Au cours des dernières années, des thérapies anti-cancéreuses ciblant l'angiogenèse tumorale ont été développées et ont démontré un bénéfice en terme de survie globale pour les patients atteints de certains cancers métastatiques. Cependant, dans de nombreux cas, les tumeurs acquièrent des résistances échappent au traitement. Le développement de nouveaux composés anti-angiogène est donc une réelle nécessité pour être proposés en seconde ligne thérapeutique. Dans ce travail, notre objectif était d'identifier de nouvelles molécules anti-angiogènes par le criblage à haut débit, de la chimiothèque académique de l'Université de Grenoble. Nous avons adapté le test de blessure sur cellules endothéliales au format des plaques de 96 puits et avons identifié une famille de molécules qui inhibent spécifiquement leur fermeture. L'activité anti-angiogène de la molécule leader (COB223) a été confirmée dans des modèles d'angiogenèse tridimensionnels in vitro, et, chez la souris, dans un modèle d'angiogenèse sous-cutanée. Nous avons testé l'activité anti-tumorale de COB223 dans un modèle de xénogreffe chez la souris et observé une diminution significative de la taille des tumeurs dans les souris traitées. A la recherche de son mécanisme d'action, nous avons observé que COB223 inhibe la prolifération cellulaire et diminue les phosphorylations de MEK et Raf, de ERK1/2 induites par le VEGF-A dans les cellules endothéliales. Nous avons également montré que COB223 n'inhibe pas les phosphorylations du VEGFR2 et de PLC. D'après ces résultats, nous proposons que la cible de COB est localisée dans la voie de signalisation VEGF/ PLC /PKC/ERK entre PKC et Ras. / Several anti-tumoral therapies targeting angiogenesis have been developed over the recent years and have demonstrated benefits for several metastatic cancers. However, in many cases, resistances to these treatments appear over time, allowing tumor escape. The development of new anti-angiogenic compounds is thus dramatically urged in order to propose second-line anti-angiogenic treatments. In this work, our aim was to identify new anti-angiogenic compounds through high throughput screening of the academic library from the University of Grenoble. We adapted the endothelial cell scratch assay to 96-well plates. We identified a family of molecules that specifically inhibited endothelial cell migration. The anti-angiogenic activity of the leader molecule (COB223) was confirmed in vitro in 3D cellular models of angiogenesis and in vivo using a mouse model of subcutaneous sponge implantation. We tested the anti-tumoral activity of COB223 on a mouse xenograft model. We observed that tumor growth was significantly reduced in treated mice correlated with decreased microvessel density. In search for its mechanism of action, we observed that COB223 inhibits cell proliferation and reduces VEGF-A-induced phosphorylation of MEK and ERK1/2 in endothelial cells. We also showed that COB223 did not affect VEGFR2 and PLC phosphorylation but reduces Raf phosphorylation responsible for its activity. These results allow us to propose that the molecular site of action of COB223 is located in the VEGF/ PLC /PKC/ERK pathway, between PKC and MEK.

Programmed death-1 (PD-1) et ses ligands PD-L1 et PD-L2 appartiennent à la famille B7 : CD28 des molécules de cosignalisation immunitaire. Leur interaction délivre un signal inhibiteur à l’activation lymphocytaire. Ces molécules sont impliquées non seulement dans le contrôle de la tolérance, mais aussi dans un mécanisme d’échappement tumoral et viral au système immunitaire. Les deux ligands de PD-1 : PD-L1 et PD-L2 montrent une expression tissulaire assez large, témoignant de leur rôle étendu aux différents stades de la réponse immunitaire. L’expression de PD-L1 est plus large que celle de PD-L2. PD-L1 est exprimé sur les cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques, PDL2 présente une expression assez restreinte aux CPAs professionnelles. L’expression de PD-L1 et PD-L2 est fortement régulée dans plusieurs cas pathologiques et notamment dans les cancers. La régulation de l’expression de PD-L2 qui fait l’objet de notre étude, représente une cible importante dans le domaine de l’immunothérapie. Notre projet porte sur l’analyse de l’expression, la régulation et la fonction de PD-L2 dans les LT, dans différents contextes physiologiques et pathologiques. Nous avons pu démontrer que PD-L2 qui avait été décrit chez la souris pour son expression restreinte aux CDs et aux macrophages, était de façon surprenante exprimé avec son homologue PD-L1 sur les LT après costimulation CD3+CD28. Nous l’avons confirmé ex vivo par activation par Staphylococcal enterotoxin E. Ce résultat montre que PD-L2 est bien induit sur des LT dans des conditions d’activation physiologique ou pathologique. Nous avons pu démontrer aussi une régulation négative de l’expression transcriptionnelle et protéique de PD-L1 et de PDL2 sous l’effet de la CyclosporineA (CsA). Cet effet est indépendant de l’action de l’IL-2. Nos données d’analyses bioinformatiques nous ont permis d’identifier les sites putatifs de fixation de facteurs de transcription au niveau du promoteur du gène pd-l2, qui peuvent être régulés par la CsA. L’analyse de la fonction de PDL2 sur les LT nous a permis de démontrer que la stimulation de PDL2 par des anticorps monoclonaux fabriqués dans le laboratoire inhibait l’activation T. Nos résultats démontrent pour la première fois une fonction de PDL2 et une signalisation « reverse siglaling » dans les LT potentiels. La caractérisation fonctionnelle et l’étude des voies de signalisation de PD-L2 que nous avons déjà étudié dans notre projet, représentent une piste importante à explorer. Cela permettrait de proposer de nouvelles stratégies permettant de lutter contre les mécanismes d’échappement tumoral. / PD-1 (programmed death-1) is a new CD28 families member, that deliver inhibitory signals that regulate the balance between T cell activation, tolerance, and immunopathology. (1) (ref octa).PD-1, is inducibly expressed on T cells. The PD-1 ligands PD-L1 (B7-H1) and PD-L2 (B7-DC) exhibit distinct patterns of expression: PD-L1 is expressed more broadly than is PD-L2. PD-L1 is expressed on resting and up regulated on hematopoietic, nonhematopoietic cells and cancer cell. However, PD-L2 is expressed only on professional antigen-presenting cells. In addition, it has been demonstrated that PD-L1 and PD-L2 are differentially regulated by Th1 and Th2 cytokines.Suggesting that PD-L2 is regulated differently in the former versus the latter, and this proved to be the case, both in transcription and promotion (2) (ref octa) However, little is known about the regulation of PD-L2 expression and nine is known about the expression of PD-L2 on T cells. In the present study, we observed in the first time, by flow cytometer and real time PCR (RT PCR) that PD-L2 expression is induced on ex vivo on activated CD4+ and CD8+ T cells, on in vitro on activated JURKAT T cell line and this expression is inhibited by the immunosuppressive drogue Cyclosporin A (CsA). In the second time we showed that PD-L2 is up regulated in vivo on Non hodchkin lymphoma, other up regulation of PD-L2 expression is observed on Vb8+ T cells after PBMC treatment with the Staphylococcal enterotoxin E (SEE) super antigen. Finally, we attributed a function to PD-L2 to be a co-inhibitory molecule for CD4+ T cells activation.

Les cellules communiquent avec leur environnement par l’intermédiaire d’un réseau de transduction du signal, leur permettant d’interpréter des signaux physico-chimiques et de produire des réponses appropriées. Ce mécanisme est orchestré par des cascades de signalisation, qui jouent le rôle d’émetteurs intracellulaires en transférant des stimuli biochimiques entre la membrane et le noyau. Il a été montré qu’une perturbation peut se propager en amont (et pas seulement en aval) d’une cascade par un phénomène appelé rétroactivité. Notre étude vise à comparer les conditions biochimiques qui favorisent un et/ou l’autre sens de signalisation dans des cascades linéaires. Au moyen d’approches analytiques et numériques, nous avons caractérisé les différents régimes de signalisation résultants, que nous avons résumés avec une représentation graphique compacte. Nous avons également développé le concept de profil d’activation d’une voie de signalisation qui est, pour un stimulus donné, la séquence des protéines activées à chaque niveau de la cascade à l’état stationnaire. Ces séquences correspondent à des morceaux d’orbites d’un système dynamique discret bidimensionnel. A partir de l’étude des portraits de phase, en fonction des paramètres biochimiques, nous avons étudié les propriétés de contraction/expansion autour des points fixes et de leurs bifurcations. Nous avons classifié les niveaux de cascade en trois types et examiné leur impact biologique au sein d’un réseau de signalisation. Cette méthode a également fourni une vision globale de l’interaction entre la signalisation en avant et rétroactive, et de l’amplification du signal le long du profil d’activation de la cascade / Living cells communicate with their external environment, by means of a signal transduction network, which allows them to interpret physico-chemical signals and produce appropriate responses. This complex machinery is orchestrated by signaling cascades, which play the role of intracellular transmitters, by transferring biochemical stimuli between cellular membrane and nucleus. It has been shown that a perturbation can propagate upstream (and not only downstream) a cascade, through a phenomenon called retroactivity. Our investigation aims to compare the biochemical conditions promoting one and/or the other direction of signaling in linear cascades. By means of analytical and numerical approaches, we have answered to this question, by characterizing the arising different signaling regimes, and we have designed a compact graphical representation to relay the gist of such conditions. We have also developed the concept of pathway activation profile which is, for a given stimulus, the sequence of activated proteins at each tier of the cascade, at steady state. Such sequences correspond to pieces of orbits of a two-dimensional discrete dynamical system. From the study of the possible phase portraits, as a function of the biochemical parameters, we focused on the contraction/expansion properties around the fixed points of this discrete map, and their bifurcations. We have deduced a classification of the cascade tiers into three main types, whose biological impact within a signaling network has been examined. This method also provided global insights about the interplay between forward and retroactive signaling, and how signal is amplified along the cascade activation profile

Le rôle des protéines avec un motif TerD est depuis toujours insaisissable. La séquence en acides aminés qui correspond au motif TerD est répandue dans les génomes de plusieurs espèces bactériennes. Les recherches effectuées dans le cadre de ce doctorat avaient pour objectif d’identifier le rôle du gène tdd8 (SCO2368) qui code pour une protéine avec un motif TerD chez Streptomyces coelicolor. Sur la base d’une étude comparative du transcriptome de souches présentant une expression différentielle de tdd8, il a été possible de déterminer l’implication de tdd8 dans plusieurs systèmes de régulation. Les résultats obtenus ont permis d'établir que le niveau d’expression de tdd8 peut jouer un rôle dans le mécanisme de la différenciation morphologique et de la sporulation, dans le métabolisme de l’azote et dans l’équilibre redox. La protéine Tdd8 semble avoir un rôle dans divers processus cellulaires de par son implication dans l’homéostasie du calcium intracellulaire qui a été démontrée dans cette étude. Parmi les gènes qui semblent affectés par le taux d’expression de tdd8, ces recherches ont identifié un regroupement de gènes impliqués dans la réponse au stress redox. La plupart de ces gènes sont positionnés sur deux loci et leur expression implique un système de régulation analogue au régulon DosR retrouvé chez Mycobactérium tuberculosis. La croissance de la souche M145 de S. coelicolor en conditions de stress (hypoxie et présence d’oxyde nitrique) a permis de confirmer l’induction de ces gènes et des recherches bioinformatiques ont permis d’identifier un motif de liaison DosR dans les séquences qui précèdes la région codante de plusieurs gènes situés dans les deux loci identifiés. Les recherches ont également permis une meilleure caractérisation du métabolisme de l’azote et notamment une implication de tdd8 dans la régulation de ce métabolisme. Ces travaux s’inscrivent dans un processus de recherche fondamentale qui permet de mieux comprendre le rôle des protéines avec un motif TerD.

Encore aujourd'hui, la majorité des analgésiques utilisés en clinique pour le traitement des douleurs modérées à sévères ciblent le récepteur opioïdergique mu (MOP). Toutefois, l'usage répété d'opiacés s'accompagne de plusieurs effets secondaires, comme la constipation, la nausée et la sédation. De plus, il est maintenant bien établi que les différents agonistes de MOP n'ont pas tous le même potentiel analgésique autant qu'ils n'activent pas tous les mêmes cascades de signalisation à un niveau similaire. Ce dernier concept est connu sous l'appellation de sélectivité fonctionnelle. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires menant respectivement à l'effet analgésique et aux effets secondaires devrait ainsi permettre de développer de nouveaux candidats présentant un effet thérapeutique tout en s'accompagnant de peu d'effets secondaires. La signalisation intracellulaire est habituellement caractérisée via l'utilisation de méthodes ne permettant l'analyse que d'un seul paramètre, tels que la mesure de la mobilisation du calcium intracellulaire ou encore la production d'AMPc. Or, l'étude de la sélectivité fonctionnelle requiert plutôt une approche permettant d'évaluer les réponses cellulaires globales suivant l'activation d'un récepteur. Dans cette optique, plusieurs biosenseurs sans marqueurs ont récemment été développés afin de répondre à ce besoin. Dans cette étude, nous avons donc utilisé la spectroscopie par résonance des plasmons de surface comme approche sans marquage pour étudier la signalisation de MOP suivant son activation par la morphine et le DAMGO, deux agonistes présentant des propriétés de signalisation nettement distinctes. Plus précisément, trois voies de signalisation de MOP ont été ciblées, soit le couplage aux protéines G, l'activation de ERK1/2 et l'internalisation du récepteur. Malgré le fait que les signaux SPR de la morphine et du DAMGO ne montrent aucune différence notable, les résultats obtenus démontrent que la SPR est une technique très sensible pour étudier la signalisation suivant l'activation de MOP. À cet effet, nos résultats montrent que les signaux SPR sont initiés par l'activation de la protéine Gαi et que les niveaux d'AMPc ainsi que les kinases ERK1/2 contribuent grandement au signal SPR. Finalement, nos résultats démontrent que certains antagonistes de MOP se comportent plutôt comme des agonistes partiels ou inverses.

Les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) sont des médiateurs lipidiques pro-inflammatoires impliqués dans l'asthme, liant trois récepteurs couplés aux protéines G: CysLT[indice inférieur 1], CysLT[indice inférieur 2] et GPR99. Des polymorphismes de deux de ces récepteurs, CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 2]-M201V, ont été fortement associés à l’atopie, une prédisposition aux allergies, alors que le polymorphisme CysLT[indice inférieur 1]-I206S n’y est pas significativement associé. Il a été montré précédemment que le variant CysLT[indice inférieur 2]-M201V avait une signalisation diminuée. L'objectif du projet était d'étudier la signalisation cellulaire des variants CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 1]-I206S, ainsi que l’interaction du variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S avec le récepteur CysLT[indice inférieur 2]-M201V. La lignée cellulaire HEK-293 a été transfectée avec les ADNs plasmidiques codant pour des récepteurs de type sauvage et mutants. L’expression de surface des récepteurs a été vérifiée par cytométrie en flux. La production d’inositol phosphates (IPs) et la transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l’IL-13 ont été mesurées par essai IP-1 et essai luciférase, respectivement, en réponse au LTD[indice inférieur 4] et LTC[indice inférieur 4]. Ensuite, la phosphorylation de principaux effecteurs de signalisation (Erk1/2, p65, p38 et c-Jun) suite à l’activation des récepteurs par le LTD[indice inférieur 4], a été évaluée par immunobuvardage Western. Enfin, l’interaction entre les récepteurs a été étudiée par des expériences de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et BiFC (Bimolecular Fluorescent Complementation), en plus d’expériences de type fonctionnel en co-expression. L’expression de surface des récepteurs mutants et de type sauvage est équivalente. Le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S induit une plus forte production d’IPs et une plus grande transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l'IL-13 que le récepteur de type sauvage. De plus, la phosphorylation de Erk1/2 est également augmentée par l’activation de ce variant. Par contre, le récepteur CysLT[indice inférieur 1]-I206S ne montre pas de différence significative dans sa transduction de signal. La co-expression des récepteurs CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 2]-M201V n’affecte pas leur expression de surface, mais résulte en une faible transactivation du promoteur de l’IL-8 et une production réduite d’IPs en réponse au LTD[indice inférieur 4]. Enfin, les récepteurs ont la capacité d’interagir et de dimériser entre eux. En conclusion, ces résultats suggèrent que le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S induit une plus forte réponse que le récepteur de type sauvage. Cependant, bien qu’il puisse dimériser et interagir avec le variant CysLT[indice inférieur 2]-M201V, ce dernier domine la réponse combinée lorsqu’il est co-exprimé avec le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S.

La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.

L'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] de l'angiotensine II (Ang II) est associée à différentes réponses cellulaires dont l'inhibition de prolifération, le contrôle de l'apoptose et l'induction de la différenciation. Au cours du développement, le récepteur AT[indice inférieur 2] est fortement présent dans les tissus foetaux mais son expression chute drastiquement, quelques heures après la naissance. Chez l'adulte, seulement quelques tissus expriment ce récepteur (cellules glomérulées de la surrénale, utérus, cellules granulosa de l'ovaire et certaines zones du cerveau) mais sa ré-expression peut être observée au cours de certaines conditions pathologiques (défaillance cardiaque ou rénale, dommages tissulaires, lésions du système nerveux central). Ces observations suggèrent que le récepteur AT[indice inférieur 2] joue un rôle important au cours du développement, dans les processus de réponses aux blessures et dans les mécanismes d'adaptation. Dans les cellules NG108-15, l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'Ang II induit la différenciation neuronale (Laflamme et al . 1996). Puisque les cibles intracellulaires du récepteur AT[indice inférieur 2] sont peu connues, le but de nos études était de déterminer les mécanismes d'action associés à son activation dans l'induction de l'élongation des neurites. Le récepteur AT[indice inférieur 2] n'est couplé à aucun des seconds messagers classiques (AMPc, production d'InsPs, Ca[indice supérieur 2+] ). Les effets connus du récepteur AT[indice inférieur 2] sont une augmentation ou une diminution des niveaux de monoxyde d'azote (NO) et de GMPc et, selon les modèles cellulaires et les conditions de culture utilisés, il peut activer ou inhiber les phosphatases et les p42/p44[indice supérieur mapk] en plus de modifier l'excitabilité membranaire (inhibition des courants calciques et activation des canaux potassiques). Dans les cellules NG108-15, nous avons trouvé que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'Ang II induit l'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] par un mécanisme indépendant de la petite protéine G p21[indice supérieur ras] , un processus essentiel à l'induction de l'élongation des neurites (Gendron et al . 1999). Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse montrent que la production de NO, suite à l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'Ang II, est impliquée dans l'induction de la différenciation neuronale. Nous avons en effet observé que l'Ang II, par un mécanisme dépendant des protéines G[alpha indice inférieur i] , mène à une augmentation rapide des niveaux intracellulaires de GMPc, un second messager impliqué dans l'élongation et dans le branchement neuritique des cellules NG108-15. Bien que cette voie est essentielle à la différenciation neuronale, nous avons trouvé qu'elle n'est pas impliquée dans l'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] .L'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] par l'Ang II, qui est Ras- et NO-indépendante, est plutôt induite par une voie alternative impliquant les protéines Rap1 et B-Raf.L'application d'Ang II dans les cellules NG108-15 mène en effet à l'activation rapide de Rap1 (1-5 min) et de B-Raf (5-15 min), événement essentiel à la fois pour l'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] et pour l'induction de la différenciation des cellules NG108-15. Finalement, nous avons montré que l'activation de cette voie se fait par un mécanisme indépendant de l'AMPc et de la PKA. Ensemble, nos résultats montrent que le récepteur AT[indice inférieur 2] active les voies nNOS/NO/GCs/GMPc et Rap1/B-Raf/MEK/MAPK, et que ces cascades participent de façon parallèle, à l'induction de la différenciation neuronale des cellules NG108-15, par un mécanisme indépendant de l'AMPc et de la PKA.

L'endothélium constitue un véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant des fonctions cardiovasculaires vitales telles que le tonus et la croissance vasculaires. Ce tissu requiert la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la modulation de la concentration intracellulaire de Ca[indice supérieur 2+].L'un des moyens utilisés par les cellules endothéliales pour assurer une réponse calcique efficace et spécifique est la propagation des signaux sous forme de vagues. Dans ce travail, nous avons décortiqué les mécanismes de mobilisation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire menant à la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+]. Nous avons recueilli des données qui aideront à mieux comprendre à la fois l'organisation et la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+] dans les cellules endothéliales d'aorte de boeuf (BAEC). Nous montrons par vidéomicroscopie, que la stimulation des BAEC avec l'ATP ou avec la bradykinine (BIC) induit une réponse calcique oscillatoire finement régulée dans le temps et dans l'espace. En fait, le Ca[indice supérieur 2+] se propage d'une extrémité à l'autre de la cellule sous la forme d'une vague qui se produit en présence ou en absence de Ca[indice supérieur 2+] extracellulaire. Bien que les vagues de Ca[indice supérieur 2+] soient initiées à un endroit très précis près de la membrane plasmique, les cavéoles ne sont pas essentielles à leur propagation dans les BAEC, contrairement à ce qui a été observé dans certains autres types cellulaires. Toutefois, la dépolymérisation des microfilaments avec la latrunculine B et des microtubules avec la colchicine empêche la propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+]. Dans ces conditions, les BAEC présentent plutôt une augmentation calcique uniforme dans toute la cellule. Ces résultats suggèrent que, dans les BAEC, les cavéoles ne sont pas impliquées dans l'organisation de la réponse calcique sous forme de vague, mais que l'organisation du cytosquelette est essentielle. Nous montrons aussi que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] est constante d'un bout à l'autre d'une BAEC, ce qui est incompatible avec un mécanisme impliquant uniquement la diffusion de l'IP[indice inférieur 3] ou du Ca[indice supérieur 2+]. Nous montrons également que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] dépend de l'intensité de la stimulation et aussi de l'état fonctionnel de l'IP[indice inférieur 3]R qui peut être modulé par des kinases endogènes comme la PKA, la PKC et mTOR. Enfin, nous montrons que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] n'est pas directement reliée à l'amplitude de la relâche de Ca[indice supérieur 2+]. La vitesse de propagation des vagues de Ca[indice supérieur 2+] est un paramètre relativement nouveau dans le domaine de la signalisation calcique intracellulaire. Il reste à définir jusqu'à quel point ce paramètre peut être utile dans l'interprétation des différentes activités cellulaires.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisation de TPß en rapprochant dans un complexe multi-protéique le récepteur TPß et ses effecteurs G?q et PLCß2. Pour faire suite à cette étude, nous avons investigué le rôle de WDR36 dans l'activation de la voie des MAPKs produite par l'activation de TPß. Nous démontrons que WDR36 augmente l’activation de ERK1/2, mais pas de p38 ou JNK. L’activation progresse via la cascade PLCß-PKC-c-Raf-MEK1/2-ERK1/2. L’interaction entre WDR36 et les membres de cette cascade est présente de façon basale et est modulée par la stimulation de TPß. L’expression de WDR36 semble également être importante pour l’interaction c-Raf-ERK1/2 et MEK1/2-ERK1/2. Ces résultats suggèrent que WDR36 assemble un complexe multi-protéique facilitant la phosphorylation et l’activation de ERK1/2. Cette phosphorylation accrue se traduit par une augmentation de la translocation nucléaire de ERK1/2 activées, de la production de c-Fos et de la prolifération cellulaire. Finalement, l’effet positif de WDR36 sur l’activation de ERK1/2 peut également être observé suite à une stimulation des cellules avec des facteurs de croissance retrouvés dans le sérum. Ces deux études supportent un modèle dans lequel WDR36 agit à titre de protéine d'échafaudage dans la signalisation du récepteur TPß en rapprochant ce dernier de ses effecteurs G?q et PLCß2, et en réunissant les membres de la voie d'activation de ERK1/2. Cette caractérisation des rôles de WDR36 est d’autant plus importante, puisque différents variants de WDR36 sont maintenant associés à différents cancers. À cet égard, WDR36 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la recherche sur le cancer. [symboles non conformes]