El interés en triterpenos bioactivos condujo al diseño de una serie de cuarenta y tres derivados de lupeol (1) y calenduladiol (5), aislados a partir de la especie vegetal Chuquiraga erinaceae. El triterpeno natural 5 presentó un segundo grupo hidroxilo en C-16, además del hidroxilo en C-3 y del grupo isopropenilo en el anillo E, característico de este tipo de alcoholes triterpénicos, ofreciendo una estructura novedosa para ser modificada sintéticamente. En primer lugar, se llevó a cabo la optimización de la técnica de extracción y purificación reportada anteriormente para el aislamiento de 5. La sulfatación de los alcoholes 9-12, obtenidos por modificación química del grupo isopropenilo de 5, dio lugar a los derivados sulfatados 14-17. En cambio, el análogo 18 fue preparado por epoxidación del grupo isopropenilo de calenduladiol disulfatado (8). Los triterpenos 5, 10 y 11 fueron tratados con anhídrido acético rindiendo los ésteres 19-23; el tratamiento de 5 con los correspondientes cloruros de ácido dio lugar a los ésteres 24-27. Los derivados carbonílicos 10, 30-39 fueron obtenidos por oxidación alílica y/o con el reactivo de Jones de 1 y 5. Las cetonas 30 y 33, así como el aldehído 36 fueron tratados con cloruro de hidroxilamina a fin de obtener las oximas correspondientes (40-44). Por otro lado, teniendo en cuenta que la inversión de la configuración del C-3 incrementa la actividad antituberculosa y citotóxica en los alcoholes 3a-triterpénicos, se llevó a cabo la síntesis de estos alcoholes desde sus epímeros 3B más disponibles. Se estudiaron distintos sistemas catalíticos para la reducción quimio- y estereoselectiva de la cetona 30. El sistema bimetálico PtSn0,8/SiO2 resultó ser quimioselectivo dando lugar a 45 con una estereoselectividad interesante. Finalmente, la reducción de la oxima 40 rindió una mezcla de aminas isómeras (49 y 50) la cual pudo ser separada por cromatografía. Todos los derivados obtenidos fueron evaluados frente a las enzimas acetil- y butirilcolinesterasa (ACE y BuCE). El compuesto 14, con dos grupos sulfato y un grupo isopropilo unido a C-19, mostró la inhibición más potente frente a ACE. El estudio cinético enzimático y el modelado molecular revelaron que 14 se une reversiblemente al complejo enzima-sustrato, produciendo un complejo inactivo. Por otro lado, los derivados 35 y 36 mostraron la mayor actividad y selectividad frente a BuCE, sugiriendo que la presencia de un grupo carbonilo en C-16 es fundamental para esta actividad. El estudio cinético enzimático y el modelado molecular revelaron que estos inhibidores presentan afinidad por el sitio activo de la enzima y, por lo tanto, compiten con el sustrato por el acceso al mismo. Por último, se determinó la actividad citotóxica frente a las líneas celulares de cáncer de próstata (PC-3 y LNCaP) de derivados de 1 y 5, resultando el lupeol sulfatado (13), el inhibidor más potente. / The interest in bioactive triterpenes prompted to synthesize a set of forty-three derivatives from lupeol (1) and calenduladiol (5), isolated from Chuquiraga erinaceae. Natural triterpene 5 presented a second hydroxyl group at C-16, in addition to the hydroxyl at C-3 and isopropenyl moiety in the ring E, characteristic of this type of triterpene alcohols, providing a novel structure to be modified synthetically. Optimization of the extraction and purification technique previously reported for the isolation of 5. Sulfation of alcohols 9-12, obtained by chemical modification of the isopropenyl moiety of 5, afforded sulfated derivatives 14-17. However, derivative 18 was prepared by epoxidation of the isopropenyl moiety of disulfate calenduladiol (8). Triterpenes 5, 10 and 11 were treated with acetic anhydride yielding the esters 19-23; the treatment of 5 with the corresponding acyl chlorides afforded the esters 24-27. Carbonilyc derivatives 10, 30-39 were obtained by allylic oxidation and/or with Jones reagent of 1 and 5. Ketones 30 and 33, and aldehyde 36 were treated with hydroxylamine chloride in order to obtain the corresponding oximes (40-44). Taking into account that conversion of the stereochemistry of C-3 increases the antitubercular and cytotoxic activity in the 3a-triterpenic alcohols, the synthesis of these alcohols from the most available epimers 3B was carried out. In this work different catalytic systems have been studied for the chemo- and stereoselective reduction of ketone 30. The PtSn0,8/SiO2 bimetallic system proved to be chemoselective leading 45 with an interesting stereoselectivity. Finally, the reduction of the oxime 40 yielded a mixture of isomeric amines (49 and 50), which could be separated by chromatography. All the derivatives obtained were tested for their inhibitory activity against acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE). Compound 14, with two sulfate groups and an isopropyl group attached to C-19, showed the most potent inhibition for AChE. Enzyme kinetic study and molecular modeling revealed that 14 was able to bind to the complex enzyme-substrate producing an inactive complex. On the other hand, derivatives 35 and 36, showed the highest activity and selectivity against BChE, suggesting that the presence of a carbonyl group at C-16 is essential for this activity. Enzyme kinetic study and molecular modelling revealed that these inhibitors have an affinity for the active site of the enzyme and, therefore, compete with the substrate for access to it. Finally, the cytotoxic activity was determined against cancer cell lines prostate (PC-3 and LNCaP) of derivatives 1 and 5, being sulfated lupeol (13), the most potent inhibitor.

Este trabajo de tesis se basó en el diseño y síntesis de compuestos bioactivos, a partir de estructuras inspiradas en productos naturales, con el propósito de contribuir al descubrimiento de nuevos inhibidores de colinesterasas de carácter multifuncional, con potencial aplicación para la terapia de la enfermedad de Alzheimer. En primer lugar, en el capítulo III de esta tesis se llevó a cabo la optimización mediante calentamiento con equipo de microondas, de la síntesis de derivados de azaestilbeno mediante la incorporación de un espaciador y una amina terciaria a una estructura análoga al azaresveratrol, de conocida actividad biológica. Se obtuvieron 19 compuestos, todos resultaron inhibidores de acetilcolinesterasa (ACE) y butirilcolinesterasa (BuCE). El derivado con un anillo de piperidina unido al azaestilbeno por un espaciador de siete carbonos (12b) fue el inhibidor más potente para ACE. Asimismo mostró inhibición significativa de ACE en células de neuroblastoma humanas SH-SY5Y, sin efecto citotóxico. A su vez, el estudio cinético enzimático mostró una inhibición no competitiva y el modelado molecular reveló interacciones con el sitio activo catalítico así como también con el sitio aniónico periférico de ACE. El estudio de dinámica molecular de los derivados con piperidina y linker de seis (11b), siete (12b) y ocho carbonos (13b) mostró que la conformación que adopta 12b permite interacciones más efectivas que los otros análogos, justificando así su mayor potencia de inhibición observada experimentalmente. Por otro lado, el derivado con pirrolidina y un espaciador de siete carbonos (12a) fue el inhibidor más potente para BuCE. Continuando con la misma estrategia de diseño, en el capítulo IV se obtuvieron 14 análogos de azobenceno mediante la síntesis asistida por microondas comprendida en dos etapas, en un tiempo total no superior a 40 minutos. Todos los compuestos resultaron potentes inhibidores de ACE. El derivado de azobenceno disustituído con dos linkers de cinco carbonos unidos a un anillo de piperidina, 21b, fue el inhibidor más potente. Mediante exposición con luz UV, se logró la fotoisomerización E→Z de los derivados 18b y 20b evaluada por espectroscopia UV-Vis y RMN de 1H. Ambos, mostraron una mayor potencia de inhibición enzimática en su configuración Z comparada con la E. De esta manera, el mejor resultado de IC50 de toda la serie (E y Z) se obtuvo para el isómero Z del compuesto 20b. En el capítulo V, mediante síntesis asistida por microondas se obtuvieron 6 nuevos compuestos híbridos de teofilina y pirrolidina, con una cadena hidrocarbonada de 3 a 8 carbonos. El derivado 27a con un linker de siete carbonos fue el inhibidor más potente de la serie. Por otro lado, 25a, que presenta un espaciador de cinco carbonos, activó el receptor muscular de acetilcolina (nAChR) a concentraciones muy bajas (de 0,01 pM) y a la concentración más alta probada (30 μM) se observó una disminución en la duración media de apertura, lo que sugiere que este compuesto actúa como un agonista del receptor y también un bloqueador de canal abierto. Por último, la síntesis one pot de nuevas bislofinas es abordada en el capítulo VI, la cual se optimizó mediante calentamiento por microondas logrando una importante disminución de los tiempo de reacción y evitando el uso del ácido de Lewis como catalizador. Tres de los seis compuestos sintetizados resultaron inhibidores selectivos de BuCE. Por otro lado, de la serie completa de los derivados de bislofina evaluados como inhibidores enzimáticos, el compuesto IIIB fue el inhibidor selectivo más potente de BuCE, a escala nanomolar. El estudio cinético enzimático de este mostró una inhibición no competitiva. / This work was based on the design and synthesis of bioactive compounds, inspired by natural products structures, with the aim of contributing to the discovery of new multifunctional cholinesterase inhibitors, with potential application in the Alzheimer’s disease therapy. Initially, in chapter III this thesis describes the optimization of the synthesis of azaestilbene derivatives, by microwave-assisted reactions. A spacer and a tertiary amine were incorporated into a structure analogous to azaresveratrol, a compound of known biological activity. Nineteen new compounds were obtained, all of them were able to inhibit both acetyl- and butyrylcholinesterase. For acetylcholinesterase, the best inhibition was achieved with the derivative 12b with a seven-carbon spacer connecting the amine with the azastilbene portion. In addition, compound 12b elicited significant inhibition of acetylcholinesterase activity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells, with no cytotoxicity. In turn, the enzymatic kinetic study showed non-competitive inhibition and the molecular modeling revealed interactions with the catalytic active site as well as with the peripheral anionic site of the enzyme. The molecular dynamic study of the derivatives with piperidine and linker of six (11b), seven (12b) and eight carbons (13b) was carried out. This study showed that the conformation that 12b adopts allows more effective interactions than the other analogues. In this way, the greater inhibition efficiency observed experimentally for 12b, is justified. On the other hand, the pyrrolidine derivative with a seven-carbon spacer (12a) was the most potent inhibitor for butyrylcholinesterase. Continuing with the same design strategy, in Chapter IV, fourteen new azobenzene analogs were obtained by microwave-assisted synthesis. This synthesis was based on two steps, with a total reaction time no longer than 40 minutes. All the derivatives were potent acetylcholinesterase inhibitors. The azobenzene derivative disubstituted with two five-carbon linkers attached to a piperidine ring, 21b, was the most potent inhibitor. Upon UV-light irradiation, isomerization from the E-form to the Z-form of derivatives 18b and 20b was achieved. The E-Z isomerization was corroborated by UV−Vis spectroscopy and 1H NMR spectra. Both compounds showed a higher potency of enzyme inhibition in their Z configuration compared to E. Thus, the best IC50 value of the entire series (E and Z) corresponds to the Z isomer of compound 20b. Chapter V details the microwave-assisted synthesis of five new hybrid compounds of theophylline and pyrrolidine, with a hydrocarbon chain of three to seven carbons. Derivative 27a with a seven-carbon linker was the most powerful inhibitor in the series. On the other hand, 25a, which has a five-carbon spacer, activated muscle nAChR at an extremely low concentrations (from 0.01 pM). At the highest tested concentration (30 μM) a decrease in the mean open duration was observed, which suggest that 25a also acts as an open channel blocker. Finally, the one-pot synthesis of new bislofinas is addressed in chapter VI. This synthesis was optimized by microwave heating, getting a significant reduction in reaction time and avoiding the use of Lewis acid as a catalyst. Three of the six synthesized compounds were selective butyrylcholinesterase inhibitors. On the other hand, compound IIIB was the most potent selective butyrylcholinesterase inhibitor in the whole series evaluated, with an IC50 value in the nanomolar scale. Its enzymatic kinetic study showed non-competitive inhibition

[EN] This thesis is divided in two parts covering the fields of medicinal chemistry and science materials, respectively. In the first part, the semisynthesis of new derivatives of the antitumor drug 20-(S)-Camptothecin (CPT) and its biological properties, in terms of antitumor activity, stability and oral bioavalability are developed. More specifically, the application of the Tscherniac-Einhorn (T-E) reaction is described as an effective and high performance methodology to obtain a wide variety of novel lipophilic 9-amidomethylCPT and 9-imidomethylCPT derivatives. The results showed that the introduction of bulky aliphatic imide moiety in position 9, with the methoxylation of the C-10, provides an improvement of the in vitro and in vivo antitumor activity and two-times more oral permeability comparing with CPTs analogues clinically approved. Beyond the synthesis of new analogues, the T-E reaction is postulated as a useful pathway to activate position 9 with novel functionalities such as formylation and aminomethylation which have been previously reported with low or erratic yields. Within the area of semisynthetic procedures, the hexacyclic derivative, 9, 10-[1,3]-DioxoCPT was isolated quantitatively showing that the presence of cyclic acetal moiety improves the in vitro and in situ oral bioavailability keeping the antitumor activity ratio. In the second part of this thesis, within the interdisciplinary field of biology and science materials, the development of micro and mesoporous materials under biomimetic conditions is explained. The work of this section shows that small bifunctional molecules are available for the hydrolysis and condensation of silicon monomers while incorporating defined organic molecules that work as structure directing agents (SDA) leading mesostructured materials. Similarly to the biological process developed by silicateins, the mixture of ethanolamine and tromethamine simulates the active center of these proteins by a synergic combination of the buffering and the catalytic activity working at neutral pH, atmospheric pressure and in absence of external energy source. Thus, ZSM5 and MCM41 type materials, with high interest in various industrial applications, are obtained by a sol-gel process at neutral pH in opposition to the standar method based on strong acid or alkaline conditions. The possibilities of this methodology to insert active metal centers were tested in terms of catalytic activity in Meerwein-Ponndorf-Verley reaction and epoxidation reaction of cyclohexene. The results showed similar conversion rates comparing to materials synthesized under standard conditions. / [ES] La presente Tesis Doctoral esta dividida en dos partes que abarcan los campos de la química médica y la ciencia de los materiales respectivamente. En la primera parte se desarrolla la obtención de nuevos derivados del agente antitumoral 20-(S)-Camptotecina (CPT) y el estudio de sus propiedades biológicas en términos de actividad antitumoral, estabilidad y biodisponibilidad oral. Más concretamente se ha descrito la aplicación de la reacción de Tscherniac-Einhorn (T-E) como una metodología efectiva y de alto rendimiento para la obtención de una extensa variedad de derivados 9-amidometílicos y 9-imidometílicos de alto carácter lipofílico. Los resultados obtenidos mostraron que la introducción de un grupo alifático voluminoso tipo imida, en posición 9, junto con la metoxilación de la posición 10, proporcionaba elevada actividad antitumoral in vitro e in vivo y duplicaba los valores de absorción intestinal dentro de los ensayos de biodisponibilidad oral en comparación con derivados de CPT clínicamente aprobados. Más allá de la síntesis de nuevos análogos, la reacción de T-E se postula como una metodología eficaz para proporcionar nuevas funcionalizaciones en la posición 9, por ejemplo, se obtienen formilaciones o aminometilaciones con altos rendimientos frente a otras rutas sintéticas menos eficientes o erráticas para este tipo de modificaciones. Dentro de los procesos semisintéticos planteados, el derivado hexacíclico 9,10-[1,3]-DioxoCPT es sintetizado de forma cuantitativa, mostrando que la presencia del acetal cíclico mejora sustancialmente la permeabilidad del agente, tanto in vitro como in situ, manteniendo los rangos de actividad antitumoral. En la segunda parte de la presente Tesis Doctoral, dentro del campo interdisciplinar entre la biología y la síntesis de materiales, se ha desarrollado la síntesis de materiales micro- y mesoporosos en condiciones biomiméticas. El trabajo desarrollado en esta sección demuestra que moléculas pequeñas bifuncionales son capaces de hidrolizar y condensar monómeros de silicio, incorporando al mismo tiempo moléculas orgánicas capaces de actuar como agentes directores de estructura (ADS) dando lugar a materiales mesoestructurados. Al igual que el proceso biológico desarrolla la formación de estructuras inorgánicas mediante las proteínas conocidas como silicateinas, la mezcla de etanolamina y trometamina, simulan el mecanismo del centro activo de estas mismas proteínas, mediante una combinación sinérgica, donde la actividad tamponadora y catalítica es efectiva a la hora de incorporar y ordenar ADS en condiciones de pH neutro, presión atmosférica y en ausencia de fuente de energía externa. De esta manera, materiales micro- y mesoporosos tipo ZSM5 o MCM41, de alto interés en diferentes aplicaciones industriales, son obtenidos mediante un procedimiento sol-gel a pH neutro en oposición a las metodologías estándar que requieren condiciones fuertemente ácidas o alcalinas para la hidrólisis de los precursores de silicio. Las posibilidades de dicha metodología para la incorporación de centro activos metálicos fueron ensayadas en términos de actividad catalítica en reacciones tipo Meerwein-Ponndorf-Verley y reacciones de epoxidación de ciclohexeno. Los resultados mostraron porcentajes de conversión similares a los obtenidos con materiales sintetizados en condiciones convencionales. / [CA] La present Tesi Doctoral està dividida en dues parts que comprenen els camps de la química mèdica i la ciència dels materials, respectivament. En la primera part es desenvolupa l'obtenció de nous derivats de l'agent antitumoral 20-(S)-Camptotecina i l'estudi de les seues propietats biològiques en terms d'activitat antitumoral, estabilitat i biodisponibilitat oral. Més concretament s'ha descrit l'aplicació de la reacció de Tscherniac-Einhorn (T-E) com una metodologia efectiva i d'alt rendiment per a l'obtenció d'una extensa varietat de derivats 9-amidometilats i 9-imidometilats d'alt caràcter lipofilic. Els resultats obtinguts van mostrar que la introducció d'un grup alifàtic voluminós, tipus imida, en posición 9, junt amb la metoxilació de la posició 10, proporcionava elevada activitat antitumoral in vitro i in vivo i duplicava els valors d'absorció intestinal dins dels assajos de biodisponibilitat oral en comparació amb els derivats de CPT clínicament aprovats. Més enllà de la síntesi de nous anàlegs, la reacció de T-E es postula com una metodologia eficaç per a proporcionar noves funcionalitzacions en la posició 9, per exemple, s'obtenen formilacions o aminometilacions amb alts rendiments enfront d'altres rutes sintètiques menys efectives o erràtiques. Dins dels procesos semisintètics plantejats, el derivat hexaciclic 9,10-[1,3]-DioxoCPT es sintetitzat de forma quantitativa, mostrant que la presència de l'acetal cíclic millora substancialment la permeabilitat del fàrmac, tant in vitro com in situ, mantenint els rangs de activitat antitumoral de la CPT. En la segona part de la present Tesi Doctoral, dins del camp interdiciplinari entre la biología y la ciencia dels materials, s'ha desenvolupat la síntesi de materials micro i mesoporosos en condicions biomimètiques. El treball desenvolupat en aquesta secció demostra que molècules bifuncionals son capaços d'hidrolitzar i condensar monòmers de silici, incorporant al mateix temps molècules orgàniques capaces d'actuar com agents directors d'estructura (ADS) donant lloc a materials mesoestructurats. De la mateixa forma que el procés biològic desenvolupa la formació d'estructures inorgàniques per mitjà de les proteïnes conegudes com silicateines, la mescla d'etanolamine i trometamine, simulen el mecanisme del centre actiu d'aquestes mateixes proteïnes mitjançant una combinació sinèrgica, on l'activitat tamponadora i catalítica és efectiva a l'hora d'incorporar i ordenar ADS en condicions de pH neutre, pressió atmosfèrica i en absència de font d'energia externa. D'aquesta manera, materials micro- i mesoporosos tipus ZSM5 o MCM41, d'alt interés en diferents aplicacions industrials, són obtinguts per mitjà d'un procediment sol-gel a pH neutre en oposició a les metodologies estàndard que requereixen condicions fortament àcides o alcalines per a la hidrólisis dels precursors de silici. Les posibilitats d'aquesta metodología per a la incorporació de centres actius metàl¿lics van ser assajades en termes d'activitat catalítica en reaccions tipus Meerwein-Ponndorf-Verley i reaccions d'epoxidació de ciclohexen. Els resultats van mostrar percentatges de conversió semblants als obtingunts amb els materials sintetitzats en condicions convencionals. / Rodríguez Berna, G. (2016). Estudios semisintéticos y biológicos de 20-(S)-Camptotecina en terapia antitumoral y obtención de materiales porosos en condiciones biomiméticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62158