En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método de purificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G-100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C-50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4 veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un Km de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl- y Br-. En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados en placas de agar- sangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg. / --- In the present research some biochemical and biological characteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzyme was recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAGE-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl- and Br- ions. The biological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice. / Tesis

Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition. / Tesis

Se ha aislado una enzima similar a trombina del veneno de la serpiente peruana Bothrops barnetti mediante dos pasos cromatográficos sobre CM Sephadex C-50 y Sephadex G-100, en ambos casos utilizando Acetato de Amonio 0,05 M a pH 5,0. La enzima fue purificada 45 veces con un rendimiento de 14% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 52 kDa en condiciones reductoras con 2β-Mercaptoetanol y de 48 kDa en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptidica con al menos un enlace disulfuro. El tratamiento con N- glicosidasa (PNGasa F) determinó que es una glicoproteína con un 45% de contenido total de carbohidratos. La enzima mostró tener actividad coagulante sobre plasma citratado y fibrinógeno y actividad amidásica sobre BApNA y Chromozym TH, La potencia coagulante sobre fibrinógeno bovino fue equivalente a 131 unidades NIH de trombina/mg. La enzima es inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya calificándola como una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,0 y es estable hasta los 40 ºC. Se demostró mediante inmunoelectroforesis e inmunodifusión la antigenicidad de la enzima frente al suero antibotrópico polivalente sobre plasma citratado (DE: 250 µl de antiveneno/ mg de enzima). Palabras clave: Veneno, serpiente, enzima similar a trombina, Bothrops barnetti, coagulante. / A thrombin- like enzyme was purified from Bothrops barnetti peruvian snake venom using CM Sephadex C-50 followed by Sephadex G-100, in both two cases with 0,05 M Amonium Acetate buffer pH 5,0. The enzyme was purified 45 fold with 14% of yield and the PAGE-SDS showed only protein band of 52 kDa under reducing condition with 2β-Mercaptoetanol and 48 kDa under non reducing condition indicating that the enzyme has a single polypeptide chain with disulfide bond. The PNGase treatment showed that it is a basic glycoprotein containing 45% total carbohydrates. The enzyme has coagulant activity on fibrinogen and citrated plasma and amidolytic activity on BApNA and Chromozym TH. The coagulant potency was equivalent to 131 NIH thrombin Units/ mg. In addition the enzyme is inhibited by PMSF and soybean trypsin inhibitor suggesting that is a serine proteinase. The enzyme had optimal amidolytic activity pH was 8,0 and is stable until 40 ºC. The antigenicity and neutralization of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis with the polyvalent antibothropic serum on citrated plasma (ED: 250 µl of antivenom/ mg of enzyme). Key words: Venom, snake, enzyme, thrombin like, Bothrops barnetti, coagulant.

Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition.

Se han determinado las principales propiedades bioquímicas e inmunológicas de la enzima similar a trombina (EST) de la serpiente peruana Bothrops atrox (“jergón”). Para este fin, la enzima fue purificada hasta la homogeneidad utilizando tres pasos cromatrográficos en Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB. Asimismo, se determinó el peso molecular por PAGE-SDS y el porcentaje de carbohidratos asociados mediante hidrólisis y análisis de hexosas, hexosaminas y ácido siálico. Luego se ensayaron las actividades fibrinocoagulante, amidolítica y esterásica, sobre fibrinógeno bovino, BApNA y BAEE, respectivamente, así como la hidrólisis sobre los sustratos cromogénicos S-2238, S-2251 y S-2266 y finalmente se realizó la identificación de la enzima aislada mediante la técnica de peptide mass fingerprinting. Para el análisis inmunoquímico, se inmunizaron conejos albinos con 150 µg de la enzima purificada a fin de obtener un suero hiperinmune anti-EST de B. atrox. Posteriormente se analizaron los patrones de reactividad inmunológica del suero contra la enzima purificada y los venenos de Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus mediante la técnica de ELISA. Como resultado del análisis bioquímico se determinó que la enzima constituye el 1.7% del veneno completo, siendo purificada 25.5 veces y con un rendimiento del 43.3% utilizando BApNA como sustrato. La enzima presenta un peso molecular de 29.6 kDa, del cual el 14.2% lo constituyen los carbohidratos asociados, asimismo la EST de B. atrox produjo coagulación del fibrinógeno bovino y presentó actividad sobre BAEE, BApNA, S-2238 y S-2266, siendo incapaz de hidrolizar el sustrato S-2251. El análisis mediante espectrometría de masas de los péptidos obtenidos por la hidrólisis de la EST de B. atrox permitieron relacionarla con la proteína venombina A, presentando una homología en secuencia del 75% con esta proteína. Al finalizar el protocolo de inmunización se obtuvo un suero hiperinmune anti-EST de B. atrox con un título de 64000, siendo evidencia del potencial inmunogénico de esta proteína. Por otro lado, los anticuerpos producidos reaccionaron de forma cruzada con los venenos completos de B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%) y en menor intensidad con los de L. muta y C. durissus, con valores de 5.1% y 4.8%, respectivamente. / We have determinated the main biochemical and immunological properties of a thrombin-like enzyme (TLE) isolated from Bothrops atrox Peruvian snake venom (“jergón”). In this concern, TLE was purified until homogeneity using three chromatographical steps on Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 and Agarose-PAB. Furthermore, molecular weight was determinate by PAGE-SDS and associated carbohydrates by hydrolysis and analysis of hexoses, hexosamines and sialic acid. Then, fibrinocoagulant, amidolytic and sterasic activities were measured on bovine fibrinogen, BApNA and BAEE, respectively, hydrolysis on S-2238, S-2251 and S-2266 chromogenic substrates, and finally molecular identity of this enzyme was determinated by peptide mass fingerprinting technique. For the immunochemical analyses, white rabbits were immunized with 150 µg of EST and a hyperimmune serum anti-TLE was obtained. Patterns of immunological reactivity were determined between this serum against TLE and venoms of Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus using ELISA technique. As a result of biochemical analysis, we determined that this enzyme represents 1.7% of total venom and was 25.5-fold purified with a 43.3% yield, using BApNA as substrate. This enzyme had 29.6 kDa, where 14.2% was associated carbohydrates. The TLE of B. atrox produced coagulation of bovine fibrinogen and had enzymatic activity on BAEE, BApNA, S-2238 and S-2266, being unable to act on S-2251. Mass spectrometry analysis of hydrolyzed EST of B. atrox results on a 75% sequence homology with venombin A protein. At the final of immunization protocol, we obtained an anti-TLE hyperimmune serum with a title of 64000, which showed the potential immunogenicity of this protein. On the other hand, raised antibodies cross-reacted with total venoms of B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%) and with less intensity with those from L. muta and C. durissus (5.1% and 4.8%, respectively).

En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método de purificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G-100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C-50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4 veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un Km de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl- y Br-. En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados en placas de agar- sangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg. / In the present research some biochemical and biological characteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzyme was recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAGE-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl- and Br- ions. The biological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice.

Purifica la isoforma ácida presente en el veneno de Bothrops pictus mediante el uso de dos pasos cromatográficos: CM Sephadex C-50 seguido de Superdex 75 10/300 GL, lográndose un rendimiento de 7.5% y un factor de purificación de 19.8 veces. Se obtiene una sola banda con un peso molecular de 16.6 kDa en condiciones reductoras y 15.2 kDa en condiciones no reductoras empleando la técnica de PAGE-SDS. Se determina el peso molecular en solución mediante la técnica de dynamic light scattering obteniéndose una única población de proteínas monodispersa de radio hidrodinámico de 4.254 ± 0.778 (nm) correspondiente a un peso molecular de 19.7 ± 3.7 kDa. La enzima BpicPLA2ácida es altamente termoestable debido a que mantiene casi intacta su actividad incluso después de incubarla por 10 min a 100 ⁰C. El ion que incrementa en mayor medida su actividad es el calcio y el agente con mayor inhibición es el ditiotreitol. Los estudios de dicroísmo circular demostraron que la estructura secundaria predominante en la BpicPLA2ácida son las α hélices. La secuencia de aminoácidos de BpicPLA2ácida tomada del GenBank muestra la presencia de un sitio catalítico (His48, Asp49, Tyr52 y Asp99) conservado, mientras que el sitio de unión a calcio no es completamente conservado, debido a una mutación en la posición 28 de la tirosina por fenilalanina. El modelo de la estructura tridimensional reportado, demuestra que la isoforma BpicPLA2ácida es una enzima que pertenece a la familia de las fosfolipasas A2 de la clase II y que además presenta una mayor relación evolutiva con otras PLA2 ácidas. / Tesis

La presente propuesta para el lanzamiento del Centro Especializado en Animales Silvestres identifica la demanda latente e insatisfecha de un espacio académico–científico de animales silvestres para el desarrollo integral de los programas de medicina veterinaria, zootecnia, biología, ecoturismo, ingeniería ambiental, ingeniería forestal, ciencias ambientales, salud pública y demás carreras que incluyan el estudio de fauna silvestre en sus planes de estudio. El centro iniciará sus operaciones con el estudio de una especie muy exótica, los ofidios (serpientes venenosas y no venenosas). A mediano y largo plazo, se buscará crecer a través del desarrollo de productos. A partir del segundo año, se incluirá el estudio de otros reptiles, tales como las iguanas y las tortugas. Para el tercer año, se ampliará al estudio de ranas y lagartos de la selva amazónica peruana.

El ofidismo como problemática de salud en el Perú, requiere ser atendido con estudios dirigidos a optimizar la acción de los antivenenos producidos comercialmente y además, desarrollar nuevas tecnologías destinadas a este propósito. En este aspecto, la producción de inmunoglobulina Y específica (IgY) de origen aviar es una alternativa frente a los antivenenos equinos, y es el tema en la presente investigación. Se inmunizaron gallinas ponedoras de la raza Light Brown Leghorn con 500 µg del veneno de Bothrops atrox, emulsificado con adyuvante de Freund, siguiendo la aparición de anticuerpos en suero con la técnica de inmuno difusión doble. Los anticuerpos aviares fueron aislados de la yema de huevos que contenían los niveles más altos de IgY específica, determinados previamente por la técnica de ELISA, utilizando precipitación negativa con ácido caprílico y un paso adicional de precipitación positiva con sulfato de amonio. La masa de anticuerpos recuperados fue de 8,5 ± 1,35 mg/mL de yema habiéndose determinado en 8,3% la cantidad de IgY específica mediante cromatografía de afinidad en una columna de Sepharosa 4B-veneno. El antiveneno aviar tuvo una DE50 de 575 µL de antiveneno/mg de veneno y una potencia de 1,74 mg de veneno/mL de antiveneno aviar. Asimismo, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de Bothrops brazili comparte más epítopes comunes con el veneno de Bothrops atrox ya que se obtuvo un valor de 46% de reactividad cruzada en tanto que los venenos de Bothrops pictus y Bothrops barnetti tuvieron valores de 41% y 37% respectivamente; se encontró además que los venenos de Crotalus durissus (12%) y Lachesis muta (19%) tuvieron una baja reactividad cruzada con el veneno en estudio. / Ofidism as a health problem in Perú requires to be attended either optimizing commercial antivenom potency and developing news technologist on this. Production of specific avian immunoglobulin Y is an alternative in relationship IgG horse antibodies, which is the main point of this research. Laying Light Brow Leghorn chickens were immunizated with 500 µg of Bothrops atrox snake venom emulsificated with Complete Freund’s adjuvant, and the IgY antibodies production was evaluated with the double immunodiffusion method. The avian antibodies were isolated from egg yolk which contained high level of specific IgY, calculated by ELISA method. Using caprylic acid negative precipitation and ammonium sulfate positive precipitation, mass antibodies recovery was 8,5 ± 1,35 mg/ml of yolk and after step on sepharosa 4B-venom affinity chromatographic, specific IgY recovery was 8,3% . The avian antivenom had a ED50: 575 µL antivenom/mg of venom and potency was 1,74 mg of venom/ml of avian antivenom. In addition, the crossing reactivity assays showed that Bothrops brazili venom share more common epitope with Bothrops atrox venom with a value of 46% of crossing reactivity whilest the Bothrops pictus and Bothrops barnetti venoms had values of 41% and 37% respectly; in contrast the venoms of Crotalus durissus (12%) and Lachesis muta (19%) had low crossing reactivity with Bothrops atrox venom.

En la presente investigación se estudian las propiedades, bioquímicas, biológicas, inmunológicas y moleculares de una isoforma básica de Fosfolipasa A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta(PLA2básicaL.muta). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, filtración y de alta performance; la enzima fue purificada 41,2 veces con un rendimiento de 64%. Se obtuvo una única banda proteica de 14,7 kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrando ser una proteína monomérica. Su pH óptimo es de 7,8 y es fuertemente inhibida por el PMSF, EDTA y glutatión. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo la dosis hemolítica media (DH50) en 4,35µg, la dosis miotóxica mínima (DMM) en 18,96µg/ml y la dosis edemática mínima (DEM) 23,56μg. La enzima no mostró actividad hemorrágica ni acción anticoagulante. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2básicaL.muta es reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilachésico (INSPerú). Empleando la metodología de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa del cDNA de PLA2básicaL.muta, con 445 pb; análisis bioinformáticos indican que la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleótidos que codifica un péptido señal de 16 aminoácidos y una proteína madura de 122 residuos, el peso molecular fue de 13,86 kDa y un pI de 8,316. La secuencia aminoacídica, contiene residuos conservados para el sitio catalítico, His48, Asp49, Tyr52 así como para unión al Ca+2, Tyr18, Gly30 y Gly32. El modelaje tridimensional de la PLA2, muestra que está formada por tres hélices-, una lámina- y un lazo de unión al Ca+2. PLA2básicaL.muta mostró alta homología estructural con otras sPLA2 de venenos de serpientes. Finalmente, los estudios revelan que la PLA2básicaL.muta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] básicas de bajo peso molecular. Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y función de una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana. Palabras claves: Fosfolipasa A2, Isoenzima, Lachesis muta, sitio farmacológico, transcrito. / --- In the present research the biochemical, biological, immunological, as well as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicL.muta), were studied. This enzyme was purified using ion exchange, filtration and high performance chromatographical steps, respectively. The enzyme was purified 41,2 times with a yield of 64%. SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 14,7 kDa under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single polypeptide chain. Furthermore, the enzyme had a optimal pH of 7,8 and was inhibited by PMSF, EDTA and glutation. In relation to its biologic activity, a Medium Hemolytic Doses (DH50) of 4,35µg/tube, Minimum Miotoxic Doses (MMD) of 18,96µg/ml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 91,5μg were obtained. For another hand, the PLA2 didn´t show either hemorrhagic or anticoagulant activities, and was recognized and partially inhibited by monovalent antilachesic serum (INS-Perú) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Using RT-PCR methodology and bioinformátics analysis the complete cDNA sequence of PLA2basicL.muta with 445 bp and an open reading frames of 414 nucleotides, were obtained, which encodes a peptide signal of 16 amino acids and a matured protein of 122 residues with 13, 86 kDa and a pI value of 8,3, calculated by in silico analysis. The amino acidic sequence contains conserved residues of His48, Asp49, Tyr52 in the catalytic site, as well as Tyr18, Gly30 y Gly32 in the Ca+2 -binding site. Three-dimensional model of PLA2basicL.muta showed that was conformed by three α-helix, one β-sheet and one Ca+2 -binding ribbon. PLA2basicL.muta shows a high structural homology with other snake venom phospholipases. Finally, studies reveal that PLA2basicL.muta belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49]. This work is the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom enzyme. Key words: Phospholipase A2, Isoenzyme, Lachesis muta, pharmacologic site, transcript. / Tesis