Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal. / Voltage-gated potassium channels are formed of four subunits, each one with six transmembrane segments (S1-S6) and a loop (p-loop) between S5 and S6 at the level of the pore. It is known that the voltage sensitive segment (S1-S4) undergoes a movement upon membrane potential changes. To open the channel, it is necessary to transfer the energy of the voltage sensor (generated by the displacement of the positive charges of S4) to the pore. The exact mechanism of this “electromechanical coupling” is still under investigation. The voltage sensor and pore are physically linked by the S4-S5 linker (S45L). The aim of this study is to determine the influence of S45L flexibility on the coupling process. In the S45L, three glycines are distributed at different positions and are responsible for the flexibility of the alpha-helix. These glycines (but not their exact position) are conserved within the potassium voltage-gated ion channels. The glycines were each replaced by an alanine using point mutagenesis. In a second step, a proline was introduced at the position in order to introduce a break in the helix. To study the behaviour of channels in this new conformation, we used the patch clamp technique to determine the effects during the pore opening (ionic current). With the cut-open voltage-clamp we determined the effects on voltage sensor movement (gating current) as well as the temporal correlation with the pore opening (ionic current). The data showed that when the flexibility of the S45L is reduced, the channel needs more energy to open. Exchange with proline suggests that the movement of the sensor is independent of pore opening.

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal. / Voltage-gated potassium channels are formed of four subunits, each one with six transmembrane segments (S1-S6) and a loop (p-loop) between S5 and S6 at the level of the pore. It is known that the voltage sensitive segment (S1-S4) undergoes a movement upon membrane potential changes. To open the channel, it is necessary to transfer the energy of the voltage sensor (generated by the displacement of the positive charges of S4) to the pore. The exact mechanism of this “electromechanical coupling” is still under investigation. The voltage sensor and pore are physically linked by the S4-S5 linker (S45L). The aim of this study is to determine the influence of S45L flexibility on the coupling process. In the S45L, three glycines are distributed at different positions and are responsible for the flexibility of the alpha-helix. These glycines (but not their exact position) are conserved within the potassium voltage-gated ion channels. The glycines were each replaced by an alanine using point mutagenesis. In a second step, a proline was introduced at the position in order to introduce a break in the helix. To study the behaviour of channels in this new conformation, we used the patch clamp technique to determine the effects during the pore opening (ionic current). With the cut-open voltage-clamp we determined the effects on voltage sensor movement (gating current) as well as the temporal correlation with the pore opening (ionic current). The data showed that when the flexibility of the S45L is reduced, the channel needs more energy to open. Exchange with proline suggests that the movement of the sensor is independent of pore opening.

Les ataxies épisodiques (EA) d’origine génétique sont un groupe de maladies possédant un phénotype et génotype hétérogènes, mais ont en commun la caractéristique d’un dysfonctionnement cérébelleux intermittent. Les EA de type 1 et 2 sont les plus largement reconnues des ataxies épisodiques autosomiques dominantes et sont causées par un dysfonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants dans les neurones. La présente étude se concentrera sur les mutations causant l'EA-1, retrouvées dans le senseur de voltage (VSD) de Kv1.1, un canal très proche de la famille des canaux Shaker. Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques de six mutations différentes à la position F244 et partiellement celles des mutations T284 A/M, R297 K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I et S412 C/I dans la séquence du Shaker grâce à la technique du ‘’cut open voltage clamp’’ (COVC). Les mutations de la position F244 situées sur le S1 du canal Shaker sont caractérisées par un décalement des courbes QV et GV vers des potentiels dépolarisants et modifient le couplage fonctionnel entre le domaine VSD et le pore. Un courant de fuite est observé durant la phase d'activation des courants transitoires et peut être éliminé par l'application du 4-AP (4-aminopyridine) ou la réinsertion de l'inactivation de type N mais pas par le TEA (tétraéthylamonium). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la stabilisation d’un état intermédiaire, nous avons étudié séparément la neutralisation des trois premières charges positives du S4 (R1Q, R2Q et R3Q). Il en est ressorti l’existence d’une interaction entre R2 et F244. Une seconde interface entre S1 et le pore proche de la surface extracellulaire agissant comme un second point d'ancrage et responsable des courants de fuite a été mis en lumière. Les résultats suggèrent une anomalie du fonctionnement du VSD empêchant la repolarisation normale de la membrane des cellules nerveuses affectées à la suite d'un potentiel d'action. / The genetic episodic ataxias form a group of disorders with heterogeneous phenotype and genotype, but share the common feature of intermittent cerebellar dysfunction. Episodic ataxia (EA) types 1 and 2 are most widely recognised amongst the autosomal dominant episodic ataxias and are caused by dysfunction of neuronal voltage-gated ion channels. The present study focuses on mutations causing EA-1 located in the voltage sensor domains (VSDs) of Kv1.1. A member of the Shaker channel family. Here, we have characterised the electrophysiological properties of six different mutations at the position of F244 and we also reported the partiality effects of these following mutations T284A/M, R297K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I S412C/I on Shaker sequence using the cut open voltage clamp technique (COVC). We have shown that mutations of F244 in the S1 of the Shaker Kv channel positively shift the voltage dependence of the VSD movement and alter functional coupling between VSD and pore domain. The mutations causing immobilization of the VSD movement during activation and deactivation and responsible for creating a leak current during activation, are removed by the application of 4-AP (4-aminopyridine) or by reinsertion of N-type inactivation but not by TEA (tetraethylamonium). Insights into the molecular mechanisms responsible for the stabilization of the intermediate state have been investigated by separately neutralizing the first three charges (R1Q, R2Q and R3Q) in the S4 segment. The result suggests an interaction between R2 and F244 mutants. It was established that a second co-evolved interface exists between S1 and the pore helix near the extracellular surface and it acts as a second anchor point. It is also responsible for generation of leak currents. The results suggest a dysfunction of the VSD in which the affected nerve cells cannot efficiently repolarize following an action potential because of altered delayed rectifier function

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP. / Voltage-gated ion channels are responsible for the initiation and propagation of action potentials in excitable cells. Several hereditary diseases (channelopathies) are associated with a defective voltage control by these channels, leading to arrhythmias, epilepsy, etc. Hence, establishing the exact structure/function relation for ion channels is crucial for the development of new specific therapeutic agents. Here, the bacterial voltage-gated potassium channel KvAP served as a model to study i) electromechanical coupling, ii) influence of lipids on the voltage dependent activity and iii) closed-state inactivation. To overcome the lack of structural information on the cytosolic side and of crystal structure in the closed state, we determined the S4-S5 linker movement during gating using fluorescence spectroscopy (LRET). We were able to control the conformational state of the channels by using lipids (phospholipids and non phospholipids) instead of voltage clamp. Based on these experimental constraints, a model in the closed state was produced, showing that a small 4Å radial displacement of the S4-S5 linker is sufficient to close the conduction pore. Interactions between lipids and membrane proteins play an important role in the regulation of ion channels activity but are not well characterized. We studied the influence of different lipids on KvAP voltage-dependent activation and showed two distinct effects related to different interactions sites: one bound to the voltage sensor, leading to a shift of the conductance-voltage curve, and another at the intracellular side near the pore region, affecting the steepness of this curve. We also showed that the exchange of lipids is very limited around KvAP and seems to be state dependent, occuring only when the channels are kept in the open state. KvAP has a slow inactivation atypical, accessible from the open state. We studied the effects of lipid composition and temperature on entry into inactivation and recovery. We also used voltage-clamp fluorometry in bilayers to investigate closed-state inactivation molecular basis. We identified a position at the bottom of the S4 helix that seems involved in the mechanism for slow inactivation and the extremely slow recovery from inactivation typically displayed by KvAP.

Les ataxies épisodiques (EA) d’origine génétique sont un groupe de maladies possédant un phénotype et génotype hétérogènes, mais ont en commun la caractéristique d’un dysfonctionnement cérébelleux intermittent. Les EA de type 1 et 2 sont les plus largement reconnues des ataxies épisodiques autosomiques dominantes et sont causées par un dysfonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants dans les neurones. La présente étude se concentrera sur les mutations causant l'EA-1, retrouvées dans le senseur de voltage (VSD) de Kv1.1, un canal très proche de la famille des canaux Shaker. Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques de six mutations différentes à la position F244 et partiellement celles des mutations T284 A/M, R297 K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I et S412 C/I dans la séquence du Shaker grâce à la technique du ‘’cut open voltage clamp’’ (COVC). Les mutations de la position F244 situées sur le S1 du canal Shaker sont caractérisées par un décalement des courbes QV et GV vers des potentiels dépolarisants et modifient le couplage fonctionnel entre le domaine VSD et le pore. Un courant de fuite est observé durant la phase d'activation des courants transitoires et peut être éliminé par l'application du 4-AP (4-aminopyridine) ou la réinsertion de l'inactivation de type N mais pas par le TEA (tétraéthylamonium). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la stabilisation d’un état intermédiaire, nous avons étudié séparément la neutralisation des trois premières charges positives du S4 (R1Q, R2Q et R3Q). Il en est ressorti l’existence d’une interaction entre R2 et F244. Une seconde interface entre S1 et le pore proche de la surface extracellulaire agissant comme un second point d'ancrage et responsable des courants de fuite a été mis en lumière. Les résultats suggèrent une anomalie du fonctionnement du VSD empêchant la repolarisation normale de la membrane des cellules nerveuses affectées à la suite d'un potentiel d'action. / The genetic episodic ataxias form a group of disorders with heterogeneous phenotype and genotype, but share the common feature of intermittent cerebellar dysfunction. Episodic ataxia (EA) types 1 and 2 are most widely recognised amongst the autosomal dominant episodic ataxias and are caused by dysfunction of neuronal voltage-gated ion channels. The present study focuses on mutations causing EA-1 located in the voltage sensor domains (VSDs) of Kv1.1. A member of the Shaker channel family. Here, we have characterised the electrophysiological properties of six different mutations at the position of F244 and we also reported the partiality effects of these following mutations T284A/M, R297K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I S412C/I on Shaker sequence using the cut open voltage clamp technique (COVC). We have shown that mutations of F244 in the S1 of the Shaker Kv channel positively shift the voltage dependence of the VSD movement and alter functional coupling between VSD and pore domain. The mutations causing immobilization of the VSD movement during activation and deactivation and responsible for creating a leak current during activation, are removed by the application of 4-AP (4-aminopyridine) or by reinsertion of N-type inactivation but not by TEA (tetraethylamonium). Insights into the molecular mechanisms responsible for the stabilization of the intermediate state have been investigated by separately neutralizing the first three charges (R1Q, R2Q and R3Q) in the S4 segment. The result suggests an interaction between R2 and F244 mutants. It was established that a second co-evolved interface exists between S1 and the pore helix near the extracellular surface and it acts as a second anchor point. It is also responsible for generation of leak currents. The results suggest a dysfunction of the VSD in which the affected nerve cells cannot efficiently repolarize following an action potential because of altered delayed rectifier function