El envenenamiento por la serpiente Lachesis muta presenta una fisiopatología compleja debido a la presencia de un numeroso grupo de enzimas como la fosfolipasa A2 (FLA2). Por ello, en el presente estudio se ha investigado algunas propiedades bioquímicas de la FLA2 y sus efectos biológicos in vitro e in vivo. Inicialmente la enzima fue purificada mediante dos pasos cromatográficos un CM-Sephadex C-50 seguido por un Sephadex G-50, obteniéndose un factor de purificación de 55.3 veces con un rendimiento de 34.1% y se obtuvo una única banda proteica de 18749 Da, empleando la técnica de PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrándose que la FLA2 es una proteína monomérica. La enzima es termoestable manteniendo su actividad total a 100°C por 10 minutos, es además una enzima dependiente del ion calcio y es fuertemente inhibida por glutation, cisteína, EDTA y PMSF reduciendo su actividad hasta más del 50%. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo que la Dosis hemolítica media (DH50) es 4.35µg y de 67.6µg para la enzima pura y el veneno respectivamente por lo que FLA2 es 15.5 veces más hemolítica que el veneno total. Así mismo se ha demostrado que la dosis miotóxica mínima (DMM) fue muy baja con un valor de 125, 89 μg/ml mientras que para el veneno crudo fue de 144,21 μg/ml. Además, la dosis edemática mínima (DEM) de la enzima fue 91.5 μg. Por otra parte la enzima no mostró actividad hemorrágica usando hasta 30 μg pero en cambio, si mostró tener acción anticoagulante retardando el tiempo de coagulación del plasma citratado a medida que se incremento la concentración de FLA2. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que FLA2 tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú), así como una neutralización parcial de la actividad enzimática y hemolítica por acción de dicho suero antiofídico. / The Lachesis muta’s envenomations induce a complex physiopathology due to the presence of numerous enzymes group such as Phospholipase A2 (PLA2). For this reason, in the present study have been investigated some biochemistries’ properties of PLA2 and its in vitro and in vivo biologics effect. Initially, the enzyme was purified in two chromatographics steps, CM-Sephadex C-50 followed by Sephadex G-50, obtaining a purification factor of 55.3 times and with a yield of 34.1% and a unique protein band of 18749 Da was obtained by SDS-PAGE analysis under reducing and non-reducing conditions, indicating that PLA2 is a monomeric protein. The protein is thermostable maintaining its total activity until 100ºC per 10 minutes, so, it is a Calcium ion depending protein and the activity was strongly inhibited by glutation, cistein, ESTA and PMSF which reduce until more 50% of PLA2 activity. As far as its biologic activity was obtain that Media Hemolytic Doses (DH50) was 4.35µg and 67.6µg to pure enzyme and crude venom respectively, this indicate that PLA2 is 15,5 times more hemolytic than crude venom. Likewise, had demonstrated that Minimum Miotoxic Doses (MMD) is very low to PLA2 (125. 89 μg/ml) while to crude venom was 144,21 μg/ml. The enzyme’s Minimum Edematic Doses (MED) was 91.5 μg. For another hand, the PLA2 didn´t show any hemorrhagic activity until 30 μg but it showed has anticoagulant activity on citrated plasma when the PLA2 concentration was increasing. Additionally, the inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis probes showed PLA2 had inmunogenic reactivity against anti lachesic nonovalent serum (INS-Perú), as well as a partial enzymatic activity and hemolytic neutralization. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Describe la purificación y caracterización bioquímica, estructural y funcional del principio coagulante del veneno de la serpiente endémica del Perú Bothrops pictus, denominada pictobina. La enzima es purificada por la combinación de tres pasos cromatográficos, empleando intercambio catiónico CM-Sephadex C-50 seguida de dos pasos de filtración molecular en Sephadex G-100 y Sephadex G-75 respectivamente. La Pictobina es una glicoproteína monomérica con una masa molecular de 49 kDa medida por PAGE-SDS bajo condiciones reductoras y de 41 kDa por MALDI-TOF-TOF. El contenido de carbohidratos es de aproximadamente 45% de la masa y pueden ser removidos por deglicosilación con PNGasa F. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25.76%), hexosaminas (13.12%) y ácido siálico (0.76%). La secuencia N-terminal (VIGGDECNINEHRFLAFTYS) muestra semejanza con las enzimas similares a trombina. La Pictobina tiene actividad coagulante sobre plasma humano y fibrinógeno humano y bovino. La actividad coagulante específica de la enzima es equivalente a 131.1 NIH U/mg de trombina liberando solo el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano y tuvo un efecto defibrinogenante en roedores. La enzima produce una malla de fibrina porosa visualizada por microscopía electrónica de barrido, así como agregación plaquetaria. La Pictobina posee actividad catalítica sobre los sustratos sintéticos BApNA, S-2266, S-2302, S-2160 y S-2238. El tripéptido sintético D-Val-Leu-Arg-pNa el cual es considerado como el mejor sustrato. La actividad amidolítica es inhibida por PMSF, DTT y 2-β mercaptoetanol. La enzima muestra estabilidad a diferentes temperaturas (25 a 55°C), valores de pH (5.0 a 11.0) o en presencia de iones (Mg+2, Mn+2, Ca+2, Na+ y K+) pero es inhibida por el Zn+2. La enzima interacciona con el inhibidor endógeno α:2-macroglobulina y con el suero antibotrópico polivalente. La deglicosilación de la enzima produjo alteración en la actividad y el reconocimiento del antiveneno. El cDNA de la Pictobina (760 pb) codifica una proteína madura de 233 aminoácidos que conserva dominios estructurales con otras enzimas similares a trombina como el sitio catalítico (His40, Asp89 y Ser179) y los sitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Se identifican tres motivos para la N glicosilación. El modelamiento de la Pictobina revela un plegamiento tipo quimotripsina presentando un bolsillo hidrofóbico sobre su superficie, involucrado en el reconocimiento del sustrato y un importante bucle 90’s clave en la restricción del sitio catalítico. Los análisis de interacción molecular revelan que los residuos Phe194 y Trp195 de la Pictobina forman una interacción estable con los residuos Gly13, Gly14 y Val15 del fibrinopéptido A posicionando el puente de los residuos Arg16 y Gly17 del sustrato para el clivaje en el sitio catalítico. Tomando en conjunto estos resultados, se concluye que Pictobina es una enzima similar a trombina presente en el veneno de la serpiente Bothrops pictus. / Tesis

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops pictus “Jergón de costa” (BpicLAAO), mediante cromatografía de filtración molecular sobre Sephadex G-100, seguida de una cromatografía de intercambio catiónico sobre CM Sephadex C-50, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 22,02 veces con una actividad específica de 4,25 U/mg. La pureza de la proteína fue evaluada por HPLC en fase reversa y mediante PAGE-SDS. Es una proteína ácida conteniendo 18,7 % de carbohidratos asociados, con un peso molecular de 132,27 kDa, por cromatografía de filtración y de 65,2 y 58,6 kDa por PAGESDS bajo condiciones reductoras y no reductoras respectivamente, evidenciando que se trata de una enzima homodimérica con al menos un puente disulfuro intracatenario, el cual es importante para su actividad. El peso de la enzima disminuyó a 47 kDa después del tratamiento con PNGasa F. La enzima mostró un pH óptimo de 8,5 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; tolera hasta los 55 ºC. La actividad enzimática disminuyó considerablemente en presencia de Zn2+, glutatión y 2-mercaptoetanol, lo que sugiere la presencia de por lo menos un puente disulfuro intracatenario para su actividad. BpicLAAO presenta actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos siendo la dosis hemorrágica mínima de 2,79 μg de proteína, produce edema, habiéndose calculado la dosis edemática mínima en 7,80 μg de proteína; también inhibe la agregación plaquetaria inducida por ADP de una manera dosis dependiente. El efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció sobre cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, observándose que las Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Se demostró la antigenicidad de la enzima por inmunodifusión e inmunoelectroforesis, usando suero antibotrópico polivalente. Asímismo mediante el análisis molecular a partir de las secuencias de cDNA de LAAO de B. pictus se obtuvo una secuencia de 1494 pb que codifica un péptido señal y una proteína madura de 487 residuos aminoacìdicos. BpicLAAO, muestra homología con otras enzimas similares de venenos de serpientes habiéndose identificado los aminoácidos correspondientes a los dominios de unión al FAD, de unión al substrato y el dominio helicoidal. Encontrándose además dos motivos para N-glicosilación. Palabras clave: enzima, flavoproteína, N-glicosilación, secuencia nucleotídica, serpiente, veneno. / Tesis

El envenenamiento por la serpiente Lachesis muta presenta una fisiopatología compleja debido a la presencia de un numeroso grupo de enzimas como la fosfolipasa A2 (FLA2). Por ello, en el presente estudio se ha investigado algunas propiedades bioquímicas de la FLA2 y sus efectos biológicos in vitro e in vivo. Inicialmente la enzima fue purificada mediante dos pasos cromatográficos un CM-Sephadex C-50 seguido por un Sephadex G-50, obteniéndose un factor de purificación de 55.3 veces con un rendimiento de 34.1% y se obtuvo una única banda proteica de 18749 Da, empleando la técnica de PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrándose que la FLA2 es una proteína monomérica. La enzima es termoestable manteniendo su actividad total a 100°C por 10 minutos, es además una enzima dependiente del ion calcio y es fuertemente inhibida por glutation, cisteína, EDTA y PMSF reduciendo su actividad hasta más del 50%. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo que la Dosis hemolítica media (DH50) es 4.35µg y de 67.6µg para la enzima pura y el veneno respectivamente por lo que FLA2 es 15.5 veces más hemolítica que el veneno total. Así mismo se ha demostrado que la dosis miotóxica mínima (DMM) fue muy baja con un valor de 125, 89 μg/ml mientras que para el veneno crudo fue de 144,21 μg/ml. Además, la dosis edemática mínima (DEM) de la enzima fue 91.5 μg. Por otra parte la enzima no mostró actividad hemorrágica usando hasta 30 μg pero en cambio, si mostró tener acción anticoagulante retardando el tiempo de coagulación del plasma citratado a medida que se incremento la concentración de FLA2. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que FLA2 tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú), así como una neutralización parcial de la actividad enzimática y hemolítica por acción de dicho suero antiofídico. / The Lachesis muta’s envenomations induce a complex physiopathology due to the presence of numerous enzymes group such as Phospholipase A2 (PLA2). For this reason, in the present study have been investigated some biochemistries’ properties of PLA2 and its in vitro and in vivo biologics effect. Initially, the enzyme was purified in two chromatographics steps, CM-Sephadex C-50 followed by Sephadex G-50, obtaining a purification factor of 55.3 times and with a yield of 34.1% and a unique protein band of 18749 Da was obtained by SDS-PAGE analysis under reducing and non-reducing conditions, indicating that PLA2 is a monomeric protein. The protein is thermostable maintaining its total activity until 100ºC per 10 minutes, so, it is a Calcium ion depending protein and the activity was strongly inhibited by glutation, cistein, ESTA and PMSF which reduce until more 50% of PLA2 activity. As far as its biologic activity was obtain that Media Hemolytic Doses (DH50) was 4.35µg and 67.6µg to pure enzyme and crude venom respectively, this indicate that PLA2 is 15,5 times more hemolytic than crude venom. Likewise, had demonstrated that Minimum Miotoxic Doses (MMD) is very low to PLA2 (125. 89 μg/ml) while to crude venom was 144,21 μg/ml. The enzyme’s Minimum Edematic Doses (MED) was 91.5 μg. For another hand, the PLA2 didn´t show any hemorrhagic activity until 30 μg but it showed has anticoagulant activity on citrated plasma when the PLA2 concentration was increasing. Additionally, the inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis probes showed PLA2 had inmunogenic reactivity against anti lachesic nonovalent serum (INS-Perú), as well as a partial enzymatic activity and hemolytic neutralization.

El ofidismo como problemática de salud en el Perú, requiere ser atendido con estudios dirigidos a optimizar la acción de los antivenenos producidos comercialmente y además, desarrollar nuevas tecnologías destinadas a este propósito. En este aspecto, la producción de inmunoglobulina Y específica (IgY) de origen aviar es una alternativa frente a los antivenenos equinos, y es el tema en la presente investigación. Se inmunizaron gallinas ponedoras de la raza Light Brown Leghorn con 500 µg del veneno de Bothrops atrox, emulsificado con adyuvante de Freund, siguiendo la aparición de anticuerpos en suero con la técnica de inmuno difusión doble. Los anticuerpos aviares fueron aislados de la yema de huevos que contenían los niveles más altos de IgY específica, determinados previamente por la técnica de ELISA, utilizando precipitación negativa con ácido caprílico y un paso adicional de precipitación positiva con sulfato de amonio. La masa de anticuerpos recuperados fue de 8,5 ± 1,35 mg/mL de yema habiéndose determinado en 8,3% la cantidad de IgY específica mediante cromatografía de afinidad en una columna de Sepharosa 4B-veneno. El antiveneno aviar tuvo una DE50 de 575 µL de antiveneno/mg de veneno y una potencia de 1,74 mg de veneno/mL de antiveneno aviar. Asimismo, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de Bothrops brazili comparte más epítopes comunes con el veneno de Bothrops atrox ya que se obtuvo un valor de 46% de reactividad cruzada en tanto que los venenos de Bothrops pictus y Bothrops barnetti tuvieron valores de 41% y 37% respectivamente; se encontró además que los venenos de Crotalus durissus (12%) y Lachesis muta (19%) tuvieron una baja reactividad cruzada con el veneno en estudio. / Ofidism as a health problem in Perú requires to be attended either optimizing commercial antivenom potency and developing news technologist on this. Production of specific avian immunoglobulin Y is an alternative in relationship IgG horse antibodies, which is the main point of this research. Laying Light Brow Leghorn chickens were immunizated with 500 µg of Bothrops atrox snake venom emulsificated with Complete Freund’s adjuvant, and the IgY antibodies production was evaluated with the double immunodiffusion method. The avian antibodies were isolated from egg yolk which contained high level of specific IgY, calculated by ELISA method. Using caprylic acid negative precipitation and ammonium sulfate positive precipitation, mass antibodies recovery was 8,5 ± 1,35 mg/ml of yolk and after step on sepharosa 4B-venom affinity chromatographic, specific IgY recovery was 8,3% . The avian antivenom had a ED50: 575 µL antivenom/mg of venom and potency was 1,74 mg of venom/ml of avian antivenom. In addition, the crossing reactivity assays showed that Bothrops brazili venom share more common epitope with Bothrops atrox venom with a value of 46% of crossing reactivity whilest the Bothrops pictus and Bothrops barnetti venoms had values of 41% and 37% respectly; in contrast the venoms of Crotalus durissus (12%) and Lachesis muta (19%) had low crossing reactivity with Bothrops atrox venom.

Expresa y purifica anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) en Escherichia coli y evaluar su capacidad para neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción pesada del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox, en ratones de laboratorio. Se analizaron 18 Nb expresados y purificados en E. coli para determinar su capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica empleando ratones de laboratorio. Para esto se realizó un fraccionamiento del veneno de serpiente Bothrops atrox por cromatografía de exclusión molecular sobre resina Sephadex G-100 y se seleccionó una fracción de alto peso molecular con actividad hemorrágica. Se evaluó la dosis hemorrágica mínima (DHM) en el veneno crudo (0.810 μg) y en la fracción (0.433 μg) la cual representó 1.87 veces superior a la del veneno crudo; luego se evaluó la dosis eficaz 50% (DE 50) para cada Nb usando como dosis reto 4 DHM. Se encontró que 6 Nb tienen capacidad neutralizante además uno de ellos tiene una dosis eficaz 50% contra el efecto hemorrágico muy efectivo de 2247 μL de antiveneno/mg de veneno. También se evaluó la neutralización de la citotoxicidad de algunos Nb. Se concluye que algunos de los anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) obtenidos en este estudio, son capaces de neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción del veneno de la serpiente peruana B. atrox. Hay Nb que pueden ser usados para la formulación de un antídoto recombinante efectivo y económico. / Tesis

Reporta un estudio a nivel bioquímico, biológico, funcional y estructural de la enzima hialuronidasa del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergon de la selva”, denominada, Hyal-Ba. Se utilizaron tres pasos cromatográficos para purificar esta enzima, empleando como primer paso una columna de intercambio iónico sobre DEAE Sephadex A-50 seguido de una columna de exclusión molecular sobre Sephadex G-100 y finalmente una columna de Sephadex G-75, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0.05 M pH 5. El rendimiento de la actividad de Hyal-Ba fue de 29.59 % con un incremento de 36 veces la actividad específica. La enzima representa el 0.86% del contenido total de proteínas en el veneno de B. atrox. Los análisis de SDSPAGE, HPLC y N- Terminal confirman el alto grado de pureza de la enzima. Mediante PAGE-SDS esta enzima mostró 1 banda principal de 69 kDa de peso molecular y su pH óptimo fue de 6.0. A temperatura ambiente la actividad enzimática llega ser nula a las 144 horas. La actividad enzimática se incrementó un 40 % por la adición del ion magnesio (150 mM) y fue inhibida en un 97 y 88 % por EDTA y TLCK (12 mM) respectivamente. En las pruebas biológicas de toxicidad, hemorrágica y edemática se observa que la enzima carece de actividad tóxica, pero incrementa la acción hemorrágica del veneno total sobre la piel de los ratones albinos, no obstante, Hyal-Ba bajo la actividad edemática al disminuir significativamente el edema cuando fue agregada junto con la LAAO. También se midió su inmunoreactividad frente al antiveneno botrópico polivalente por inmunodifusión. Para el análisis de la secuencia nucleotídica de Hyal-Ba se realizaron protocolos de extracción, purificación y obtención de mRNA a partir de veneno fresco, luego su conversión en cDNA y su posterior amplificación por PCR. Los estudios moleculares in silico identificaron una secuencia de 2020 pb que codifica una proteína madura de 429 aminoácidos. Adicionalmente el análisis de su estructura primaria reveló 50 kDa como peso molecular y 9.19 como punto isoeléctrico. Se encontró además 6 probables sitios de N-glicosilación (Asn67, Asn103, Asn111, Asn153, Asn357y Asn401). / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú), según contrato N° 131-FINCyT-IB-2013. / Tesis