked to the status of the BBB early in the pathology.

La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC), maladie au cours de laquelle les cellules T endommagent la myéline. Les cellules T CD4⁺ jouent un rôle fondamental dans cette pathologie. Le modèle animal d'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE) permet de reproduire les symptômes cliniques de la SEP chez la souris. Bien qu'une grande variété de cellules issues des systèmes immunitaires inné et adaptatif peuvent être impliquées dans la réponse inflammatoire du SNC, les cellules T CD4⁺ sont reconnues comme étant des intervenants importants dans l'initiation et la progression des cellules T vers l'autoréactivité. Dans notre laboratoire, nous travaillons avec la souris 1C6 qui est une souris transgénique pour le récepteur des cellules T (TCR). Cette souris génère des cellules T CD4⁺ et CD8⁺ avec la capacité de reconnaître le peptide MOG[₃₅₋₅₅]. Le développement de cette souris transgénique est un outil inestimable pour l'étude des rôles pathogéniques des différents sous-types de cellules T dans l'EAE. Toutefois, il est possible d'observer que l'exclusion allélique de la chaine α du TCR est incomplète par l'expression de TCR endogène toujours présent dans les souris 1C6. Afin d'obtenir des populations de cellules transgéniques pures, les souris 1C6 ont été croisées avec les souris déficientes en RAG-1. Les gènes RAG-1 et RAG-2 codent ensemble pour former un complexe responsable de la recombinaison V(D)J. Une altération fonctionnelle d'un seul des deux gènes permettraient d'éliminer l'expression endogène du TCR. Le rôle de l'inclusion allélique dans l'élaboration du répertoire de TCR chez la souris 1C6 n'est pas clair. Dans la première partie de ma thèse, j'ai démontré que l'inclusion allélique est cruciale dans la suppression de l'auto-immunité sévère du SNC chez les souris 1C6. J'ai utilisé des souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] dérivées de croisements entre souris 1C6 et NOD Rag1[exposant -/-]. Cette lignée de souris ne permet pas la réorganisation des chaînes TCR α et β endogènes en raison de l'absence de RAG-1. Les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] possèdent moins de cellules T CD4⁺ , CD8⁺ et nous avons démontré que les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] développent une EAE spontanée contrairement aux souris 1C6 x Rag1[exposant +/+]. De plus, les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] présentent une EAE fatale suivant leur immunisation avec le peptide dérivé de la glycoprotéine oligodendrocyte de myéline MOG[₃₅₋₅₅] et ce, malgré l'absence de lymphocytes T CD8⁺ en provenance de la rate . Nos résultats démontrent un rôle essentiel du réarrangement des chaines de TCR dans le contrôle de la survie des cellules T ainsi que dans la sensibilité des souris 1C6 face à la maladie. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai investigué le rôle du complexe Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) dans les cellules Th1 et Th17, deux sous-types de cellules T CD4⁺. ERAD est un système de contrôle qualité des protéines situé dans le réticulum endoplasmique (ER). Il permet de sélectivement éliminer les protéines mal repliées ou mal assemblées en les dirigeant vers le cytosol où elles sont dégradées par le système ubiquitine-protéasome (UPS). Sec61 joue un rôle important dans l'importation des protéines nouvellement synthétisées au niveau du ER tandis que le translocon p97 est crucial pour le transport rétrograde des protéines endommagées vers le cytosol. Bien que les rôles de Sec61 et de p97 aient largement été étudiés dans les maladies neurodégénératives et le cancer, leurs fonctions dans les maladies auto-immunes et dans la fonction des cellules T ne sont pas bien comprises. Des études ont démontré que le blocage de Sec61 avec la mycolactone a des effets inhibiteurs immédiats sur la production de cytokines par les cellules immunitaires. Par contre, l'utilisation de l'inhibiteur de Sec61 et la suppression des cytokines dans la SEP sont peu étudiés. Notre objectif est de vérifier les effets d'inhibiteurs de Sec61 et de p97 sur différents sous-types de cellules T. Dans cette étude, nous avons utilisé trois différents inhibiteurs : (1) Eeyarestatin I (ErsI) : inhibiteur de Sec6 et de p97 (2) NMS-873 : inhibiteur spécifique de p97 (3) Apratoxin A : inhibiteur spécifique de Sec61. En vérifiant les effets de ces molécules sur les cellules Th1 et Th17, nous avons observé une suppression substantielle des cytokines pro-inflammatoires dans les deux types de cellules. Elles diminuent également les niveaux de protéines de Stat-1 et de Stat-3, des facteurs des transcription impliqués dans la différenciation des cellules Th1 et Th17, respectivement. Nous avons aussi observé que l'administration du NMS-873 chez les souris C57BL6/J réduit la sévérité de l'EAE. Dans nos travaux futurs, nous explorerons le mécanisme par lequel ces inhibiteurs régulent la signalisation des lymphocytes T. Nous travaux présentent de nouvelles molécules et voies de signalisation d'intérêt pour la découverte de nouveaux traitements de la SEP en ciblant les cellules T CD4⁺. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of CNS in which T cells direct an attack against myelin. CD4⁺ T cells plays a central role in pathogenesis of MS. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of MS that recapitulates many of the immune aspects of its pathogenesis. Although various cell types of the innate and adaptive immune system may be responsible for the inflammatory response within the CNS, CD4⁺ T cells are considered as a critical contributor in the initiation and progression of autoreactive T cells. In our lab we used a 1C6 T cell receptor (TCR) transgenic mouse which generates both CD4⁺ and CD8⁺ T cells that recognize MOG[₃₅₋₅₅]. Indeed, the development of these TCR transgenic mice offered a promising tool to study the pathogenic role of individual subsets of T cells in EAE. However, we still observed endogenous TCR expression in these mice, indicating mainly the incomplete allelic exclusion of the TCRα chain. To obtain pure transgenic T cell populations, 1C6 mice were crossed with RAG-1 deficient mice. The RAG proteins (RAG-1 and RAG-2) together form a complex responsible for V(D)J rearrangement. Functional impairment of only one of the two genes was believed to eliminate any endogenous TCR expression. The role played by allelic inclusion in shaping the TCR repertoire of 1C6 mice is unclear. In the first part of the thesis, I have investigated that allelic inclusion is crucial in 1C6 mice for the suppression of severe CNS autoimmunity. I have used 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice which are derived by crossing 1C6 with NOD Rag1[exposant -/-] mice. These mice cannot rearrange endogenous TCRα and β chains due to absence of Rag1. In 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice numbers of both CD4⁺ and CD8⁺ T cells have diminished. We showed that 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice develop spontaneous EAE but not 1C6 x Rag1[exposant +/+]. They also rapidly develop fatal EAE upon immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein MOG[₃₅₋₅₅] despite the lack of splenic CD8⁺ T cells. Our data show a critical role for endogenously rearranged TCR chains in mediating T cell survival and disease susceptibility in 1C6 mice. In the second part of the thesis, I have investigated the role of ER-associated degradation (ERAD) in Th1 and Th17 subsets of CD4⁺ T cells. ERAD is a protein quality system that removes misfolded, misassembled proteins in the ER by selectively dislocating them into the cytosol where they are subsequently degraded by the cytosolic ubiquitin proteasome system (UPS). Sec61 plays an important role in the import of newly synthesized proteins into the endoplasmic reticulum (ER), while the p97 translocon is crucial for the retrotranslocation i.e., reverse transport of misfolded proteins to the cytosol. However, while the role of sec61 and p97 has been investigated extensively in neurodegenerative diseases and cancer, their function in autoimmune disease, and in T cell function, are incompletely understood. Previous studies have shown that mycolactone-mediated Sec61 blockade has immediate inhibitory effects on the production of cytokines in immune cells. However, the suppression of cytokines by sec61 inhibitors is not completely explored in MS. Our aim is to investigate the effect of Sec61 and p97 inhibitors in different T cell subsets. In this study, we use three different inhibitors: (1) Eeyarestatin I (ErsI): inhibition of sec61 as well as p97 (2) NMS873: specific inhibitor of p97 (3) Apratoxin A (Apra A): specific inhibitor of Sec61. In this study we have observed that above inhibitors of ERAD substantially suppress the production of pro-inflammatory cytokines in Th1 and Th17 cells. Also decreases protein levels of major transcription factors Stat-1 and Stat-3 involved in differentiation of Th1 and Th17 cells, respectively. We also observed that administration of NMS873 reduces EAE severity in C57BL/6J mice. In future work, we will explore the mechanism by which these inhibitors regulate T cell signaling. Our work thus potentially uncovers novel molecules and pathways in CD4⁺ T cells that could be target for future therapy in MS.

La mesure de la perte du volume cérébral est un marqueur IRM de la neurodégénérescence dans la sclérose en plaques. Les techniques actuelles permettent de quantifier soit directement la perte de volume cérébral entre deux examens, soit de la mesurer indirectement à partir du volume cérébral de chaque examen. La fiabilité de ces techniques reste difficile à évaluer en l’absence de gold standard. Ce travail a consisté premièrement, en une étude de reproductibilité réalisée chez 9 patients à partir d’acquisitions semestrielles (3 IRM), sur deux machines différentes et post-traitées par sept algorithmes : BBSI, FreeSurfer, Intégration Jacobienne, KNBSI, un algorithme Segmentation / Classification, SIENA et SIENAX. Deuxièmement, un suivi longitudinal et prospectif a été effectué chez 90 patients SEP. L’étude des variabilités inter-techniques et inter-sites a montré que les techniques de mesures indirectes (Segmentation/Classification, FreeSurfer) et SIENAX fournissaient des pourcentages d’atrophie hétérogènes. A l’inverse, les techniques de mesures directes telles que BBSI, KNBSI, Intégration Jacobienne et à un moindre degré SIENA obtenaient des résultats reproductibles. Toutefois BBSI, KNBSI et l’Intégration Jacobienne obtenaient des pourcentages faibles, suggérant une possible sous-estimation de l’atrophie. L’évaluation de la perte du volume cérébral par Intégration Jacobienne a montré sur 2½ ans de suivi, une atrophie de 1,21% pour les 90 patients et de 1,55%, 1,51%, 0,84%, 1,21% respectivement pour les patients CIS, RR, SP et PP. A l’avenir l’évaluation de la perte de volume cérébral impose des défis d’ordre technique afin d’améliorer la fiabilité des algorithmes actuels. / Brain volume loss is currently a MRI marker of neurodegeneration in MS. The available algorithms for its quantification perfom either direct measurements, or indirect measurements. Their reliability remains difficult to assess especially since there is no gold standard technique. This work consisted first, in a reproducibility study performed on nine patients’ biannual MRI acquisitions (3 time points). These acquisitions were performed on two different MRI systems. Post-processing was applied using seven algorithms: BBSI, FreeSurfer, Jacobian Integration, KNBSI, an algorithm based on segmentation/classification, SIENA and SIENAX. Second, a longitudinal and prospective study was performed in 90 MS patients. The study of inter-technique and inter-site variabilities showed that direct measurement techniques and SIENAX provided heterogeneous values of atrophy. In contrast, indirect measurement algorithms such as BBSI, KNBSI, Jacobian Integration and to a lesser extent SIENA obtained reproducible results. However BBSI, KNBSI and Jacobian Integration algorithms showed lower percentages, suggesting a possible underestimation of atrophy. The evaluation of brain volume loss by Jacobian Integration has shown an atrophy rate of 1.21% over 2 ½ years of the 90 patients’ follow up, and of 1.55%, 1.51%, 0.84%, 1.21% for CIS, RR, SP and PP patients respectively. Jacobian Integration showed its importance in individual monitoring. In the future, assessing brain volume loss requires overcoming of some technical challenges to improve the reliability of the currently available algorithms.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neuro-inflammatoire chronique, première cause de handicap chez le jeune adulte. Actuellement, aucun traitement ne freine l'aggravation des symptômes liée aux formes progressives. Bien que connue, l'implication des macrophages et de la microglie dans la démyélinisation et l'atteinte axonale doit être plus finement caractérisée. Ce d'autant plus que la plasticité fonctionnelle de ces cellules suggère une réponse spécifique selon la pathologie, la localisation des lésions et le stade évolutif de la maladie. Ce travail de thèse a consisté en une caractérisation moléculaire des programmes d'activation macrophagique/ microgliale dans deux types d'altérations tissulaires du système nerveux central des patients SEP : les zones partiellement démyélinisées bordant les plaques de la moelle épinière et les lésions corticales. Cette étude a été réalisée sur des tissus post-mortem de patients atteints de formes progressives, formes dans lesquelles les lésions médullaires et corticales sont nombreuses et impliquées dans le handicap progressif et irréversible. Nous avons identifié des spécificités moléculaires caractérisant l'activation macrophagique/microgliale au cours de la SEP en comparant, par une approche in silico, les profils caractérisés à ceux observés dans des pathologies neuro-dégénératives à composantes inflammatoires, la maladie d'Alzheimer et de Parkinson notamment. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'activation chronique des macrophages/cellules microgliales contribue à l'extension à bas bruit des lésions médullaires et corticales pendant la phase progressive de la SEP et proposent de nouvelles cibles thérapeutiques / Multiple sclerosis (MS) is a chronic neuro-inflammatory disease and the most common cause of chronic neurological disability in young adults. No treatment is currently available to prevent the aggravation of symptoms in the progressive forms of the disease. The involvement of macrophages and microglia in demyelination and axonal injury is well known but need to be further characterized. Especially, the high level of functional plasticity harboured by macrophages/ microglia suggests that these cells engage specific activation programs depending on the disease, its evolution stage and the localization of lesions. In this context, this phD thesis was essentially aimed to characterize macrophage/microglia activation programs in two categories of tissue alterations observed in the post-mortem central nervous system from MS patients: 1) partially demyelinated areas at the border of spinal cord plaques and 2) cortical lesions. These two particular types of lesions are both highly frequent in progressive forms of MS and suspected to be involved in chronic and irreversible neurological disability. Using an in silico approach, the macrophage/microglia activation programs identified in MS were then compared to those observed in neurodegenerative and inflammatory disorders such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Overall, our results suggest that the chronic activation of macrophages and microglia largely contributes to the slow and chronic expansion of MS lesions in progressive forms of the disease. Our work also proposes new therapeutic targets

Les troubles émotionnels sont considérés comme fréquents dans la sclérose en plaque (SEP) et ont été généralement étudiés par la reconnaissance des émotions faciales. En revanche, l’expérience émotionnelle a été très peu analysée dans la SEP, et ses corrélats neuro-anatomiques jamais explorés. De plus, l’intrication des difficultés émotionnelles avec d’autres variables cliniques reste mal comprise, notamment l’alexithymie, qui est fréquente dans cette pathologie et qui est susceptible de modifier le traitement émotionnel.Le but de cette étude est de préciser les difficultés émotionnelles dans la SEP, dans ses composantes de reconnaissance et d’expérience émotionnelle positive et négative. II s’agit également d’explorer les corrélats neuro-fonctionnels de l’expérience émotionnelle dans la SEP en général, et chez des patientes atteintes de SEP alexithymique versus non alexithymique en particulier. Une première étude nous a permis de confirmer l’atteinte de la capacité à reconnaitre les émotions faciales dans un groupe de patientes SEP et ceci de façon plus marquée pour les émotions négatives. Cette étude a aussi mis en avant une expérience émotionnelle très variable chez nos patientes avec une intensification du vécu subjectif plaisant et déplaisant. A travers une deuxième étude en imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), nous avons montré que cette variabilité de l’expérience émotionnelle était sous-tendue par une grande hétérogénéité des réponses hémodynamiques de nos patientes au niveau de structures cérébrales connues pour leur implication dans la construction du ressenti subjectif plaisant et déplaisant. Des analyses complémentaires en imagerie de diffusion soutiennent l’idée que ces anomalies fonctionnelles soient liées à une atteinte structurelle notamment au niveau des boucles limbiques et des structures fronto-insulaires qui forment le réseau de saillance. Une troisième étude a mis en avant un effet spécifique de l’alexithymie dans les activations cérébrales fonctionnelles des émotions positives, notamment de l’insula, tandis que les émotions négatives semblent être influencées par la maladie et l’alexithymie comorbide. Les analyses en imagerie de diffusion s’avèrent, pour leur part, indépendantes du statut alexithymique. Ainsi les troubles émotionnels dans la SEP concernent tant la capacité à reconnaitre les émotions chez l’autre qu’une modification de leur propre expérience émotionnelle positive et négative. L’alexithymie, dont la comorbidité est fréquente dans la SEP, accentue la présence de tels troubles au même titre que le phénomène lésionnel inhérent à la SEP. Considérant l’implication que de tels troubles peuvent avoir pour les patients et leur entourage familial, social et professionnel, il semble important de prendre en compte ces aspects pour une meilleure prise en charge de cette pathologie. / Emotional disorders in multiple sclerosis (MS) are frequently described as difficulties in recognizing facial expression. Yet, emotional experience is insufficiently studied in MS, and its neurobiological correlates stays never explored. Moreover, interaction between emotional disorder and other variable remains little documented, especially for alexithymia, a very frequent trouble in MS which could also cause emotional disturbances. The scope of this work is to explore positive and negative emotions in MS, with a focus on the recognition and experience dimensions. Concerning the emotional experience, brain functional activation correlates are also explored in MS overall, and in alexithymics versus non alexithymics MS subjects especially. A first study confirmed the difficulty for MS patient in recognizing facial emotions, and those difficulties were more marked for negative emotions. This study also highlights a more scattered emotional experience in MS, with a global exacerbation of their pleasant as well as unpleasant emotional feeling. A second study with fMRI shows that this scattered emotional experience was sustained by more brain functional variability during the emotional task. It takes place in brain structures known for their implication for the subjective feeling construction. Further diffusion imaging analyses support the view of a brain dysconnexion in those functional anomalies centred on limbic loop and fronto-insula network, also called salience network. A third study highlights a specific contribution of alexithymia in brain activity for hedonics experience, centred on insula deactivations whereas anhedonics experience seems to be influenced by the diseases and comorbid alexithymia. Brain diffusion analyses were independent of the alexithymia status. Thus, MS patients show difficulties in identifying emotion and have modifications of their own pleasant and unpleasant emotional experience. The frequent comorbid alexithymia in MS exacerbates those troubles in the same way as the lesion phenomenon of MS. Considering the implications that emotional disorders may have for MS patients as well as their familial, social and professional entourage, it seems essential to take these aspects into account for a better management of MS.

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central, ayant plusieurs phénotypes cliniques, caractérisée par la coexistence de phénomènes inflammatoires focaux et d’une neurodégénérescence diffuse, dont la physiopathologie est actuellement inconnue. L’apparition de troubles cognitifs marque un tournant évolutif pour les patients, est en lien avec la progression de la maladie, et notamment l’atrophie cérébrale. Néanmoins le statut cognitif de certains patients reste préservé malgré la progression de la maladie. Le concept de réserve cognitive rendrait compte de cette absence de corrélation entre statut cognitif et lésions cérébrales en lien de la maladie, mais ses bases physiologiques sont à l’heure actuelle inconnues. Trois techniques d’imagerie : L’étude de la perfusion cérébrale en arterial spin labelling, de la vasoréactivité cérébrale grâce à l’inhalation d’un gaz enrichi en CO2, et des anomalies de substance blanche cérébrale en tenseur de diffusion sont utilisées dans ce manuscrit pour répondre aux questions suivantes :- Existe-t-il des anomalies vasculaires pouvant expliquer la neurodégénérescence diffuse observée dans la sclérose en plaques, et notamment dans les formes progressives ?- Existe-t-il en tenseur de diffusion des anomalies de certains faisceaux de substance blanche qui serait corrélées au statut cognitif ou au phénotype clinique des patients? La réserve cognitive est-elle médiée par des phénomènes de plasticité de la substance blanche dans la sclérose en plaques? / Multiple sclerosis in an inflammatory and dysimmune condition of the central nervous system, with different clinical patterns. This disease involves patchy area of demyelination and of a diffuse axonal loss and neurodegeneration. The pathophysiology of this diffuse neurodegeneration remains currently unknown. The apparition of a cognitive impairment dramatically changes the clinical prognosis in patients. This cognitive impairment seems to be linked to a diffuse dysconnexion of normal appearing white matter, and to grey matter atrophy. Cognitive reserve could explains a lack of correlation between the cognitive status in patients and the cerebral lesion load due to the disease. Anatomical basis of cognitive reserve are unclear. Three methods of imaging : arterial spin labelling, measure of the cerebral vasoreactivity with the inhalation of a gas enriched in dioxid, and diffusion tensor imaging are employed to answer to these questions in multiple sclerosis : Are there vascular abnormalities related to neurodegeneration, in particular in progressive forms of multiple sclerosis? Could we find white matter differences in tracts related to cognitive impairment or clinical form in patients? Is Cognitive reserve linked to a cerebral white matter plasticity in this condition ?