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Das Flagellum von Salmonella enterica ist eine komplexe molekulare Nanomaschine, die zur Fortbewegung verwendet wird. Die Synthese erfordert die Sekretion extrazellulärer Bausteine durch die Zellhülle. Der Substratexport erfolgt durch ein hochkonserviertes Typ-III-Sekretionssystem. Der Kern des fT3SS ist eine komplexe Proteinsekretionsmaschine, bestehend aus den Proteinen FliPQR und FlhBA. Ziel dieser Arbeit war die molekularen Mechanismen, die eine korrekte Funktion gewährleisten, tiefergehend zu erforschen. Im ersten Kapitel wurden die molekulare Mechanismen der Qualitätskontrolle während der Synthese des fT3SS untersucht. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die korrekte Synthese durch das fT3SS-spezifischen Chaperon FliO gewährleistet wird. Ziel war es, den molekularen Mechanismus, wie FliO an diesem Prozess beteiligt ist, aufzuklären. Die Ergebnisse zeigten, dass mehrere Aminosäuren von FliO während der Assemblierung mit FliP interagieren. Des Weiteren wurde die Relevanz des spaltbaren Signalpeptids am N-Terminus von FliP untersucht. Diese Studie zeigt, dass die Anwesenheit des Signalpeptids und seine korrekte Spaltung entscheidend, aber nicht unerlässlich für die Funktion der Flagellen sind. Das fT3SS ist in der Lage Proteine mit einer bemerkenswerten Geschwindigkeit von mehreren tausend Aminosäuren pro Sekunde zu sekretieren. Das zweite Kapitel konzentrierte sich darauf, wie das fT3SS Proteine mit hoher Geschwindigkeit sekretiert, während das Austreten kleiner Moleküle verhindert wird. Unsere Mutationsanalysen zeigten, dass eine Methioninschleife in FliP, eine sperrige Plug-Domäne in FliR und intermolekulare Salzbrücken zwischen FliQ-Untereinheiten zusammenarbeiten, um die Integrität der Membran aufrechtzuerhalten. Diese Arbeit liefert neue Einblicke in die Synthese des fT3SS Kerns und die Regulation der Substratsekretion. Beide Prozesse werden an mehreren Stellen streng kontrolliert, um eine korrekte Funktion des Flagellums sicherzustellen. / The flagellum of Salmonella enterica is a sophisticated molecular nanomachine, which is used for locomotion. Flagella synthesis requires the translocation of extracellular subunits across the cell envelop, which is mediated by a highly conserved type-III secretion system (fT3SS). The core fT3SS is a complex protein secretion machine consisting of the proteins FliPQR and FlhBA. Productive assembly is crucial for flagella function. The molecular mechanisms which ensure correct function of the fT3SS remain poorly understood. In this thesis, we aimed to gain a profound insight into the molecular mechanisms of fT3SS core assembly and function. The first chapter investigated the molecular mechanisms underlying the quality control during the assembly of the fT3SS. It was recently shown that productive assembly of the core fT3SS relies on the flagella-specific chaperone FliO. We aimed to elucidate the molecular mechanism of how FliO facilitates this process. Our results demonstrated, that several residues of FliO are interacting with FliP during the assembly process. Furthermore, we aimed to identify the relevance of the cleavable signal peptide at the N-terminus of FliP. This study showed, that the presence of the signal peptide and its correct cleavage are crucial but not essential for flagella function. The fT3SS is able to secrete proteins with a remarkable speed of several thousand amino acids per second. The second chapter focused on how the fT3SS secretes proteins at high speed while preventing the leakage of small molecules. Our mutational analyses demonstrated that a methionine loop in FliP, a bulky plug domain in FliR and intermolecular salt bridges between FliQ subunits are acting cooperatively to maintain the membrane barrier. Overall, this work provides new insights into the assembly process of the fT3SS core and the regulation of substrate secretion. Both processes are tightly controlled at multiple stages to ensure the proper functioning of the flagellum.

Der Austausch von genetischem Material über horizontalen Gentransfer, stellt einen wichtigen Mechanismus in der bakteriellen Evolution dar. Legionella pneumophila Stämme codieren für verschiedene Typ IV Sekretionssysteme (T4SS) und integrative konjugative Elemente, die zur genomischen Variabilität der intrazellulären Erreger beitragen. L. pneumophila Corby codiert auf der genomischen Insel Trb-1 für ein funktionelles Konjugations- und T4ASS. Trb-1 ist innerhalb des tRNAPro Gens integriert und kann in einer chromosomalen oder zirkulären episomalen Form existieren. Zusätzlich zu den trb/tra Genen sind auf der Insel eine Integrase (int-1) und die Gene lvrRABC der Legionella vir Region (lvr) lokalisiert. Durch die Deletion von int-1 konnte gezeigt werden, dass die Exzision von Trb-1 unter Beteiligung der Integrase erfolgt. Zudem wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal demonstriert, dass die lvr-Region, vor allem der putative Phagen-Repressor LvrR an der Regulation der Exzision von Trb-1 beteiligt ist. Die Konjugation von Trb-1 in L. oakridgensis, hatte keinen Effekt auf die in vivo Fitness der Transkonjuganten in humanen Makrophagen. Die genomischen Inseln LpcGI-1 und LpcGI-2 codieren für ein neues putatives GI-T4SS. Für LpcGI-2 konnte erstmals gezeigt werden, dass das T4SS funktionell ist und die Konjugation der genomischen Insel in einen anderen L. pneumophila Stamm vermitteln kann. LpcGI-2 kann anschließend ortsspezifisch in das Genom der Transkonjuganten integriert werden. LpcGI-1 und LpcGI-2 werden vom tRNAThr bzw. tRNAMet Gen flankiert und können in verschiedenen chromosomalen und zirkulären, episomalen Formen existieren. Die Exzision von LpcGI-2 erfolgt ähnlich zu Trb-1, in Abhängigkeit einer ortsspezifischen Integrase. Im Genom von Lp Corby wurden zwei weitere genomische Inseln (LpcGI-Asn und LpcGI-Phe) identifiziert. In silico Analysen zeigten zudem, dass genomische Inseln mit einer Ähnlichkeit zu Trb-1, LpcGI-2 bzw. LpcGI-1 im Genus Legionella verbreitet sind. / Exchange of genetic information by horizontal gene transfer is an important mechanism for the evolution of bacterial genomes. Legionella pneumophila strains encode different type IV secretion systems and integrative conjugative elements contribute to the variability of the intracellular pathogen. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby encodes a functional conjugation and T4ASS. Trb-1 is integrated within the tRNAPro gene and can exist in a chromosomal or an episomal circular form. In addition to the trb/tra genes, a site-specific integrase (int-1) and a Legionella vir region (lvrRABC) are also localized on the genomic island. By deleting the int-1 gene, it could be demonstrated that the excision and of Trb-1 is integrase dependent. Furthermore, in this work it was shown for the first time that the lvr region and especially the putative phage repressor LvrR, is involved in the regulation of Trb-1 excision. Conjugation of Trb-1 in L. oakridgensis does not influence the in vivo fitness of the transconjugants in human macrophages. The genomic islands LpcGI-1 and LpcGI-2 encode a new putative T4SS. For the first time it could be demonstrated, that the T4SS localized on LpcGI-2 is functional. Although LpcGI-2 could be mobilized and transferred via conjugation to another L. pneumophila strain, followed by the site-specific integration into the genome of the transconjugants. LpcGI-1 and LpcGI-2 are flanked by the tRNAThr or tRNAMet gene respectively. Both islands can exist in different chromosomal and episomal forms. The excision of LpcGI-2 occurs similar to Trb-1 in an integrase dependent manner. Two additional genomic islands (LpcGI-Asn and LpcGI-Phe) could be identified in the genome of Lp Corby. Moreover, data of the in silico analysis demonstrated, that genomic islands similar to Trb-1, LpcGI-2 and LpcGI-1 are distributed within the genus Legionella.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung des Typ III-Sekretionssystem (T3SS) bei Bradyrhizobium japonicum USDA110. Im ersten Teil der Arbeit wird die Regulation der Gene des Typ III-Sekretionssystems in B. japonicum beschrieben. Dabei wurde die tts-Box, als neuartige Promotorsequenz für die Gene des T3SS und sekretierter Proteine charakterisiert. Mittels Expressionsanalysen konnte die Aktivität von 34 Genregionen downstream der tts-Boxen in Abhängigkeit von Flavonoiden gezeigt werden. Auch in Symbiose, in frühen Infektionsstadien und in reifen Knöllchen von verschiedenen Wirtspflanzen wurde die Expression ausgewählter Gene nachgewiesen. Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Analyse der sekretierten Proteine von B. japonicum. Über 100 Proteine wurden im Überstand von Kulturen nachgewiesen, wovon 68 Proteine durch Massenspektrometrie identifiziert werden konnten. Zusätzlich wurden 12 Proteine identifiziert, die in Abhängigkeit des T3SS sekretiert werden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die sekretierten Proteine NopE1 und NopE2 näher untersucht und als bona-fide Effektoren nachgewiesen. Die rekombinant produzierten Effektoren NopE1 und NopE2 wurden biochemisch charakterisiert. Für die Domäne unbekannter Funktion (DUF1521) wurde eine spezifische Selbstspaltungsaktivität in Gegenwart von Calcium gezeigt. Nachweislich ist diese Aktivität relevant für die Symbiose. Somit konnte der Proteindomäne mit bisher unbekannter Funktion eine biochemische Funktion zugeordnet werden. Im letzten Teil der Arbeit wurden die Untersuchungen an dieser Domäne auf weitere Proteine ausgedehnt. Für das putative Effektorprotein VIC_001052 aus V. coralliilyticus, dem Verursacher der Korallenbleiche bei Pocilla damicornis, wurde ebenfalls die in vitro Calcium-induzierte Selbstspaltungsaktivität gezeigt. Aufgrund der konservierten Selbstspaltungsfunktion wurde die DUF1521-Domäne in metal-ion inducible autocleavage- (MIIA)- Domäne umbenannt.:I. Einleitung Rhizobien-Leguminosen-Interaktion Proteinsekretionssysteme II. Zusammenfassung der Forschungsergebnisse 1. Untersuchung der Expression des Typ III-Sekretionssystems in Knöllchen und Analyse des tts-Box-Promotors 2. Identifizierung sekretierter Proteine von Bradyrhizobium japonicum 3. Untersuchung der sekretierten Proteine NopE1 und NopE2 4. Untersuchung von konservierten MIIA-Domänen III. Diskussion IV. Zusammenfassung V. Literaturverzeichnis VI. Anhang VII. Publikationen

Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) ist ein Proteinkomplex den Gramnegative Bakterien nutzen um in einem Schritt Effektorproteine (Effektoren) aus dem Zytosol über die Doppelmembran zu sekretieren. Für viele Bakterien ist das T3SS ein essenzieller Virulenzfaktor, der es ihnen erlaubt mit ihrem Wirt zu interagieren und diesen zu manipulieren. Charakteristisch für das T3SS ist die strukturelle Komponente, der Nadelkomplex. Dieser ähnelt strukturell einer Spritze, deren Basalkörper die bakteriellen Membranen und das Periplasma durchspannt und einer Nadel, die vom Basalkörper aus dem Bakterium ragt. Basierend auf dem Modell einer Spritze wird angenommen, dass Effektoren entfaltet und anschließend durch Basalkörper und Nadelkanal sekretiert werden. Trotz der kontinuierlichen Forschung an T3SS entbehrt dieses Modell einer experimentellen Grundlage und der Mechanismus ist nicht vollständig erklärt. Ziel der Arbeit war es, eine experimentelle Basis für den Sekretionsmechanismus des T3SS zu schaffen. Um zu verstehen, wie das T3SS Effektoren sekretiert, wurden zunächst Fusionsproteine konstruiert, welche aus einem Effektor und einem stabil gefalteten Knotenprotein bestehen. Aufgrund des Knotens in der Fusion ist davon auszugehen, dass dieser während der Sekretion nicht entfalten kann. Die Effektordomäne wird sekretiert während der Knoten im Kanal verbleibt und diesen verstopft. Nach unseremWissen ist diese Arbeit die erste Visualisierung von Effektorfusionen an isolierten Nadelkomplexen. Die Effektorfusion wird N-terminal voran durch den Kanal sekretiert, wobei der Kanal das Substrat umschließt und gegen Proteasen und chemische Modifikationen abschirmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern eine Grundidee der Funktionsweise des T3SS und liefern eine vielversprechende Strategie für in situ-Strukturanalysen. Dieser Ansatz lässt sich auch auf andere Proteinsekretionssysteme übertragen, bei welchen Substrate vor dem Transport entfaltet werden müssen. / The Type III Secretion System (T3SS) is a complex used by Gram-negative bacteria to secrete effector proteins from the cytoplasm across the bacterial envelope in a single step. For many pathogens, the T3SS is an essential virulence factor that enables the bacteria to interact with and manipulate their respective host. A characteristic structural feature of the T3SS is the needle complex (NC). The NC resembles a syringe with a basal body spanning both bacterial membranes and a long needle-like structure that protrudes from the bacterium. Based on the paradigm of a syringe-like mechanism, it is generally assumed that effectors are unfolded and secreted from the bacterial cytoplasm through the basal body and needle channel. Despite extensive research on T3SS, this hypothesis lacks experimental evidence and the mechanism of secretion is not fully understood. This work aimed to provide an experimental basis for the model of the T3SS mechanism. In order to elucidate details of the effector secretion mechanism, fusion proteins consisting of an effector and a bulky protein containing a knotted motif were generated. It is assumed that the knot cannot be unfolded during secretion of the chimera. Consequently, these fusions are accepted as T3SS substrates but remain inside the NC channel and obstruct the T3SS. This is, to our best knowledge, the first time effector fusions have been visualized together with isolated NCs and it demonstrates that effector proteins are secreted directly through the channel with their N-terminus first. The channel encloses the substrate and shields it from a protease and chemical modifications. These results corroborate an elementary understanding of how the T3SS works and provide a powerful tool for in situ-structural investigations. This approach might also be applicable to other protein secretion systems that require unfolding of their substrates prior to secretion.

Das humane Magenpathogen Helicobacter pylori (H. pylori) besiedelt den menschlichen Magen und kann zu der Entstehung schwerwiegender Krankheiten wie Magenkrebs und Magengeschwüren führen. Die Pathogenese ist eng mit dem bakteriellen Typ IV Sekretionssystems (T4SS) assoziiert, das die Translokation des Effektorproteins CagA in die Wirtszelle vermittelt. Bisher ist noch unbekannt, in welchem Ausmaß wirtszellspezifische Faktoren die T4SS induzierte Pathogenese beeinflussen. Dieser Aspekt wurde in dieser Arbeit durch die Analyse verschiedenster Zelllinien das erste Mal systematisch untersucht. Interessanterweise unterschied sich die zelluläre Antwort auf die T4SS spezifische Infektion erheblich in Abhängigkeit der verwendeten Zelllinie. Die Ergebnisse beweisen, dass Wirtszellfaktoren eine ebenso große Rolle in der H. pylori induzierten Pathogenese spielen wie bakterielle Effektoren. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit eine genomweite Screening-Methode etabliert, die es ermöglicht, neue Komponenten des T4SSs, translozierte NF-B Effektoren und bakterielle Adhäsine zu identifizieren. Auch der Einfluss von CagA auf den EGF-Rezeptor wurde hier näher untersucht. Der Rezeptor steht ebenfalls eng mit der Entstehung von Krebs in Verbindung. Hierbei stellte sich heraus, dass CagA die Endozytose des EGF-Rezeptors durch die Aktivierung der Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase c-Abl hemmt und dadurch die Rezeptorpopulation auf der Wirtszelloberfläche erhöht. Interessanterweise führt dieser Effekt jedoch nicht zu einer Verstärkung der EGF-Rezeptor Signaltransduktion. Vielmehr kommt es zu einer Hemmung der EGF-Rezeptor Transaktivierung und zu einer Blockade der EGF vermittelten Wundheilung. Die Daten weisen auf eine Rolle des EGF-Rezeptors in der H. pylori induzierten Geschwürbildung hin. Auch der zu Grunde liegende molekulare Mechanismus der Rezeptor-Inhibierung konnte hier entschlüsselt werden, der sowohl von CagA als auch von der Phosphatase SHP-2 gesteuert wird. / The human gastric pathogen Helicobacter pylori (H. pylori) elicits a tremendous medical burden because of its causative association with peptic ulcer disease and gastric cancer. The pathogenic potential of H. pylori is intricately linked to the expression of a pathogenicity island encoded type IV secretion system (T4SS), which translocates the bacterial effector protein CagA into the eukaryotic host cell. The role of host cell determinants in T4SS mediated pathogenesis has not yet been systematically examined. To elucidate the role of host cell factors within T4SS induced host cell responses, different eukaryotic cell lines were analyzed systematically for respective phenotypes. Remarkably, T4SS mediated host responses among these cell lines varied considerably, thereby demonstrating the importance of host cell components in H. pylori induced pathogenesis. In addition, a H. pylori genome wide bacterial screen for factors important in pathogenesis, such as unknown T4SS components or novel NF-kappaB effector molecules, was developed and optimized. The precise function of the prominent effector protein CagA remains unclear. To functionally characterize the role of CagA, its impact on the epidermal growth factor (EGF)-receptor pathway was analyzed. The results suggest a mechanism where EGF-receptor endocytosis is completely blocked by a CagA induced activation of c-Abl, leading to an elevated receptor surface exposition. Surprisingly, EGF-receptor transactivation and EGF-dependent wound healing are selectively blocked during prolonged infections as well, indicating that an increased receptor-population on the cell surface does not necessarily promote signaling. This data suggests a role for the EGF-receptor in H. pylori- induced ulcer disease. The underlying molecular mechanism was identified as being SHP-2 and CagA dependent.

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