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The Tec family tyrosine kinases Itk, Tec and Rlk are expressed in T cells. Previous studies have established that these kinases are critical for TCR signaling, leading to the activation of PLCγ1. To further understand the functions of Tec kinases in T cell activation, we took three different approaches. First, we performed a thorough analysis of CD28-mediated signaling events and functional responses with purified naïve T cells from Itk-/- mice and a highly controlled stimulation system. Data from this set of studies definitively demonstrate that CD28 costimulation functions efficiently in naïve CD4+ T cells in the absence of Itk. Second, in order to further study the functions of Tec kinases in vivo, we generated transgenic mouse lines expressing a kinase-dead (KD) mutant of Tec on the Itk-/-Rlk-/- background, hoping to study mice that are functionally deficient for all three Tec kinases. The results hint the importance of the Tec kinases in T cell development and/or survival. Finally, in order to identify potential transcriptional targets of Itk, we used microarray technology to compare global gene expression profiles of naïve and stimulated Itk-/- versus Itk+/- CD4+ T cells. This analysis provided a short list of differentially expressed genes in Itk-/- versus Itk+/- CD4 T cells, providing a starting point for further studies of Itk in T cell activation. Collectively, these studies clarified the role of Itk in CD28 signaling, revealed some unexpected aspects of Tec family kinases in T cells, and indicated potential targets of Itk-dependent signaling pathways in T cells.

Endocytosis is important for the regulation of signal transduction and for the movement of essential cellular components from outside the cell to their appropriate intracellular compartment(s). Two established mechanisms of endocytosis are clathrinmediated (CME) and clathrin-independent endocytosis, and they are responsible for internalization of different ligands. In this study, the newly established technique of total internal reflection fluorescent microscopy (TIRF-M) was used, along with standard biochemical and molecular biological tools, to systematically study the sorting and early trafficking of two established ligands of endocytosis, transferrin (Tf) and epidermal growth factor (EGF). TIRF-M studies revealed that Tf binds its receptor that is located in large clathrin arrays positioned just below the surface of the cell and that these large clathrin platforms serves as the major site of CME at the plasma membrane. EGF endocytosis is very different and occurs as follows 1) the liganded EGFR recruits Rab5 to the plasma membrane, 2) Rab5 concentrates around vesicles containing liganded EGFR and 3) these vesicles co-localize with EEA1 enriched endosomes. EEA1 was shown to play a pivotal role in EGF endocytosis, establishing a new role for EEA1 in vesicle trafficking in addition to its role in tethering and fusion. Finally, WDFY2, a new FYVE domain protein was shown to decorate a specific subset of vesicles, upstream of the EEA1 vesicle pool that appear to participate in Tf endocytosis. These studies establish new functions and components of endocytosis that enhances our understanding of this complex process.

According to the cancer stem cells (CSCs) hypothesis, CSCs are responsible for the treatment failures. CSCs are a subset of cells possessing stemness properties within the heterogeneous tumor mass. Therapeutic intervention on Wnt signaling is of our great interest because an aberrant Wnt signaling is an important driver to maintain the potency of CSCs. In nasopharyngeal carcinoma (NPC), deregulated expression of the Wnt signaling components is frequently observed. ICG-001 is a selective Wnt modulator (CBP antagonist) that specifically interrupts the interaction between β-catenin and CBP, thereby encourages the interaction between β-catenin and p300 and the subsequent differentiation and reduction of the CSCs subset. For this reason, the present study aimed to evaluate the therapeutic potential of ICG-001 in NPC. Results showed that ICG-001 inhibited both the migration of the NPC cells and the formation of tumor spheres. In the first part of the mechanistic studies (Chapter 3), ICG-001 was found to restore the expression of miR-150 in NPC cells. MiR-150 was further found to directly reduce CD44 expression and inhibit NPC cell migration. In the second part of the mechanistic studies (Chapter 4), ICG-001 was found to reduce the expression of Evi1 in NPC cells. The effect was accompanied with the inhibition of both the NPC cells migration and the tumor spheres formation. Two molecular axes, namely miR-96/Evi1/miR-449a and survivin/Evi1/miR-449a, were found to be involved in the inhibition of the tumor cell migration and spheroids formation. The therapeutic potential of using this CBP antagonist (ICG-001) in NPC, namely the in vitro and in vivo efficacy of ICG-001 combined with cisplatin, was examined (Chapter 5). Concurrent treatment of ICG-001 and cisplatin exhibited a synergistic inhibition on the in vitro growth and the tumor sphere forming capacity of NPC cells as well as the growth of NPC xenografts. Taken together, results presented in this thesis suggested that ICG-001 (PRI-724 is the analog of ICG-001 currently used in clinical trials) has a therapeutic potential in NPC.

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Maikel Petrus Peppelenbosch / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T22:42:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Queiroz_KarlaCristianedeSouza_D.pdf: 5700883 bytes, checksum: 11ab46407bbf600912fa23adf313688d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A eficiência do tratamento do câncer sob vários aspectos, mesmo com os avanços ¿farmacotecnológicos¿, ainda permanece como desafio para a medicina. Diante desse fato, novos agentes que atuem de forma alvo-específico, apresentem poucos efeitos colaterais e possam impedir o ¿escape¿ das células tumorais à indução de morte, são extremamente desejáveis. No presente trabalho, foram abordados 3 aspectos da atividade antitumoral da riboflavina: indução da apoptose das células de câncer prostático, indução da diferenciação de células leucêmicas e aumento da biodisponibilidade intracelular do quimioterápico mitoxantrona. Sob esses 3 aspectos, através do estudo de vias de sinalização, identificamos mediadores moleculares responsáveis pela ação da riboflavina como antitumoral. A atuação da riboflavina irradiada em células de câncer de próstata foi dependente da inibição da PI3K. De forma interessante, observamos uma potencial ação inibitória da metástase, evidenciada pela inibição das metaloproteinases 2 e 9 e da angiogênese pela diminuição da expressão do VEGF. Em relação à diferenciação das células leucêmicas evidenciamos o envolvimento do receptor TNFR1, bem como das proteínas ciclina D, JNK, Src quinase e das proteínas tirosinas fosfatases SHP2 e PTP!. Portanto, proteínas com diferentes localizações celulares foram afetadas, culminando com a diminuição da proliferação, manutenção da sobrevivência celular, interrupção da progressão do ciclo celular e reorganização do citoesqueleto, efeitos metabólicos essenciais para a ocorrência da diferenciação. Esse trabalho de tese também demonstrou a aplicabilidade da técnica do Pepchip para a identificação de diferenças metabólicas entre duas linhagens das células da leucemia eritroblástica, K562 e Lucena. Outra abordagem interessante nesse trabalho foi o uso da riboflavina com a finalidade de aumentar a biodisponibilidade celular de quimioterápicos tradicionais e a utilização de inibidores de proteínas fosfatases como estratégia para reverter a resistência de células tumorais. De acordo com os resultados, esse trabalho aponta de forma inédita uma nova função da vitamina B2 como antitumoral / Abstract: Cancer therapy efficiency, under several aspects, even with the progress of ¿pharmacotechnology¿, remains as a challenge for the medicine. According to this factor, new agents that act on specific target, present low side-effects and prevent cancer cells ¿escaping¿ from death induction, are extremely desirable. In this work, 3 aspects of antitumoral property of riboflavin were evaluated: apoptosis induction of prostate cancer cells, leukaemic cells differentiation and increase of intracellular bioavailability of chemotherapic (mitoxantrone). Under these 3 aspects, and by signal transduction approach, we identified molecular mediators responsible for antitumoral activity of riboflavin. The action of irradiated riboflavin on prostate cancer cells was dependent on PI3K inhibition. Interestingly, we also observed a potential inhibitory action of metastasis, as demonstrated by the inhibition of metalloproteinases 2 and 9 and decreasing of angiogenesis by downregulation of VEGF. In relation to leukaemic cells differentiation we demonstrated the involvement of TNFR1, as well as cyclin D, JNK, Src kinase and protein tyrosine phosphatases SHP2 and PTP!. Therefore, proteins with different cellular localizations were affected culminating in decreasing of cell proliferation, maintaining cell survival, cell cycle arrest and cytoskeleton rearrangement, crucial metabolic effects for the occurrence of differentiation process. This work also demonstrated the applicability of Pepchip technique for identifying the differences between 2 erytroblastic leukaemia cell lines, K562 and Lucena. Other interesting approach, in this work, was the use of riboflavin for improving chemotherapic cellular bioavailability and the strategical use of protein phosphatase inhibitors for reverting tumor cells resistance. According to our findings, this work spotlights the novel function of the vitamin B2 as an antitumoral agent / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Otávio Rizzi Coelho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T21:29:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tornatore_ThaisFranchini_D.pdf: 5344920 bytes, checksum: 13bb7f4ae7264a0aca117131579c9b8e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudamos o gene da FAK (focal adhesion kinase) na mitocondriogênese cardíaca induzida por estresse mecânico. O estresse prolongado (2-12 hs) de miócitos do ventrículo esquerdo de ratos neonatos(NRVM) aumentou a expressão do regulador transcricional mitocondrial PGC-1? (peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1), NRF-1 (nuclear respiratory factor) e o Tfam (mitochondrial transcription factor A). A ativação da cascata transcricional mitocondrial em cardiomiócitos estirados foi acompanhada pelo aumento da mitocondriogênese (aumento da densidade mitocondrial e número de cópias do DNA - mtDNA) e hipertrofia(tamanho da célula e transcrição do ANP). Estresse mecânico também aumentou a fosforilação da FAK, a localização nuclear e associação com PGC1-?. FAK C-terminal Recombinante, mas não a N-terminal ou domínio kinase, precipitaram PGC-1? em extratos nucleares de NRVMs. Além disso, a inibição da expressão da FAK por RNA de interferência suprimiu a hiper regulação do PGC-1? e NRF-1, e atenuou o aumento da mitocondriogênese e hipertrofia em cardiomiócitos. Ao mesmo tempo, a inibição da FAK reduziu os níveis de ATP em cardiomiócitos estirados. Estudos complementares em ventrículos esquerdo de camundongos adultos revelaram aumento da expressão de PGC-1?, NRF-1 e mtDNA em resposta à sobrecarga pressórica. In vivo o silenciamento da FAK atenuou a hiper regulação do PGC-1?, NRF-1, mtDNA e a hipertrofia do ventrículo esquerdo induzida por sobrecarga pressórica. A ativação da sinalização da FAK parece ter importante relação no aumento da mitocondriogênese paralelamente à resposta do aumento hipertrófico relacionado ao estresse mecânico dos cardiomiócitos / Abstract: We studied the implication of FAK (focal adhesion kinase) in cardiac mitochondriogenesis induced by mechanical stress. Prolonged stretching (2-12 hs) of neonatal rat ventricular myocytes (NRVM) enhanced the expression of mitochondria transcriptional regulator PGC-1? (peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1), NRF-1 (nuclear respiratory factor) and transcripts of Tfam (mitochondrial transcription factor A). The activation of the mitochondria transcriptional cascade in stretched NRVM was accompanied by enhanced mitochondriogenesis (increases in mitochondrial density and DNA copy number - mtDNA) and hypertrophy (cell size and ANP transcripts). Cell stretching also enhanced FAK phosphorylation, nuclear localization and association with PGC1?. Recombinant FAK C-terminal, but not the N-terminal or kinase domain, precipitated PGC-1? from NRVM nuclear extracts. Moreover, depletion of FAK by RNA interference suppressed the upregulation of PGC-1? and NRF-1, and markedly attenuated the enhanced mitochondriogenesis and hypertrophy of stretched NRVMs. Concomitantly, FAK depletion induced a marked reduction of ATP levels of stretched NRVM. Complementary studies in adult mice left ventricle revealed enhanced expression of PGC-1?, NRF-1 and mtDNA in response to pressure overload. In vivo FAK silencing attenuated the upregulation of PGC-1?, NRF-1, mtDNA and left ventricular hypertrophy induced by pressure overload. Activation of FAK signaling seems to be important for conferring enhanced mitochondriogenesis coupled to the hypertrophying growth response to mechanical stress in cardiomyocytes / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Eugenio Cesar Ulian. / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T07:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felix_JulianadeMaria_D.pdf: 2208995 bytes, checksum: 381046fcda413b39719db5fa437f223e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os processos associados ao acúmulo de sacarose e o metabolismo envolvido durante o crescimento e a maturação da cana-de-açúcar tem sido objeto de estudo intensivo. Uma estratégia para associar expressão gênica com uma característica desejada é comparar o perfil de expressão entre indivíduos pertencentes a uma população segregante para aquela determinada característica. Essa estratégia, denominada 'genetical genomics¿ foi utilizada nesse presente trabalho ao avaliar o perfil de expressão gênica de uma população de cana-de-açúcar que segrega para teor de sacarose. Para tal nós utilizamos cDNA microarrays que contém 1,280 elementos envolvidos em transdução de sinal, transcrição, desenvolvimento, ciclo celular, resposta à estresse e interação com patógenos, designado chip SUCAST (Sugarcane Signal Transduction). Com o objetivo de desvendar o envolvimento desses elementos no metabolismo de sacarose, foram comparados os perfis de expressão entre amostras de indivíduos de cana-de-açúcar de uma população segregante para teor de sacarose. Foram analisadas amostras de folha madura, sendo que 24 genes foram identificados como diferencialmente expressos. Também foram analisadas amostras de entrenós em desenvolvimento, sendo que 88 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma amostra de entrenó analisada. Dada a complexidade genética da cana-de-açúcar, esta estratégia nos permitiu identificar genes candidatos que podem controlar vias metabólicas sinalizadas por açúcar envolvida na síntese e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. E finalmente, no trabalho descrito no capítulo 4 nós procuramos por genes codificantes para proteínas tranportadoras de açúcar no banco de dados do SUCEST. A análise de seus diferentes padrões de expressão observado nesse trabalho sugerem seu possível envolvimento tanto em tecidos fonte quanto dreno, e também em diferentes estágios de desenvolvimento / Abstract: Due to the capacity of sugarcane for storing high concentrations of sucrose in the culm, the processes associated with sucrose accumulation and metabolism during sugarcane growth and maturation have been the subject of intensive study. A strategy for associating gene expression with a trait is described in which individuals exhibiting particular traits are selected from segregating populations of sugarcane and their gene expression profiles compared. In this current work we used the 'genetical genomics¿ strategy on a sugarcane population segregating for sugar content. For this purpose we used cDNA microarrays that contains 1,280 components involved in several aspects of signal transduction, transcription, development, cell cycle, stress responses and pathogen interaction, that was designed Sugarcane Signal Transduction (SUCAST) chip. In order to assess the involvement of these elements in sucrose metabolism, the expression profiles of individuals from a sugarcane population segregated for sugar content were compared. In the work described at chapter 2 we analyzed mature leaf samples, and twenty-four genes were identified as differentially expressed. We also analyzed maturing internodes samples, and 88 genes were identified as differentially expressed at least in one internode sample. Given the complex genetics of sugarcane, this strategy could identify candidate genes that may control sugar-signaling pathways involved in sucrose synthesis and accumulation in sugarcane. And finally, in the last chapter we searched for genes encoding sugar transport proteins in the SUCEST database. The differential expression patterns of these putative transporter genes in sugarcane plants observed in this work suggest that they have many roles in both source and sink tissues, and at different developmental stages / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Silvia Mika Shishido / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T19:46:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_Daisy_M.pdf: 1450123 bytes, checksum: e8dc961f855a7ea88daa10bb8ee00685 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A riboflavina (RF) é uma vitamina hidrossolúvel pertencente ao complexo vitamínico B2 e precursora das coenzimas FMN e FAD. Além da função biológica como componente de coenzimas, a RF apresenta atividade antitumoral e fotossensibilizante. A proposta principal desse estudo se baseou na avaliação da fototoxicidade da RF, bem como na determinação de marcadores moleculares da inflamação, senescência e morte celular, ações deletérias normalmente desencadeadas pela radiação UVA. Os resultados obtidos indicam que a RF tem potencial aplicação na terapia fotodinâmica, levando se em conta os modelos celulares utilizados, fibroblastos (BALB/c 3T3) e queratinócitos humanos (HaCaT). As células BALB/c 3T3 tratadas com RF 6,0 mM e dose de 5 J/cm² de radiação UVA, apresentaram indução de apoptose principalmente pela via intrínseca. A indução de senescência foi evidenciada pelo aumento da p-caveolina e aumento da atividade da MMP-2 (principal protease responsável pela degradação de colágeno). De acordo com os níveis de NFkB e p- IKKa/b, a RF não alterou significativamente o processo de inflamação desencadeado pela radiação UVA. Nas células HaCaT, o tratamento com 5,0 mM de RF e dose de 5 J/cm² de radiação UVA levou a ativação da apoptose induzida tanto pela via extrínseca como pela intrínseca. O aumento nos níveis de p-caveolina, p21 e da atividade das MMPs-2 e -9 sugerem à indução de processo de senescência precoce também nos queratinócitos. Além disto, a diminuição da expressão do NF?B indica que o mesmo esteja se translocando para o núcleo e, portanto, regulando a resposta inflamatória. Outro aspecto avaliado foi a influência do copolímero F-127 na fototoxicidade da RF. A irradiação do hidrogel contendo F-127 e riboflavina manteve a propriedade fototóxica da mesma. Nossos dados sugerem que a RF apresenta potencial para uso em terapia fotodinâmica, uma vez que a mesma se mostrou fototóxica quando irradiada com doses subtóxicas de radiação UVA. / Abstract: Riboflavin (RF) is a water soluble vitamin which belongs to vitamin B2 complex, an essential precursor of FMN and FAD coenzymes. Besides being a component of coenzymes, RF displays antitumoral and photossensitizing activities. The main proposal of this study was to evaluate the RF phototoxicity, as well as to determine molecular markers of inflammation, senescence and cellular death, deleterious actions normally triggered by the UVA radiation. Taking into consideration both cell lines used as models, fibroblasts (BALB/c 3T3) and human keratinocytes (HaCaT), the results obtained indicate that RF has potential application in photodynamic therapy. BALB/c 3T3 cells treated with 6.0 µM RF associate with UVA radiation (5 J/cm²) showed apoptosis induction mainly via intrinsic pathway. An increase of p-caveolin and MMP-2 activity (major protease responsible for degradating collagen) evidenced senescence induction. According to NF?B and p-IKKa/ß levels, RF did not significantly change the process of inflammation triggered by UVA radiation, in fibroblast cells. In HaCaT cells 5.0 µM RF associated with UVA radiation (5 J/cm ²) was observed apoptosis induction thorough extrinsic and intrinsic pathways. Senescence process was also observed in keratinocytes as indicated by an increase of pcaveolin, p21 and MMPs-2 and -9 activities. Besides, the decrease of NF?B expression indicates that this transcription factor translocates into the nucleus and in turn, regulates inflammatory response. Other aspect evaluated in this work was the influence of the F-127 in the RF phototoxicity. The irradiation of hydrogel containing F-127 and RF remained RF phototoxicity property. Our findings suggest that RF displays potential for use in photodynamic therapy, once it was phototoxic when irradiated with subtoxic UVA dose / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:52:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_FernandoGanzarollide_D.pdf: 2241345 bytes, checksum: a0f9e9616ce36521fc221d40146a8e97 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Angiotensina II (AngII) desempenha um papel importante na gênese da hipertrofia miocárdica. Grande parte do estímulo hipertrófico determinado pela AngII depende da ativação de sinalização intracelular envolvendo membros das famílias de transdutores de sinais mitogen-activated-protein kinase (MAPK) e Janus Kinase (JAK)/ signal transducer and activator of transcription (STAT). Agentes farmacológicos doadores de óxido nítrico (NO) estão sendo objeto de intensa pesquisa, atualmente, pelo seu potencial terapêutico em condições clínicas envolvidas na hipertrofia miocárdica. No presente trabalho, avaliamos a propriedade do S-nitroso-acetilcisteína (SNAC) de modular a transdução de sinal da AngII mediada por membros da família das MAPK e JAK/STAT em coração e cardiomiócitos isolados de ratos. SNAC foi capaz de reverter significativamente a ativação promovida pela AngII na via de sinalização JAK2/STAT1 e 3 em coração e cardiomiócitos. Além disso, SNAC reverteu a ativação por AngII em cJun-N-terminal Kinase (JNK)1/2/3. Entretanto, SNAC acentuou o efeito da AngII em Extracellular Regulated Kinase (ERK) 1 e 2. Finalmente, nem AngII nem SNAC exerceram qualquer efeito sobre p38MAPK. Como resultado, houve menor expressão dos immediate early genes c-jun e c-fos, bem como menor ativação por fosforilação da proteína c-Jun. Em resumo, o pré-tratamento de ratos e cardiomiócitos isolados com um potente doador de NO afeta a transdução do sinal da AngII resultando na modulação via-específica da expressão de genes precocemente induzidos. Tais resultados oferecem evidências para o efeito direto de um doador de NO sobre a transdução de sinal da AngII e proporcionam bases moleculares para as propriedades anti-hipertróficas desta classe de drogas / Abstract: Angiotensin II (AngII) plays an important role in the genesis of cardiac hypertrophy. Much of the growth stimulus delivered by AngII depends on the activation of intracellular signaling through members of the mitogen-activated-protein kinase (MAPK) and Janus kinase (JAK)/ signal transducer and activator of transcription (STAT) family of signal transducers. Pharmacological agents that act as donors of nitric oxide (NO) are currently under intensive investigation for their beneficial role in clinical conditions that produce cardiac hypertrophy. Here, we evaluated the property of S-nitroso-N-acetyl cysteine (SNAC) to modulate AngII signal transduction through members of the MAPK family and through JAK2/STAT-1 and 3 in heart and isolated cardiomyocytes of rats. SNAC significantly reversed AngII activation of the JAK2/STAT-1 and -3 signaling in heart and cardiomyocytes. In addition SNAC revered AngII activation of JNK1/2/3. However, SNAC enhanced the effect of AngII on ERK. Finally neither SNAC nor AngII exerted an effect on p-38. As a consequence, there was an abrogation in the enhanced expression of the immediately early genes c-jun and c-fos, as well the phosphorilation of c-Jun. In summary, the treatment of living rats and isolated cardiomyocytes with a potent NO donor affects AngII signal transduction on a pathway specific manner resulting on the modulation of early inducible gene expression. These results provide evidence for a direct effect of a NO donor upon AngII signal transduction, and grant a molecular basis for the anti-hypertrophic properties of this class of drugs / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AnaCarolinaSantosde_D.pdf: 3901394 bytes, checksum: ef9ac69de23f7f2b15590ee29a931c8f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Produtos naturais têm originado muitos dos compostos biologicamente ativos usados clinicamente, destacando-se como importantes fontes de novos agentes terapêuticos utilizados no tratamento das mais variadas patologias incluindo câncer, HIV/AIDS, Alzheimer e malária. O desenvolvimento de novos fármacos a partir de produtos naturais, especialmente os derivados de plantas, tem desempenhado importante papel na prevenção e tratamento do câncer sendo que, de todos os antitumorais disponíveis entre 1940 e 2002, aproximadamente 40% eram caracterizados como produtos naturais ou derivados destes, com outros 8% sendo considerados agentes mimetizantes de produtos naturais. No presente trabalho, fisetin (flavonóide de origem vegetal) e a vitamina riboflavina foram avaliados como potenciais agentes antitumorais. Para este propósito, as linhagens de células leucêmicas HL60 e de câncer prostático PC3 foram tratadas com riboflavina irradiada ou fisetin por 24 horas e seus efeitos sobre vias de transdução de sinais responsáveis pela sobrevivência e morte celular foram avaliados. Os resultados obtidos demonstram que riboflavina e fisetin apresentam expressiva atividade antiproliferativa, induzindo a morte das células tumorais em concentrações na ordem de µM. A investigação do mecanismo molecular da ação citotóxica da riboflavina demonstrou que o tratamento de HL60 e PC3 com a vitamina irradiada induz morte celular através da via extrínseca de indução de apoptose, mediada pela ativação do sistema Fas/FasL e aumento na síntese de ceramida. Como conseqüência da ativação do receptor de morte Fas, uma seqüência ordenada de eventos leva à modulação de cascatas de sinalização através da alteração da atividade/expressão de moléculas-chave associadas a proliferação, sobrevivência, migração e morte celular. Assim como a riboflavina, fisetin também mostra-se eficiente indutor de morte por apoptose em células HL60, modulando cascatas de proteínas quinases e fosfatases e levando a alterações na expressão de NF?B, atividade de MAPKs, níveis de fosfoproteínas e, também, à inibição de enzimas envolvidas na manutenção do estado redox. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para um maior conhecimento sobre a atividade/função biológica de algumas moléculas envolvidas na sobrevivência e morte de células leucêmicas e prostáticas, sugerindo potenciais alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no combate a doenças neoplásicas. Além disso, os resultados obtidos demonstram que a riboflavina irradiada e fisetin são potentes indutores de apoptose e promissores agentes antitumorais, capazes de modular importantes vias de sinalização intracelular através de ação específica sobre moléculas-chaves relacionadas a proliferação, resistência e invasividade de células tumorais / Abstract: Natural products have been providing numerous clinically used medicines and remain as essential components in the search for new drugs against various pharmacological targets including cancer, HIV/AIDS, Alzheimer¿s, malaria, and pain. Drug discovery from natural products, especially from medicinal plants, has played an important role in the chemoprevention and treatment of cancer and, off all available anticancer drugs between 1940 and 2002, about 40% were natural products per se or natural product-derived, with another 8% considered natural product mimics. In the present work, the plant flavonoid fisetin and the vitamin riboflavin are evaluated as potential anticancer agents. For this purpose, the leukemic cell line HL60 and the human prostate cancer cell PC3 were treated for 24h with irradiated riboflavin or fisetin and their effects on signal transduction pathways related to the cell survival and proliferation were evaluated. The results obtained demonstrated that riboflavin and fisetin have strong anti-proliferative activity, inducing tumoral cell death at µM concentrations. The investigation of the molecular death mechanism triggered by riboflavin demonstrated that the treatment of HL60 and PC3 with the irradiated vitamin induces apoptotic cell death through induction of the extrinsic pathway mediated by the activation of Fas/FasL system via a ceramide-dependent pathway. As a consequence of the activation of the death receptor Fas, an orderly sequence of signaling events leads to the modulation of signaling cascades through alterations in the activity/expression of key targets molecules related to proliferation, survival, migration and cell death. As well as riboflavin, fisetin also showed strong apoptotic activity, inducing HL60 cell death through modulation of protein kinase and phosphatase signaling cascades, leading to alterations in the NF?B expression, MAPKs activities, phosphoprotein levels and also inhibition of enzymes involved in the redox status maintenance. The results obtained in this work bring out information about the biologic activity of some molecules involved in the survival and death of leukemic and prostate cancer cells, indicating among then potential targets for the development of rational therapeutic strategies. Moreover, the data obtained demonstrated that irradiated riboflavin and fisetin have potential proapoptotic activity, pointing out these bioactive compounds as promising antitumoral agents, since they can affect important molecular targets related to proliferation, resistance and invasibility of cancer cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular