Identification et caractérisation de la première N-acylphosphatidyléthanolamine synthase chez A. thaliana. Les N-acylphosphatidyléthanolamines (NAPE) sont des phospholipides complexes peu abondants au sein des membranes biologiques mais largement répandues dans différents organismes. Outre ses fonctions de stabilisation des membranes ce lipide est davantage connu pour être le précurseur des N-acyléthanolamines (NAE) qui sont impliquées dans de très nombreuses voies de signalisation chez les plantes (lors de la germination, du développement racinaire, de l’induction de gène de défense, etc.) comme chez les animaux (apoptose, ligand des récepteurs endocannabinoïdes, notion de satiété, etc.). Au début de ma thèse, les gènes codant pour les enzymes impliquées dans les différentes étapes de la voie métabolique des NAE (e.g NAPE-PLD, FAAH1 et 2) ont été caractérisées exceptées le ou les gène(s) codant pour l’enzyme catalysant la synthèse de NAPE précurseurs de ces lipides. Une étude bioinformatique a permis d’identifier de nouvelles séquences codantes pour des acyltransférases putatives chez A. thaliana dont celle du gène At1g78690. La caractérisation fonctionnelle de cette enzyme a été déterminée après son expression hétérologue chez E.coli sur fractions membranaires et protéines purifiées. Puis le profil d’expression génique, la localisation cellulaire de la protéine ainsi que son activité ont été étudiés chez les plantes à partir notamment de mutants d’A. thaliana (ADN-T et « 35S »). Les résultats obtenus au cours de cette étude ont permis d’identifier et de caractériser la première NAPE synthase chez les plantes. / Discovery and characterization of an A. thaliana N-acylphosphatidylethanolamine synthase. N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE) is a widespread, albeit minor, membrane phospholipid in various organisms. Besides its stabilizing properties to membranes bilayers, NAPE is known to be the precursor for N-acylethanolamine (NAE) synthesis. NAE have been shown to regulate a variety of physiological functions in both plants (germination, root development, gene induction, etc.) and animals (apoptosis, ligand for cannabinoid receptors, satiety properties, etc.) At the beginning of my PhD, the genes encoding the enzymes involved in the different steps of NAE metabolism were well characterized (e.g NAPE-PLD, FAAH 1 and 2), with the exception of the NAPE synthase gene(s). A bioinformatic study allowed the identification of coding sequences for putative new acyltransferases in A. thaliana, such as the At1g78690 gene. After expression in E. coli, the functional characterization of At1g78690p was carried out by analyses of the lipid content and by enzymatic assays using membrane fractions or purified proteins. The localisation of the protein and its activity were also studied in A. thaliana mutants (ADN-T and “35S”). This study shows the identification and characterization of the first NAPE-synthase in plants.

Les maladies cardiovasculaires (MCV), résultant de complications de l'athérosclérose, restent la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. L'athérosclérose, considérée comme une maladie inflammatoire chronique, implique à la fois les systèmes immunitaires inné et adaptatif. Les macrophages jouent un rôle majeur dans l'initiation de la lésion, sa progression et les complications thrombotiques potentiellement dévastatrices. Un grand nombre de données rapporte l'implication du stress oxydatif, conséquence d'un déséquilibre entre antioxydants et espèces réactives de l'oxygène, dans les maladies cardiovasculaires. En outre, ces pathologies sont fréquemment associées à des changements dynamiques de l'activation des macrophages, soit vers le phénotype pro-inflammatoire M1 (activation classique), soit vers le phénotype anti-inflammatoire M2 (activation alternative). Parmi les antioxydants endogènes, la thiorédoxine-1 (Trx1) est une protéine ubiquitaire qui exerce différents effets physiologiques. Outre son rôle dans l'homéostasie redox cellulaire et comme puissant antioxydant, cette protéine est également impliquée dans le métabolisme énergétique, les réponses inflammatoires, la croissance cellulaire et la survie. En revanche, sa forme tronquée (Trx80) exerce des effets opposés. Il est à noter que plusieurs études ont rapporté le rôle bénéfique du système de la Trx1 dans les MCV mais les mécanismes moléculaires n'ont toujours pas été décrits. Par conséquent, notre étude porte sur le rôle des Trx1 et Trx80 dans le développement et/ou la régression de l'athérosclérose, en particulier dans la modulation de la polarisation des macrophages et dans les différentes voies de signalisation impliquées dans ces processus. Nos principaux résultats obtenus in vitro sur des cultures primaires de macrophages humains ou de macrophages péritonéaux murins, ont révélé d'une part que la Trx1 induit la polarisation des macrophages vers le phénotype anti-inflammatoire M2 suite à la régulation négative de p16INK4a et l’inhibition de la translocation nucléaire de la protéine activatrice-1(AP-1) et de Ref-1; d'autre part, que la Trx1 inhibe la polarisation des macrophages vers le phénotype pro-inflammatoire M1 induit par le lipopolysaccharide (LPS). Par contre, la Trx80 inhibe la polarisation anti-inflammatoire M2 induite par IL-4 ou IL-4/IL-13 mais potentialise le phénotype M1 induit par le LPS. Pour valider in vivo les résultats obtenus in vitro, nous avons utilisé comme modèles expérimentaux, des souris C57Bl/6.ApoE2.ki hyperlipoprotéinémiques et des vaisseaux athérosclérotiques de patients ayant subi une chirurgie vasculaire. Injectées en intraveineuse, la Trx1 et la Trx80 affectent le phénotype des macrophages dans le thymus, le foie et les lésions athérosclérotiques. Chez la souris, la Trx1 réduit la surface des lésions aortiques alors que la Trx80 l’augmente. Enfin le traitement aussi bien par la Trx1 que par la Trx80 n’affecte pas les niveaux de cholestérol et de triglycérides plasmatiques. Pour explorer davantage nos résultats, nous avons étudié les voies de signalisation impliquées dans ces processus. Nos résultats montrent que la Trx1 et la Trx80 activent toutes les deux Akt. La Trx80 utilise la voie de signalisation mTOR pour exercer ses effets dans la polarisation M1 des macrophages puisqu'elle active mTOR de manière dose-dépendante comme l’indique l'augmentation de la phosphorylation de p70S6K. De plus, la Trx1 antagonise l'athérosclérose alors que la Trx80 la potentialise par suite des changements des phénotypes M1/M2, ce qui fait de la Trx1 une cible thérapeutique prometteuse. / The cardiovascular diseases (CVDs), resulting from complications of atherosclerosis, remain the leading cause of morbidity and death worldwide. Atherosclerosis as a chronic inflammatory disease, involves both innate and adaptive arms of immunity in which macrophages play the orchestral role in modulating lesion initiation, progression, and potentially devastating thrombotic complications. Available evidences support the notion of a central role of oxidative stress, due mainly to the imbalance between antioxidants and reactive oxygen species (ROS) in CVDs. Furthermore, the pathology is frequently associated with dynamic changes in macrophage activation, with classically activated M1 cells implicated in initiating and sustaining inflammation and M2 or M2-like cells associated with resolution or smoldering chronic inflammation. Among endogenous antioxidants, the thiordoxine-1 (Trx1) plays a central role in several diseases including CVD. Thus, the ubiquitous Trx1 has been reported to exert a myriad of beneficial roles. Indeed, it regulates not only cellular redox homeostasis and acts as a principal antioxidant defense system, but it also affects energy metabolism, modulates the immunological and inflammatory responses, and controls cell growth and survival. In contrast, its truncated form (Trx-80), exerts an opposite effects. However, several studies reported the beneficial role of Trx system in CVDs but the detailed molecular mechanism is not addressed yet. Therefore, the present study aims to investigate the role of both Trx1 and Trx80 in the biology of atherosclerosis through the modulation of macrophage polarization and the implicated signaling pathways as well. Our in vitro major findings, using human macrophages and murine peritoneal macrophages, revealed that Trx1 on one hand promoted the polarization of anti-inflammatory M2 macrophages through downregulation of p16INK4a and suppressing nuclear translocation of activator protein-1 (AP-1) and Ref-1 as evidenced by the expression of the CD206 and IL-10 markers. On the other hand Trx1 also reduced the lipopolysaccharide (LPS)-induced differentiation of inflammatory M1 macrophages, as indicated by the decreased expression of the M1 cytokines, tumor necrosis factor-α (TNF-) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP¨-1). By contrast, Trx80 treatment attenuated the polarization of anti-inflammatory M2 macrophages induced by IL-4 or IL-4/IL-13 even it potentiated LPS-induced M1 activation. To validate our obtained in vitro results, hyperlipoproteinemic C57Bl/6.ApoE2.ki mice and human atherosclerotic vessel specimens from patients undergoing vascular surgery were used. Consistently, Trx1 and Trx80 affected macrophage phenotype in thymus, liver and atherosclerotic lesions. As a consequence, Trx1 reduced whereas Trx80 increased the aortic lesion area in mice. Plasma levels of cholesterol and triglycerides did not changed by the treatment. To further explore our results, the implicated signaling pathways has been studied and it was found that both Trx1 and Trx80 activated Akt. Furthermore, Trx80 uses mTOR signaling pathway to exert its effect in polarizing macrophages toward M1 phenotype since it activated mTOR in a dose-dependent manner as demonstrated by the increased phosphorylation of P70S6K. Based on our results, Trx1 antagonizes whereas Trx80 potentiates atherosclerosis through changing M1/M2 phenotypes. Therefore, Trx1 represents a promising target for therapeutic interventions.

Dans de nombreux cancers, l’expression du gène Fhit (Fragile Histidine Triad) estfréquemment altérée. Fhit est décrit comme un important gène suppresseur de tumeur de parson rôle pro-apoptotique et anti-prolifératif. Nous avons mis en évidence que, in vivo et invitro, la diminution de l’expression de Fhit est associée au caractère infiltrant des cellulestumorales bronchiques, ce qui suggère que Fhit pourrait être impliqué dans le processusd’invasion tumorale. Nous avons en effet montré que la surexpression et l’inhibition de Fhitinduisent respectivement une diminution et une augmentation des capacités migratoires etinvasives des cellules bronchiques. Nous avons aussi mis en évidence que Fhit contrôlel’invasion des cellules tumorales bronchiques en régulant l’expression d’éléments clés de latransition épithélio-mésenchymateuse (TEM) tels que l’organisation des jonctions serrées etadhérentes, l’expression des métalloprotéinases matricielles et de la vimentine. De plus, Fhitrégule la TEM via une cascade de signalisation impliquant le récepteur au TGF-β, lesrécepteurs à tyrosine kinase (RTK), Src, Erk et Slug. Le double rôle de Fhit en tant quesuppresseur de tumeur et d’invasion renforce l’idée que Fhit pourrait représenter un nouveaubiomarqueur d’agressivité tumorale et pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutiquedans le traitement des cancers broncho-pulmonaires. / In many types of cancers, Fhit (Fragile histidine triad) expression is frequentlydecreased or lost. Fhit is described as a tumor suppressor gene by its ability to induceapoptosis and to inhibit proliferation of tumor cells. We have demonstrated that a low Fhitexpression is associated with in vivo and in vitro invasiveness of lung tumor cells. Then, wehave shown that Fhit controls the invasive phenotype of lung tumor cells by regulating keyelements of epithelial-mesenchymal transition (EMT) such as cell-cell adhesion molecules,matrix metalloproteinase and vimentin expression. Our results provide also evidence that Fhitcontrols EMT by regulating several signaling pathways implying TGF-βR, RTK, Src, ERKand Slug. The dual function of Fhit as a tumor and invasion suppressor gene strengthens theidea that Fhit could represent a new biomarker of aggressiveness of lung cancer and couldconstitute a new therapeutic target to limit tumor progression.

Décrypter le fonctionnement des réseaux biologiques est une des missions centrales de la biologie des systèmes. En particulier, les réseaux de transduction du signal sont essentiels pour la compréhension de la réponse cellulaire à des perturbations externes ou internes. Pour faire face à la complexité de ces réseaux, des modélisations aussi bien numériques que formelles sont nécessaires. Nous proposons un cadre de modélisation formelle, dans le cadre de réseaux logiques, afin d'obtenir des prédictions robustes sur le comportement et le contrôle des voies de signalisation. Nous modélisons la réponse des réseaux logiques de signalisation par du raisonnement automatique à l'aide de Programmation par Ensembles-Réponses (Answer Set Programming, ASP). ASP fournit un langage déclaratif pour la modélisation de divers problèmes de représentation des connaissances et de raisonnement. Des solveurs permettent plusieurs modes de raisonnement pour étudier la multitude d'ensembles réponses. En s'appuyant sur la richesse du langage de modélisation et ses capacités de résolution très efficaces, nous utilisons ASP pour modéliser et résoudre trois problèmes dans le contexte des réseaux logiques de signalisation: apprentissage de réseaux booléens, calculs de plan d'expériences, et l'identification des contrôleurs. Globalement, la contribution de cette thèse est de trois ordres. Premièrement, nous introduisons un cadre formel pour la caractérisation et le raisonnement sur la réponse des réseaux logiques de signalisation. Deuxièmement, nous contribuons à une liste croissante d'applications réussies d'ASP en biologie des systèmes. Troisièmement, nous présentons un logiciel fournissant un pipeline complet de raisonnement automatisé sur la réponse des réseaux logiques de signalisation. / Deciphering the functioning of biological networks is one of the central tasks in systems biology. In particular, signal transduction networks are crucial for the understanding of the cellular response to external and internal perturbations. Importantly, in order to cope with the complexity of these networks, mathematical and computational modeling is required. We propose a computational modeling framework in order to achieve more robust discoveries in the context of logical signaling networks. More precisely, we focus on modeling the response of logical signaling networks by means of automated reasoning using Answer Set Programming (ASP). ASP provides a declarative language for modeling various knowledge representation and reasoning problems. Moreover, available ASP solvers provide several reasoning modes for assessing the multitude of answer sets. Therefore, leveraging its rich modeling language and its highly efficient solving capacities, we use ASP to address three challenging problems in the context of logical signaling networks: learning of (Boolean) logical networks, experimental design, and identification of intervention strategies. Overall, the contribution of this thesis is three-fold. Firstly, we introduce a mathematical framework for characterizing and reasoning on the response of logical signaling networks. Secondly, we contribute to a growing list of successful applications of ASP in systems biology. Thirdly, we present a software providing a complete pipeline for automated reasoning on the response of logical signaling networks.

Durant le développement myocardique, les cardiomyocytes s'allongent et se connectent entre eux grâce à une structure spécialisée, le disque intercalaire. Cette organisation des cardiomyocytes est essentielle pour le couplage mécanique et la conduction électrique. Un des éléments responsables de l'insuffisance cardiaque est la perturbation de ces sites de contact intercellulaire. Actuellement, aucun facteur n'est connu pour coordonner l'organisation polarisée des cardiomyocytes. Ici, nous présentons une augmentation importante de Pdzrn3 dans des cardiomyopathies hypertrophiques humaines et dans des myocardes murins, corrélée à une perte de l'élongation polarisée des cardiomyocytes. De plus la délétion spécifique intramyocardique de l'expression de Pdzrn3, dans un modèle murin, protège de la survenue d'une insuffisance cardiaque secondaire à une cardiomyopathie hypertrophique. Nos résultats révèlent une nouvelle voie de signalisation qui contrôle un programme génétique essentiel pour le développement myocardique, le maintien de la géométrie et de la fonction contractile des cardiomyocytes. Cette voie de signalisation implique PDZRN3 et cette molécule constitue une cible thérapeutique potentielle pour la protection de l’insuffisance cardiaque chez l’homme. / During heart maturation, individual cardiomyocytes stretch out and connect some with the others via their extremities by intercalated disk protein complexes. This planar and directionnel organization of the myocyte sis crucial for the machanical coupling and the anisotropic conduction of the electric signal in the heart. One of the hallmarks of heart failure concerns alterations in the contact sites between cardiomyocytes. Yet no factors on its own is known to coordinate cardiomyocyte polarized organization. Here we reported enhanced levels of Pdzrn3 in the diseased hypertrophic human and mouse myocardium, correlated with the loss of cardiomyocyte polarized elongation. Furthermore, mouse cardiac Pdzrn3 deficiency protected against heart failure in a mouse model of hypertrophic cardiomyopathy. Our results reveal a novel signaling that controls a genetic program essential for heart maturation and for maintain of cardiomyocyte overall geometry and contractile function and implicates PDZRN3 as a potential therapeutic target for human heart failure protection.

La vigne (Vitis vinifera) est sensible à de nombreuses maladies, nécessitant l'utilisation massive de produits phytosanitaires. Des méthodes alternatives doivent être développées. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, les gènes AtNPR1, AtNDR1 et AtEDS1 interviennent dans la voie de signalisation contrôlée par l'acide salicylique (SA) en réponse aux agents pathogènes biotrophes. Nous avons identifié par une approche gène candidat chez V. vinifera, de potentiels orthologues de ces trois gènes (VvNPR1.1, VvNPR1.2, VvNHL1 et VvEDS1).Nos travaux ont montré que les protéines VvNPR1 fusionnées à la GFP sont localisées dans le noyau. De plus, la surexpression transitoire des VvNPR1 stimule l'expression de gènes de défense en système hétérologue et homologue. La surexpression de VvNPR1.1 chez le mutant npr1 restaure les différents phénotypes du mutant, contrairement à la surexpression de VvNPR1.2. VvNPR1.1 est semble être l'orthologue d'AtNPR1. La surexpression de VvNHL 1 chez le mutant ndr1 ne rétablit pas la résistance à Pseudomonas syringae. Cependant, ces plantes sont plus sensibles à Botrytis cinerea, probablement par l'accentuation d'un processus de mort cellulaire. L'expression de VvNHL 1 est réprimée en réponse à B. cinerea, constituant un mécanisme de défense contre les nécrotrophes. VvNHL1 semble donc promouvoir la mort cellulaire. L'expression de VvEDS1 est stimulée en réponse à des agents pathogènes et à un traitement par le SA. L'étude de sa fonction est en cours par surexpression chez des mutants eds1. La compréhension des voies de signalisation des réponses de défense chez la vigne devrait permettre l'obtention de vignes plus résistantes aux agents pathogènes. / Vitis vinifera is susceptible to many pathogens, thus requiring a massive use of phytochemicals. Alternative methods have to be developed. In the madel plant Arabidopsis thaliana, the AtNPR1, AtNDR1 and AtEDS1 genes are components of the salicylic acid (SA) signalling pathway involved in resistance to biotrophic pathogens. Using a candidate gene approach, we have identified putative orthologs of these genes in the grapevine genome (VvNPR1.1, VvNPR1.2, VvNHL 1 and VvEDS1).Our work shows thal VvNPR1-GFP fusion proteins are localized in the nucleus. Moreover, transient overexpression of VvNPR1 genes induces defence gene expression, in bath heterologous and homologous systems. Overexpression of VvNPR1.1 in npr1 mutants restores the different phenotypes of the mutants, while VvNPR1.2 overexpression does not. These results strongly suggest that VvNPR1.1 is the AtNPR1 ortholog. Overexpression of VvNHL 1 in ndr1 mutants does not restore resistance to Pseudomonas syringae. However, resistance to Botrytis cinerea in these plants is weakened, probably because of stimulation of cell death. Furthermore, VvNHL1 repression following B. cinerea infection in V. vinifera could be considered as a defence mechanism against necrotrophic pathogens and suggests thal VvNHL1 is involved in promotion of cell death. VvEDS1 expression is induced by pathogens infection and SA treatment. VvEDS1 functional characterization is in progress using eds1 Arabidopsis mutants overexpressing VvEDS1. Knowledge of defence signalling pathways in V. vinifera will contribute to obtain pathogen resistant grapevines.

Les plantes sont des organismes sessiles se développant dans un environnement hétérogène et fluctuant. La capacité d'acquisition des nutriments par le système racinaire est donc un caractère important pour leur croissance et leur développement.L'azote (N), notamment sous forme nitrate (NO3-), fait partie de ces éléments qui sont limitant pour la croissance des plantes mais aussi très mobiles dans le sol donc fréquemment distribués de façon hétérogène. Les plantes s'adaptent à cette contrainte en modulant le développement racinaire ainsi que la capacité de transport de ce nutriment dans les différentes parties du système racinaire en fonction de la disponibilité en NO3- et du besoin en azote (N) de la plante entière. Cette adaptation repose donc sur la combinaison de deux voies de signalisation, i) une signalisation locale dépendante de la disponibilité en NO3- dans le milieu extérieur ii) une signalisation longue distance (ou systémique) racines-feuilles-racines relative au besoin en N de la plante entière.Toutefois, les bases moléculaires de la signalisation longue distance comme les mécanismes de régulation qui y sont associés ne sont pas totalement connus. Ils reposent sur l'intégration au niveau des parties aériennes de signaux d'origine racinaire, provenant des racines exposées au NO3- mais aussi de celles qui en sont privées. Les parties aériennes jouent alors un rôle majeur dans la modulation de la physiologie et du développement racinaire en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Des études précédentes ont montré que la biosynthèse de cytokinines est essentielle pour la mise en place de cette réponse adaptative. De plus, il est connu qu'après un apport de NO3-, la biosynthèse de cette hormone dans les racines puis son accumulation dans les parties aériennes est augmentée. Dans ce contexte, nous avons émis l'hypothèse que les cytokinines pourraient correspondre à un messager racines/feuilles important pour la signalisation systémique NO3--dépendante.L'objectif de mon projet de thèse consistait à comprendre comment les parties aériennes contrôlent l'acquisition racinaire du NO3- en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Pour reproduire cette condition en laboratoire, le système de 'split-root', permettant de séparer le système racinaire en deux parties isolées pouvant être traitées différemment, a été utilisé pour exposer les plantes à différentes conditions de disponibilité en NO3-. Dans ces différentes conditions, les réponses moléculaires, métaboliques et physiologiques ont été caractérisées chez des plantes sauvages d'Arabidopsis et comparées à celles de mutants affectés dans la biosynthèse, le transport acropetal ou encore dans la perception des cytokinines. La combinaison de ces différentes approches m'a ainsi permis de démontrer que les cytokinines, et plus précisément les trans-zéatines, sont effectivement un messager racines-feuilles crucial pour la mise en place des réponses de la racine à une disponibilité hétérogène en NO3-. De plus, j'ai montré que l'apport hétérogène en NO3- comparé à l'apport homogène entraîne une importante reprogrammation de l'expression génique dans les parties aériennes qui est largement dépendante de ce transport de trans-zéatines vers les feuilles. Enfin, l'intégration de ces données transcriptomiques au sein de réseaux géniques a permis d'identifier des gènes candidats intéressants comme acteurs possibles de la signalisation feuilles-racines. / Plants are sessile organisms growing in a heterogeneous and fluctuating environment. Thus, foraging for nutrients is an important trait for plant growth and development. Nitrogen (N), especially as nitrate (NO3-) form, is one limiting element for plant growth but is also highly mobile in the soil leading to frequent heterogeneity distribution. Plants are managing this constraint through the regulation of root development and NO3- uptake in the different parts of the root system according to the spatial NO3- availability and the N needs of the whole plant. This adaptation relies on a dual signaling pathway involving i) a local signaling related to external NO3- supply and ii) a root-shoot-root long-distance (systemic) signaling related to the plant N needs..However, the molecular basis of the long-distance signaling as well as the regulatory mechanisms associated with, are not fully understood. They rely on the integration at the shoot level of signals originating from both NO3--supplied and N-deprived root parts. Therefore, the shoots have a key role for an efficient adaptation to heterogeneous NO3- environment through the adjustment of root physiology and development. Previously, cytokinin biosynthesis has been shown to be essential for both molecular and morphological root responses to NO3- heterogeneous environment. Moreover, it is known that upon NO3- supply, de novo biosynthesis of this hormone in the roots is increased along with its accumulation in the shoots. In this context, we hypothesized that cytokinins could correspond to an important root to shoot signal involved in NO3--dependent systemic signaling.The main objective of my PhD project was to decipher and understand how the shoots control root NO3- acquisition in response to spatial NO3- heterogeneity. To do so, we used the 'split-root' system, in which physically isolated roots of a same plant are challenged with different NO3- environments. In this framework, we characterized physiological, metabolic and molecular responses of Arabidopsis wild-type plants that we compared to responses of mutants impaired in cytokinin biosynthesis, acropetal transport or perception. The combination of these different approaches allowed me to demonstrate that cytokinins, and especially trans-zeatin species are indeed a root to shoot messenger that is crucial for root responses to spatial NO3- heterogeneity. Moreover, I have shown that NO3- heterogeneous supply compared to homogeneous supply triggers a substantial reprogramming of gene expression in aerial part, which largely depends on this trans-zeatin transport toward the shoots. Finally, the integration of these transcriptomic modifications into gene networks led to the identification of interesting candidate genes to characterize the shoot-to-root signaling.

La protéine GPR50, qui fait partie de la famille des récepteurs de la mélatonine, est classée, avec une centaine d’autres protéines à sept domaines transmembranaires (7TM), dans la catégorie des récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPG) orphelins, c’est-à-dire pour lesquels aucun ligand n’a pu être identifié. De plus en plus d’études montrent que les 7TM peuvent avoir des fonctions indépendantes d’un ligand. C’est le cas de GPR50 qui inhibe les fonctions du récepteur de la mélatonine MT1 en interagissant directement avec lui. Nous avons cherché à identifier d’autres partenaires associés à GPR50 en appliquant la technique de purification par affinité en tandem et avons mis en évidence son interaction avec un récepteur du facteur de croissance Transforming Growth Factor ß (TGFβ), le récepteur de type I (TβRI).Nous décrivons ici la formation d’un complexe entre GPR50 et le récepteur TβRI au niveau de la membrane plasmique, avec pour conséquence l’induction d’une activité constitutive du récepteur et des voies de signalisation en aval en l’absence de TGFβ, mais également en l’absence du récepteur TßRII qui est habituellement indispensable pour l’activation de TβRI par phosphorylation. Cette activité constitutive se traduit par la phosphorylation des protéines Smad2 et Smad3, leur intégration dans un complexe avec Smad4, la translocation du complexe dans le noyau et finalement l’activation de la transcription de leurs gènes-cibles. Nous avons décrypté les mécanismes moléculaires de cette activation constitutive en montrant que GPR50 entre en compétition, pour l’interaction avec TβRI, avec le régulateur négatif FKBP12, une protéine inhibitrice de l’activité basale du récepteur en l’absence de ligand. Nous avons identifié dans la queue intracytoplasmique de GPR50 un motif répétitif similaire à la séquence de FKBP12 impliquée dans son interaction avec TβRI , motif qui constitue la base moléculaire de cette compétition.Nous avons étudié les conséquences fonctionnelles de cette activation en surexprimant GPR50 de manière stable dans la lignée cellulaire MDA-MB-231, dérivée d’un cancer de sein. Nous avons observé dans ces cellules des effets pro-migratoires et anti-prolifératifs similaires à ceux causés par l’administration de TGFβ.En conclusion, ce travail décrit un nouveau mode d’activation du récepteur TβRI en l’absence de ligand, mais identifie également une nouvelle fonction indépendante d’un ligand pour le RCPG orphelin GPR50. En perspective de ce travail, nous allons essayer d’identifier des conditions biologiques où cette interaction pourrait prendre place afin de confirmer ces résultats dans un contexte plus physiologique. / During the last years, it became more and more accepted, that orphan G Protein coupled receptors (GPCRs) with a transmembrane spanning heptahelical core (7TM) can have ligand-independent functions. One of those 100 orphan GPCRs is GPR50, a 7TM protein with a long cytosolic domain. Recently, studies revealed ligand-independent functions for GPR50, where it has the capacity to modulate the activity of other proteins upon complex formation. By applying a tandem affinity purification approach we sought to identify further putative interacting partners of GPR50. One of the identified binding partners is the transforming growth factor β (TGFβ) receptor type I (TβRI).The TGFβ-dependent signal transduction pathway of serine/threonine kinases is a pathway with direct signal flow from ligand over the receptor to its substrates, the Smads which translocate into nucleus where they bind DNA and regulate gene expression. An important question concerns the generation of specificity and fine-tuning of TGFβ-dependent signaling. Throughout the years, an important number of proteins which regulate the activity of the TGFβ signal transduction pathway in a positive or negative manner have been identified. Most of them act in a cell-context-dependent manner, allowing the regulation of TGFβ signaling adapted to the particular circumstances.We report here the complex formation of GPR50 and TβRI on the plasma membrane. The consequence of this interaction is the GPR50-mediated induction of a constitutive activation of the TβRI and its downstream signaling in a TGFβ ligand-independent manner. This has been monitored by Smad2/3 phosphorylation, Smad2/3-Smad4 complex formation and their subsequent translocation into the nucleus, where they activate Smad-dependent gene expression. In order to decipher the molecular mechanism that allows this activation, we showed that GPR50 competes with the negative regulator, that prevents leaky TGFβ signaling, the gatekeeping molecule FKBP12, for binding to the TβRI. We identified a motif in FKBP12 involved in the interaction with TβRI with similarities to a motif in GPR50, providing a molecular basis for the replacement of FKBP12 by GPR50 in the TβRI complex. We showed that GPR50 is capable of activating the TβRI even in the absence of the TβRII, which normally is required for activating the TβRI by phosphorylation. This reveals a previously unknown mode of activation of the TβRI in absence of the TGFβ ligand and TβRII. In order to identify the functional consequences of this crosstalk, we studied migration and growth of MDA-MB-231 breast cancer cells stably overexpressing GPR50. In these cells, TGFβ-like pro-migratory and anti-proliferative effects have been observed.Future research will help to identify tissues and biological circumstances, where this crosstalk could take place for putting this novel mode of regulation of TGFβ signaling pathway into a context-dependent-manner. Additionally our work established another ligand-independent task for the orphan 7TM protein GPR50, consolidating its function as binding partner and activity modulator.

Les β-arrestines jouent un rôle important dans la transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous montrons dans cette thèse que les β-arrestines exercent des régulations plus complexes et subtiles qu'on ne le pensait jusque-là sur la voie AMPc/PKA/CREB qui est activée par les RCPGs couplés à Gs. Nous montrons que les β-arrestines interagissent directement la PKAcat et contribuent à sa translocation nucléaire. De plus, nous mettons en évidence une interaction β-arrestine/CREB qui conduit à la formation d'un complexe transcriptionnellement actif sous l’action de l’agoniste. D’autre part, nous avons constaté que les β-arrestines interagissent directement avec PKAcat, p70S6K et Src via un même site et lesquelles sont donc potentiellement mutuellement exclusives. Nous avons ensuite mesuré l’impact d’une mutation et d’un polymorphisme du R-FSH sur la signalisation dépendante des β-arrestines, notamment grâce à l’utilisation de senseurs FRET et BRET. / Β-arrestins play an important role in G protein-coupled receptor (GPCR)-induced signal transduction. In this thesis, we show here that β-arrestins exert more complex and subtle regulation than previously thought on the cAMP/PKA/CREB pathway which is activated by Gs-coupled GPCRs. We demonstrate that β-arrestins directly interact with PKAcat and promote its translocation to the nucleus. Moreover, we provide evidence that β-arrestins directly interact with CREB thereby forming a transcriptionally active complex upon agonist stimulation. We also found that PKAcat, p70S6K and Src all directly interact with β-arrestins through the same interaction site and are therefore potential mutually exclusive interactions. We then measured the impact of a point mutation and of a polymorphism in the FSH-R on β-arrestin-dependent signaling, in part using FRET and BRET sensors.

L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire / Cardiomyocyte stretch is a major determinant of ventricular hypertrophy. It stimulates numerous signalling pathways leading to the Mitogen Activated Protein kinases (MAPK) activation. The objective of this thesis was to evaluate the molecular events involved in MAPK ERK and JNK activations during stretch. We studied these pathways by 2 different approaches. We analysed the role of several pivotal proteins involved in ERK and JNK activations and next we evaluated the molecular interactions between different signalling pathways by protein complexes formation induced by stretch and necessary for protein activations. We show that 2 tyrosine Kinases, the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and the Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) are necessary for ERK and JNK activations respectively during stretch with a possible involvement of the small G protein Ras. MAPK and PI3/Akt pathways are generally considered independent but we show that ERK activation is PI3K/Akt dependent during stretch. Thus, we demonstrate that 2 other pathways are associated since PKC and calcineurin form a complex necessary for PKC activation and translocation. This study of signalling pathways and protein interactions sheds a new light on intracellular pathways leading to MAPK activation and may have implications for the development of new drugs in the management of cardiac hypertrophy and failure