Le Syndrome de l'Intestin Irritable (SII) est caractérisé par des douleurs abdominales chroniques, des diarrhées, des constipations ou l'alternance des deux. Les neurones sensitifs des patients seraient surexcitables et ainsi à l'origine de l'hypersensibilité viscérale ressentie. Parmi les médiateurs impliqués dans le SII, les protéases ont un rôle prépondérant notamment car il a été observé une augmentation de leur activité dans des surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII. Ces protéases sont capables d'activer les " Protease-Activated Receptors " (PARs) dans les neurones sensitifs de souris. L'activation des neurones sensitifs murins peut être déclenchée selon un mécanisme dépendant de PAR2 et générant une hypersensibilité viscérale, mais inhibée par un mécanisme dépendant de PAR4. Dans certaines cellules (plaquettes), les PARs ont des rôles très différents entre la souris et l'homme. L'expression et la signalisation des PARs dans les neurones sensitifs humains étant jusqu'alors inconnues, cette thèse a eu pour objectif général d'étudier la signalisation des PARs et d'identifier les effets de médiateurs présents dans les tissus de patients atteints du SII, sur leur capacité à activer des neurones sensitifs humains. Le but ultime était d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII chez l'homme. Le premier objectif a été de mettre au point la culture de neurones humains des ganglions spinaux dorsaux (GSD) thoraciques, contenant des projections coliques de neurones sensitifs. Une culture de neurones sensitifs d'une pureté de 90% a été obtenue, ces neurones étaient viables et fonctionnels, mobilisant du calcium intracellulaire en réponse à différents agonistes pro-nociceptifs. L'expression des PARs a été étudiée dans ces cultures et comparée à celle dans des tissus de GSD frais. PAR1, PAR2 et PAR4 de même que d'autres récepteurs canaux de la famille des " Transcient Receptors Potential " (TRPs) étaient exprimés de façon comparable dans les GSD fraichement isolés et dans les cultures de neurones, validant ainsi le phénotype physiologique des neurones en culture. L'effet des agonistes des PARs a ensuite été étudié sur la signalisation calcique dans ces cultures de neurones sensitifs humains. De tous les agonistes peptidiques des PARs utilisés, seul le peptide activateur de PAR1 a conduit à une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains, tandis que le peptide agoniste de PAR4 l'a réduite. Comme le peptide activateur de PAR1, la thrombine, une protéase capable d'activer à la fois PAR1 et PAR4 a induit une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains. La mobilisation calcique induite par la thrombine a été inhibée par un antagoniste de PAR1 et potentialisée par un antagoniste de PAR4. La thrombine exerce donc un double effet contradictoire sur les neurones sensitifs humains, induisant un signal calcique par l'activation de PAR1 et l'inhibant par l'activation de PAR4. Les surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII mais pas ceux de contrôles sains, ont provoqué un flux calcique dans les neurones sensitifs humains par un mécanisme dépendant de l'activation de PAR1. Nos résultats mettent en évidence l'importance de réduire la sensibilisation des neurones sensitifs humains dépendante de l'activation de PAR1 dans le SII. Notre technique de culture de GSD humains offre de nouvelles applications en neurosciences et nos résultats permettent d'envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques quant à l'utilisation d'un antagoniste de PAR1 pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII. / Irritable Bowel Syndrome (IBS) is characterized by chronic abdominal pain, diarrhea and/or constipation. Sensory neurons from IBS patients are considered to be over-activated, being thereby responsible of the experienced visceral pain. Among mediators involved in IBS, proteases seem to have a prominent role. First, proteolytic activity is increased in the supernatants of colonic biopsies from IBS patients. Second, these proteases activate " Proteases-Activated Receptors " (PARs) in rodent sensory neurons. Rodent primary afferent activation can be induced by a PAR2-dependent mechanism, which generates visceral hypersensitivity. This mechanism can be inhibited by a PAR4-dependent mechanism. In some cell types such as platelets, PARs may have very different functions in rodent versus human. The expression and the signalization of PARs in human sensory neurons have never been explored. The general aim of this thesis was to study the signalization of PARs and to identify the effect of mediators present in tissues from IBS patients, on their ability to activate human sensory neurons. The final objective was to identify new possible therapeutic targets to treat visceral pain associated with IBS. The first objective was to establish a protocol for culturing human sensory neurons isolated from thoracic dorsal root ganglia (DRG). Thoracic DRG contain the stroma of sensory neurons projecting from the colon. The culture of human sensory neurons was 90% pure with viable and functional neurons, which were able to induce calcium flux in response to different pro-nociceptive agonists. PAR expression was studied in cultures and compared to fresh DRG tissues. PAR1, PAR2 and PAR4 as well as others receptors from the " Transcient Receptors Potential " (TRPs) channel family were similarly expressed in neurons from fresh DRG tissues and in cultured sensory neurons, thereby validating the physiological phenotype of human DRG neurons in culture. The effect of PAR agonists was studied by imaging calcium mobilization in human sensory neuron cultures. From all PAR agonist peptides used, only PAR1 agonist peptide was able to increase calcium signaling in human sensory neurons, while PAR4 agonist peptide was able to decrease this calcium signaling. Similar to PAR1 agonist peptide, thrombin a protease capable of activating both PAR1 and PAR4, induced an increase of calcium flux in human sensory neurons. Thrombin-induced calcium mobilization was inhibited by a PAR1 antagonist and was potentiated by a PAR4 antagonist. Thus, thrombin has a contradictory double effect on human sensory neurons, inducing calcium signaling through PAR1 activation and inhibiting calcium signaling through PAR4 activation. In addition, supernatants of colonic biopsies from IBS patients but not from healthy controls, provoked an increased calcium signaling in human sensory neurons. This effect was dependent on the activation of PAR1. In the context of IBS, our results highlight the importance of targeting PAR1-induced sensitization in human sensory neurons. The DRG culture technique we have established offers important and new applications in the domain of neurosciences. All together, these data point to new therapeutic possibilities for the use of PAR1 antagonist in the treatment of visceral pain associated with IBS.

L'autophagie est un processus d'autodigestion qui se produit dans toutes les cellules eucaryotes et conduit à la dégradation d'éléments du cytoplasme (organites, macromolécules) par le lysosome. Ce mécanisme, qui se produit de manière basale, permet le renouvellement du contenu cytoplasmique mais également la survie cellulaire lorsqu'il est induit par différents stress (carence nutritionnelle, hypoxie…). L'autophagie est alors impliquée dans diverses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer car sa dérégulation peut grandement perturber l'homéostasie cellulaire. Le but de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine nucléaire et cytoplasmique BAT3 dans l'autophagie et d'étudier son mécanisme de régulation. Cette protéine de 150 kDa, également appelée BAG6 ou Scythe, est composée de nombreux domaines protéiques (UBL, Prolin-rich, NLS, BAG) qui lui permettent d'interagir avec de multiples partenaires. Sa fonction majeure réside dans le contrôle qualité du cytoplasme mais BAT3 est aussi impliquée dans l'immunité ou l'apoptose. Ce travail identifie la protéine BAT3 comme essentiel pour l'autophagie basale et induite. Nous montrons que son mécanisme d'action passe par la régulation de la localisation de l'acétyltransférase p300 et l'acétylation de ces substrats : p53 et une protéine de la machinerie de l'autophagie : ATG7. En effet, BAT3 (i) limite la présence de p300 dans le cytosol en (ii) maintenant un faible et régulable niveau d'acétylation d'ATG7 et (iii) permet l'acétylation de p53 dans le noyau au cours de la carence nutritionnelle, événement indispensable à l'induction de l'autophagie. / Autophagy, literally meaning self-eating, is a highly evolutionary conserved process in eukaryotes in which parts of the cytoplasm (organelles, macromolecules) are degraded by lysosomes. Basal autophagy is a quality control mechanism allowing the renewal of the cytoplasm but autophagy is also induced by cellular stress (starvation, hypoxia…) to improve cell survival. Autophagy has been implicated in several physiopathologies such as cancer or neurodegenerative diseases. Deregulations of autophagy may profoundly affect homeostasis.The purpose of my thesis is to explore the role of the nucleo-cytoplasmic shuttling protein BAT3 in autophagy and the mechanism of BAT3-dependent autophagy.Also known as BAG6 or Scythe, this 150 kDa protein is composed of various domain (UBL, Prolin-Rich, NLS, BAG) by which BAT3 interacts with multiple partners. The major of role BAT3 seems to be the protein quality control but BAT3 is also implicated in immunity and apoptosis. Our work demonstrates that the protein BAT3 is essential for basal and starvation-induced autophagy. We show that BAT3 regulation of autophagy is mediated by the modulation of p300 acetyltransferase intracellular localization and acetylation of two subtrates: p53 and the autophagy-related protein ATG7. Indeed, Bat3 allows: (i) the limitation of p300 into cytosol resulting in (ii) the maintenance of a low level of ATG7 acetylation and (iii) the increase of the starvation-induced p53 autophagy leading to the induction of autophagy.

Les voies de signalisation canoniques traditionnelles aident à comprendre l'ensemble des processus de signalisation à l'intérieur de la cellule. Les données phosphoprotéomiques à grande échelle donnent un aperçu des altérations entre différentes protéines dans différents contextes expérimentaux. Notre objectif est de combiner les réseaux de signalisation traditionnels avec des données de séries temporelles phosphoprotéomiques complexes afin de démêler les réseaux de signalisation spécifiques aux cellules. Côté application, nous appliquons et améliorons une méthode de séries temporelles caspo conçue pour intégrer des données phosphoprotéomiques de séries temporelles dans des réseaux de signalisation de protéines. Nous utilisons une étude de cas réel à grande échelle tirée du défi HPN-DREAM BreastCancer. Nous déduisons une famille de modèles booléens à partir de données de séries temporelles de perturbations multiples de quatre lignées cellulaires de cancer du sein, compte tenu d'un réseau de signalisation protéique antérieur. Les résultats obtenus sont comparables aux équipes les plus performantes du challenge HPN-DREAM. Nous avons découvert que les modèles similaires sont regroupés dans l'espace de solutions. Du côté informatique, nous avons amélioré la méthode pour découvrir diverses solutions et améliorer le temps de calcul. / Traditional canonical signaling pathways help to understand overall signaling processes inside the cell. Large scale phosphoproteomic data provide insight into alterations among different proteins under different experimental settings. Our goal is to combine the traditional signaling networks with complex phosphoproteomic time-series data in order to unravel cell specific signaling networks. On the application side, we apply and improve a caspo time series method conceived to integrate time series phosphoproteomic data into protein signaling networks. We use a large-scale real case study from the HPN-DREAM BreastCancer challenge. We infer a family of Boolean models from multiple perturbation time series data of four breast cancer cell lines given a prior protein signaling network. The obtained results are comparable to the top performing teams of the HPN-DREAM challenge. We also discovered that the similar models are clustered to getherin the solutions space. On the computational side, we improved the method to discover diverse solutions and improve the computational time.

Le syndrome WHIM (SW) est un déficit immuno-hématologique rare causé principalement par des mutations autosomales dominantes du gène CXCR4 qui entrainent une troncation du domaine C-terminal (C-Ter) du récepteur. Les formes mutantes de CXCR4 associées au SW génèrent des altérations de la désensibilisation et de l’internalisation du récepteur en réponse à CXCL12, qui se traduisent par une hypersensibilité à l’action chimiotactique du ligand. CXCR4 est un récepteur de chimiokine exprimé sur les leucocytes dont le rôle dans l’hématopoïèse et le trafic leucocytaire à l’état basal suggère que la lympho-neutropénie des patients atteints du SW est due à des défauts de production et/ou de domiciliation périphérique des leucocytes causés par le gain de fonction de CXCR4. Néanmoins, la validation de cette hypothèse est difficile chez les patients. En générant une souche de souris (Cxcr4+/1013), porteuse d’une mutation rapportée chez une famille de patients par une stratégie de knock-in, nous avons mis en évidence le rôle du domaine C-Ter de Cxcr4 dans le développement, la domiciliation périphérique des lymphocytes et l’immunité adaptative à médiation humorale.Les principaux résultats issus de notre travail, obtenus en combinant des approches biochimiques, fonctionnelles, de reconstitution de l’hématopoïèse par compétition, de transferts adoptifs et d’injection d’anticorps anti-CD45 in vivo, sont : 1) La mutation Cxcr41013 tronquant le domaine C-Ter se comporte différemment en terme de signalisation, selon qu’elle soit présente à l’état hétérozygote ou homozygote, et perturbe respectivement les transitions double-négatif (DN) 2-DN3 et proB-preB de la lymphopoïèse dans le thymus et la moelle osseuse (MO). Au contraire, elle ne génère pas d’effets sur le développement des cellules NK et la myélopoïèse ; 2) La lymphopénie qui touche les lymphocytes B (LB) et T (LT) est un processus intrinsèque aux cellules porteuses de la mutation Cxcr41013 et suit un modèle allèle-dose-dépendant ; 3) Le défaut de désensibilisation de Cxcr41013 empêche le relargage des lymphocytes NK et B immatures de la MO et celui des LB et LT matures des ganglions lymphatiques dans le sang. A l’inverse, le gain de fonction exacerbe la migration des LB recirculants et LT matures et leur rétention dans le parenchyme médullaire ; et 4) malgré l’absence de follicules primaires dans les ganglions lymphatiques, les souris mutantes sont capables de mettre en place une réponse immunitaire humorale efficace et spécifique d’un antigène T-dépendant, comme en témoigne l’augmentation des LB du centre germinatif et des plasmocytes ayant effectué une commutation isotypique. En conclusion, nous démontrons que la signalisation fine médiée par Cxcr4 est nécessaire pour le développement, la compartimentalisation périphérique et la fonction des lymphocytes. / The WHIM Syndrome (WS) is a rare combined immuno-hematological disorder caused by inherited heterozygous autosomal dominant mutations in CXCR4, which result in most cases in the distal truncation of the receptor’s Carboxyl-terminal tail (C-Tail). Mutants of CXCR4 associated with WS display impaired desensitization and internalization of the receptor upon CXCL12 exposure, leading to enhanced migratory response. Because CXCR4 is expressed on leukocytes, we hypothesized that circulating pan-leukopenia could arise from altered CXCR4-mediated signalling that would skew tissue distribution and differentiation of leukocytes. This assumption was obviously difficult to address in patients. By generating a knock-in mouse strain (Cxcr4+/1013) that harbors a WS-linked gain-of-Cxcr4-function mutation, we establish that the C-tail domain in Cxcr4-mediated signalling is a pivotal regulator of lymphocyte development, peripheral trafficking and humoral immunity. The essential findings of our work, obtained by combining biochemical, bone marrow (BM)-mixed chimeras, in vivo labelling, adoptive co-transfers and functional approaches, are: 1) the C-tail truncating Cxcr41013 mutation caused differential signalling capacities depending on its heterozygous versus homozygous status and inhibited double-negative (DN) 2-to-DN3 and pro-B-to-pre-B developmental transitions during lymphopoiesis. In contrast, it had no effect on NK lymphopoiesis and granulopoiesis; 2) the resulting circulating B and T lymphopenia was due to hematopoietic cell-intrinsic defects and followed a mutated allele dose-dependent pattern; 3) impaired Cxcr41013 desensitization prevented the release of immature BM NK and B cells and mature lymph node (LN) B and T lymphocytes into the blood. Conversely, it forced homing and retention of mature recirculating B and T cells in the BM parenchyma; and 4) despite the absence of primary B-cell follicles in LNs, mutant mice produced efficient humoral responses upon immunization as illustrated by increased antigen-specific germinal center B cells and isotype-switched plasma cells. Collectively, our findings demonstrate that fine-tuning of Cxcr4 signal strength is required for optimal trafficking, egress and fitness of lymphocytes.

Hypothèse : Notre équipe étudie le rôle, mal connu, du trafic membranaire dans le contrôle de l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT par les interférons (IFN), une voie clé du contrôle des processus cancéreux. La liaison de l’IFN-a à son récepteur IFNAR active les kinases JAK1 et TYK2 puis des transducteurs de signal comme STAT1, antiprolifératif, ou STAT3, qui a un pouvoir oncogénique. Le laboratoire a démontré récemment que le trafic membranaire d’IFNAR détermine la spécificité du signal des différents IFNs.L’objet de cette thèse est l’étude du rôle des cavéoles dans ce contrôle. Les cavéoles sont des invaginations membranaires enrichies en cholestérol et glycosphingolipides, formées par l’oligomérisation de la cavéoline1 (Cav1). Les cavéoles ou le gène CAV1 ont souvent été associés à la progression tumorale, notamment des cellules mammaires, mais ce rôle reste énigmatique et controversé. Le fait que IFNAR ait été détecté par biochimie dans des fractions de membrane enrichies en cholestérol et positives pour la cavéoline-1 chez la souris et le fait que l’expression du gène CAV1 ait été corrélée à l’action antitumorale de l’IFNa nous ont conduit à étudier le rôle des cavéoles dans l’action antitumorale des IFNs.Résultats: Le rôle putatif des cavéoles sur le contrôle de la voie JAK/STAT a été étudié dans des cellules murines MLEC n’exprimant pas Cav1 et dans des lignées humaines par interférence ARN contre Cav1. Nous avons pu démontrer que la présence de Cav1 régule de manière opposée deux étapes de la voie de signalisation de STAT3 activée par l’IFN-a. Par contre, ni l’activation de STAT1 par l’IFN-a ni celle de STAT3 par les autres IFNs ne nécessitent Cav1. Parallèlement, le laboratoire a montré que les cavéoles jouent un rôle capital dans la réponse cellulaire aux stress mécaniques en se dépliant lors d’un étirement membranaire, ce qui amortit la tension membranaire. Nous montrons qu’un tel stress mécanique par étirement module spécifiquement la signalisation de STAT3 par l’IFN-a d’une manière dépendante de Cav1 dans les cellules MLEC, suggérant pour la première fois un rôle de STAT3 et de l’IFN-a dans la mécanotransduction dépendante des cavéoles. Ce résultat permet aussi de relier les contraintes mécaniques présentes dans la masse tumorale et leur effet sur la progression tumorale. Perspectives : Les IFNs et la voie JAK/STAT sont bien caractérisés pour leur action antiproliférative, mais si l’IFN-a est utilisé en thérapeutique oncologique, les mécanismes de l’effet antitumoral sont mal connus. Nos résultats impliquent pour la première fois les cavéoles dans l’activation sélective du proto-oncogène STAT3 par l’IFN-a et proposent STAT3 comme un des nouveaux acteurs de la mécanotransduction par les cavéoles. Elucider les mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces deux fonctions inédites des cavéoles devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la progression tumorale. / Hypothesis: Our team studies the poorly investigated role of membrane trafficking in the control of the activation of the JAK / STAT signaling pathway by interferons (IFN), a key mechanism in the control of tumorigenesis. The binding of the IFN-a to its receptor IFNAR activates the kinases JAK1 and TYK2 and then, signal transducers and activators of transcription including the antiproliferative STAT1 or the oncogenic STAT3. The laboratory demonstrated recently that the trafficking of IFNAR at the plasma membrane determines the signal specificity of the various IFNs.The goal of this thesis was to study the role of caveolae in this control. Caveolae are specialized membrane invaginations enriched in cholesterol and glycosphingolipids, formed by the oligomerization of their main structural protein, caveolin-1 (Cav1). Caveolae or the CAV1 gene have often been associated with tumorigenesis, in particular in mammary cancer cells, but this role remains enigmatic and controversial. The fact that IFNAR was previously found in Cav1-positive lipid microdomains and the fact that the expression of the CAV1 gene had been functionally linked to the antitumoral function of IFN-a led us to investigate the role of caveolae in the antitumoral function of the IFNs.Results: The putative role of caveolae in the control of the JAK / STAT signaling pathway have been studied in murine lung endothelial MLEC cells that do not express Cav1 and in a human lineage by RNA interference against Cav1. We were able to demonstrate that the presence of Cav1 regulates in an opposite manner two stages of the signaling pathway of STAT3 activated by the IFN-a whereas the activation of STAT1 by IFN-a, or STAT3 by the other type I and II IFNs do not require Cav1.At the same time, the laboratory showed that caveolae play a major role in the cellular answer to mechanical stress by flattening during a membrane stretching, thus buffering the membrane tension. We show that mechanical stress by uniaxial cell stretching modulates specifically the signaling pathway of STAT3 activated by the IFN-a in a Cav1-dependant manner in MLEC cells. This result suggests for the first time a role of STAT3 and of IFN-a in caveolae-driven mechanotransduction. This result also allows us to link the mechanical constraints found in the tumoral mass to their effect on tumorigenesis.Prospects:The IFNs and the JAK / STAT signaling pathway protect the cells from tumorigenesis, but although IFN-a is used in oncology, the mechanisms of its antitumoral effect are poorly known. Our results involve for the first time caveolae in the selective activation of the proto-oncogenic STAT3 by the IFN-a and allow us to propose STAT3 and the IFN-a as new actors of the mechanotransduction by caveolae. Clarifying the molecular mechanisms involved in these two new functions of caveolae should allow us to identify new therapeutic targets in tumorigenesis.

La conversion de la protéine prion cellulaire (PrPC) en protéine prion scrapie (PrPSc) est à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). La toxicité de la PrPSc est restreinte aux neurones et implique la déviation de la (des) fonction(s) de la PrPC. Une action neurospécifique de la PrPC est le recrutement de la src kinase Fyn. Dans ce travail, nous montrons que la PrPC est capable de mobiliser une autre src kinase, Lyn, via la cavéoline (cav) dans les neurones. Une cible du couplage PrPC-cav-Lyn, restreint aux corps cellulaires, est la kinase GSK3ß. L’inactivation de GSK3ß par la PrPC intervient dans la régulation des fonctions neuronales, en limitant l’activité du récepteur sérotoninergique 1B. D’autre part, nous montrons que dans les cellules infectées par les prions, l’accumulation de PrPSc induit le recrutement constitutif de la plateforme PrPC-cav-Fyn, à l’origine d’un stress oxydant. Ce gain de fonction entraine notamment un défaut de clivage par la metalloprotéase MMP-9, dont une des conséquences est l’accumulation du peptide Aß. Un autre impact de l’infection est la suractivation de la kinase PDK1, qui génère une perte de fonction de la metalloprotéase TACE. Dans des neurones « Alzheimer », on observe également cette cascade délétère, qui dépend de la PrPC. L’inhibition de PDK1 dans des modèles d’infection par les prions ou de maladie d’Alzheimer permet de rétablir l’activité d’alpha-clivage de TACE vis-à-vis de ses substrats, la PrPC, APP et le récepteur au TNF-alpha. L’effet bénéfique observé in vivo permet de définir PDK1 comme une cible thérapeutique potentielle pour les EST et la maladie d’Alzheimer. En résumé, ce travail illustre comment une meilleure connaissance de la fonction de signalisation de la PrPC peut permettre de progresser dans la compréhension des mécanismes de neurodégénérescence associés non seulement aux maladies à prions, mais également à la maladie d’Alzheimer. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are characterized by the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into its scrapie isoform (PrPSc). PrPSc-mediated toxicity is restricted to neurons and results from the subversion of PrPC function(s). Some neuronal specificity of PrPC signaling relates to its coupling to the Fyn src kinase. In this work, we report that PrPC has the capacity to mobilize another src kinase, Lyn, via caveolin in neurons. A downstream effector of the PrPC-cav-Lyn signaling complex, which is spatially restricted to cell bodies, is the GSK3ß kinase. The inactivation of GSK3ß by PrPC takes part to the control of neuronal functions by negatively regulating the activity of the serotonin 1B receptor. Furthermore, we show that in prion-infected cells, PrPSc constitutively activates the PrPC-cav-Fyn platform, leading to oxidative-stress conditions. This toxic gain of PrPC function induces a defect in metalloproteinase MMP-9 activity, leading to increased Aß levels. Another impact of prion infection is the overactivation of the PDK1 kinase, which results in the loss of function of the TACE metalloproteinase. PDK1 overactivation is also observed in neurons from Alzheimer’s disease model mice, and is shown to be PrPC dependent. PDK1 inhibition in models of prion infection or Alzheimer’s disease restores TACE-mediated alpha-cleavage of PrPC, APP and TNF-alphareceptor. Since positive effects of PDK1 inhibition are observed in vivo, our data posit PDK1 as a putative therapeutic target to combat TSE disorders and Alzheimer’s disease. In summary, achieving a better knowledge of PrPC signaling function may help to improve our understanding of the mechanisms sustaining neurodegeneration in prion and Alzheimer’s diseases.

La dérégulation de la transcription résultant de mutations des molécules clés des voies de signalisation est une caractéristique des cancers. Dans les mélanomes, les facteurs de transcription MITF et BRN-2 contrôlent la survie, la prolifération, la différenciation et la migration/invasion cellulaire, avec une forte expression de MITF caractérisant les cellules les plus différenciées. BRN-2 est surexprimé dans les cellules de mélanomes où il peut réprimer l’expression de MITF conduisant ainsi les cellules vers un phénotype moins différencié et plus invasif. Comment BRN-2 est régulé est une question majeure. Nous avons montré que l’expression de BRN-2 est modulée en réponse aux variations des concentrations en oxygène et glucose et que cet effet est en partie médié par la PI3K. L’inhibition de la voie PI3K réduit l’invasion des cellules de mélanome et diminue l’expression des protéines BRN-2 et PAX3. PAX3 régule l’expression de BRN-2 par liaison directe sur son promoteur. Ces résultats suggèrent, qu’en plus des voies β-caténine/LEF1 et BRAF/MAPK, la voie PI3K régule l’expression de BRN-2 et pourrait jouer un rôle majeur dans le changement du phénotype prolifératif à invasif / Deregulation of transcription arising from mutations in key signaling molecules is a hallmark of cancer. In melanoma, MITF and BRN-2 transcription factors control survival, proliferation, differentiation and migration/ invasiveness, with high levels of MITF being a characteristic of differentiated melanocytes. BRN-2 represses MITF expression, thereby driving cells to a less differentiated and more invasive phenotype. How BRN-2 is regulated is therefore a key issue. We showed that up-regulation of BRN-2 expression in response to glucose involves the PI3K pathway. Inhibition of PI3K reduces invasiveness and decreases the levels of BRN-2 and PAX3. We showed that PAX3 regulates BRN-2 expression by direct binding on its promoter. Altogether, our results highlight a crucial role for the PI3K pathway in regulating BRN-2 expression and imply that PI3K signaling may be a key determinant of melanoma subpopulation diversity and prime cells for a proliferative to invasive phenotype switch.

Les REMORINES du groupe 1 sont des protéines spécifiques des plantes, localisées dans la membrane plasmique. Nous avons montré que StREM1.3 (REM) constitue un marqueur des radeaux lipidiques, des domaines membranaires du plasmalemme enrichis en stérols et sphingolipides. De plus, REM se trouve enrichie dans les plasmodesmes (PD), des canaux ancrés dans la paroi qui assurent les communications intercellulaires. Nous avons mis en évidence pour la première fois le rôle physiologique de REM dans la plante, cette protéine est capable de ralentir la propagation virale du Potato Virus X (PVX) et d’autres virus. Par ailleurs, l’activité antivirale de REM est régulée par phosphorylation et conduit à une modification de la taille du pore des PD par dépôt de callose. Des candidats protéiques ont été sélectionnées et leur validation fonctionnelle a été initiée in planta par des approches de transgénèse, en expression transitoire et sur des plantes transgéniques soumises à des infections virales pour étudier la propagation des virus. Des approches de biochimie d’interaction des protéines, et d’imagerie ont également été envisagés. Le sujet de cette thèse vise à appréhender les mécanismes de l’interaction de REM avec ses partenaires dans la membrane lors de l’infection virale, en se focalisant sur les interactions protéines-protéines lors de la réponse au PVX. Nous nous intéresserons plus particulièrement aux protéines des PD et des radeaux membranaires qui sont très probablement ciblées lors de cette interaction avec les virus. / Group 1 REMORINs are plant-specific proteins located at the plasma membrane. We have shown that StREM1.3 (REM) is a marker of lipid rafts, plasma membrane domains enriched in sterols and sphingolipids. In addition, REM is enriched in plasmodesmata channels (PD) which are anchored within the cell wall and enable intercellular communication between virtually all plant cells. We have demonstrated for the first time the physiological role of REM in plants, this protein is able to reduce the viral cell-to-cell movement of Potato Virus X (PVX) and other viruses. Moreover, the antiviral activity of REM is regulated by phosphorylation and leads to a modification of the pore size of PD via the accumulation of callose, a sugar polymer, around the neck regions of PD. In order to understand how REM is able to induce the accumulation of callose in these specific regions, a large set of proteins have been selected and the deciphering of their functions have been initiated in planta by transgenic approaches, in transient expression and on transgenic plants, which will be subjected to viral infections to study the spread of viruses. Protein interaction, biochemistry and imaging approaches were also used to study this question. This thesis aims at understanding the mechanisms of the REM interaction with its membrane partners during viral infection, focusing on the protein-protein interactions during the response to PVX. We will focus more particularly on PD proteins and membrane rafts that are most likely targeted during this interaction with viruses

La doxorubicine (DXR) est l’un des médicaments les plus efficaces en chimiothérapie, mais sonapplication clinique est limitée par ses effets cardiotoxiques. Malgré des décennies de recherche, sesmécanismes pathogéniques ne sont toujours pas entièrement compris. Il s’ensuit qu’aucun traitementsatisfaisant, curatif ou préventif, n’existe. Dans cette étude, nous recherchons les mécanismes designalisation cellulaire impliqués. Deux modèles expérimentaux de toxicités, aigue d’une part (coeurisolé et perfusé de rat avec la DXR), et chronique d’autre part (rat traité à la DXR), ont permis deréaliser une étude ciblée (sur les voies de signalisation énergétiques) et deux études systémiques(phosphoprotéomique et transcriptomique). Les résultats combinés de ces travaux ont montré que laDXR modifiait le niveau de phosphorylation (activation) ou l’expression génique de protéinesimpliquées dans trois domaines fonctionnels distincts : métabolisme énergétique, réponses au stress,et structure/fonction du sarcomère. (i) Métabolisme énergétique : nous avons confirmé la surprenanteinhibition de l’AMPK, probablement provoquée par un contrôle négatif exercé par des partenaires designalisation (Akt et ERK), plutôt que par une modification des kinases activatrices en amont. Nousavons également montré l’augmentation du niveau de phosphorylation de la PDH, ce qui, en inhibantl’enzyme, ralentit le cycle de Krebs. Cependant, nous avons également observé un phénomènecompensatoire de surexpression de gènes codant pour des enzymes de la glycolyse et du cycle deKrebs ; (ii) Réponses au stress : dans nos modèles, la DXR génère des stress énergétique,génotoxique et oxydatif. Cependant, seuls quelques mécanismes compensatoires sont activés (lesvoies de signalisation de DNA-PK–Akt–GSK3, diverses chaperonnes). Les autres semblent êtreinhibées suggérant que l’amoindricement des réponses au stress serait un des mécanismes de lacardiotoxicité de la DXR; (iii) Structure/fonction du sarcomère: L’augmentation de la phosphorylationde la desmine ainsi que la réduction du nombre de transcrits codant pour des protéines essentiellesau développement cardiaque normal pourraient être la cause de la désorganisation du réseaumyofibrillaire. En conclusion, ces résultats révèlent potentiellement de nouveaux mécanismes de lacardiotoxicité induite par la DXR et permettent d’envisager de nouvelles cibles moléculaires pour ledéveloppement de stratégies protectrices. / Doxorubicin (DXR) is an efficient anticancer drug, the use of which is limited by seriouscardiotoxicity. Despite decades of research, its pathogenic mechanisms are not fully understood, andefficient preventive or curative strategies are not available. Here we address the question whethermechanisms in cardiac cell signaling contribute to the toxicity phenotype. Using experimental modelsfor acute (DXR-perfused, isolated rat hearts) or chronic toxicity (rats injected with DXR), we conducteda targeted study (focusing on energy signaling pathways) and two non-biased studies(phosphoproteomics and transcriptomics). The combined data reveal DXR-induced alterations inphosphorylation (activation) status or gene expression of proteins in mainly three functional domains:energy metabolism, stress responses, and sarcomere structure. (i) Energy metabolism: We confirm aparadox inhibition of AMPK signaling, that is rather due to inhibitory cross-talk with related signalingpartners (Akt, ERK) than impaired AMPK upstream signaling. We also show, among others, theincrease of inhibitory phosphorylation of pyruvate dehydrogenase, slowing down Krebs cycle, but alsoa compensating upregulation of glycolysis and Krebs cycle enzyme transcripts. (ii) Stress-responses:In our models, DXR generates energetic, oxidative and genotoxic stress, but only some compensatorystress responses are activated (DNA-PK–Akt–GSK3 pathway, chaperones). Many others seem to beinhibited, suggesting a blunted response to stress as component of DXR toxicity. (iii) Sarcomerestructure/function: We detect increased phosphorylation of desmin and reduced transcripts essentialfor e.g. normal heart development as potential causes for a disorganized myofibrillar network. Inconclusion, these results reveal some novel potential mechanisms of DXR-induced cardiotoxicity andsuggest new targets for protective strategies.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.