Les cellules communiquent avec leur environnement par l’intermédiaire d’un réseau de transduction du signal, leur permettant d’interpréter des signaux physico-chimiques et de produire des réponses appropriées. Ce mécanisme est orchestré par des cascades de signalisation, qui jouent le rôle d’émetteurs intracellulaires en transférant des stimuli biochimiques entre la membrane et le noyau. Il a été montré qu’une perturbation peut se propager en amont (et pas seulement en aval) d’une cascade par un phénomène appelé rétroactivité. Notre étude vise à comparer les conditions biochimiques qui favorisent un et/ou l’autre sens de signalisation dans des cascades linéaires. Au moyen d’approches analytiques et numériques, nous avons caractérisé les différents régimes de signalisation résultants, que nous avons résumés avec une représentation graphique compacte. Nous avons également développé le concept de profil d’activation d’une voie de signalisation qui est, pour un stimulus donné, la séquence des protéines activées à chaque niveau de la cascade à l’état stationnaire. Ces séquences correspondent à des morceaux d’orbites d’un système dynamique discret bidimensionnel. A partir de l’étude des portraits de phase, en fonction des paramètres biochimiques, nous avons étudié les propriétés de contraction/expansion autour des points fixes et de leurs bifurcations. Nous avons classifié les niveaux de cascade en trois types et examiné leur impact biologique au sein d’un réseau de signalisation. Cette méthode a également fourni une vision globale de l’interaction entre la signalisation en avant et rétroactive, et de l’amplification du signal le long du profil d’activation de la cascade / Living cells communicate with their external environment, by means of a signal transduction network, which allows them to interpret physico-chemical signals and produce appropriate responses. This complex machinery is orchestrated by signaling cascades, which play the role of intracellular transmitters, by transferring biochemical stimuli between cellular membrane and nucleus. It has been shown that a perturbation can propagate upstream (and not only downstream) a cascade, through a phenomenon called retroactivity. Our investigation aims to compare the biochemical conditions promoting one and/or the other direction of signaling in linear cascades. By means of analytical and numerical approaches, we have answered to this question, by characterizing the arising different signaling regimes, and we have designed a compact graphical representation to relay the gist of such conditions. We have also developed the concept of pathway activation profile which is, for a given stimulus, the sequence of activated proteins at each tier of the cascade, at steady state. Such sequences correspond to pieces of orbits of a two-dimensional discrete dynamical system. From the study of the possible phase portraits, as a function of the biochemical parameters, we focused on the contraction/expansion properties around the fixed points of this discrete map, and their bifurcations. We have deduced a classification of the cascade tiers into three main types, whose biological impact within a signaling network has been examined. This method also provided global insights about the interplay between forward and retroactive signaling, and how signal is amplified along the cascade activation profile

Le rôle des protéines avec un motif TerD est depuis toujours insaisissable. La séquence en acides aminés qui correspond au motif TerD est répandue dans les génomes de plusieurs espèces bactériennes. Les recherches effectuées dans le cadre de ce doctorat avaient pour objectif d’identifier le rôle du gène tdd8 (SCO2368) qui code pour une protéine avec un motif TerD chez Streptomyces coelicolor. Sur la base d’une étude comparative du transcriptome de souches présentant une expression différentielle de tdd8, il a été possible de déterminer l’implication de tdd8 dans plusieurs systèmes de régulation. Les résultats obtenus ont permis d'établir que le niveau d’expression de tdd8 peut jouer un rôle dans le mécanisme de la différenciation morphologique et de la sporulation, dans le métabolisme de l’azote et dans l’équilibre redox. La protéine Tdd8 semble avoir un rôle dans divers processus cellulaires de par son implication dans l’homéostasie du calcium intracellulaire qui a été démontrée dans cette étude. Parmi les gènes qui semblent affectés par le taux d’expression de tdd8, ces recherches ont identifié un regroupement de gènes impliqués dans la réponse au stress redox. La plupart de ces gènes sont positionnés sur deux loci et leur expression implique un système de régulation analogue au régulon DosR retrouvé chez Mycobactérium tuberculosis. La croissance de la souche M145 de S. coelicolor en conditions de stress (hypoxie et présence d’oxyde nitrique) a permis de confirmer l’induction de ces gènes et des recherches bioinformatiques ont permis d’identifier un motif de liaison DosR dans les séquences qui précèdes la région codante de plusieurs gènes situés dans les deux loci identifiés. Les recherches ont également permis une meilleure caractérisation du métabolisme de l’azote et notamment une implication de tdd8 dans la régulation de ce métabolisme. Ces travaux s’inscrivent dans un processus de recherche fondamentale qui permet de mieux comprendre le rôle des protéines avec un motif TerD.

Encore aujourd'hui, la majorité des analgésiques utilisés en clinique pour le traitement des douleurs modérées à sévères ciblent le récepteur opioïdergique mu (MOP). Toutefois, l'usage répété d'opiacés s'accompagne de plusieurs effets secondaires, comme la constipation, la nausée et la sédation. De plus, il est maintenant bien établi que les différents agonistes de MOP n'ont pas tous le même potentiel analgésique autant qu'ils n'activent pas tous les mêmes cascades de signalisation à un niveau similaire. Ce dernier concept est connu sous l'appellation de sélectivité fonctionnelle. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires menant respectivement à l'effet analgésique et aux effets secondaires devrait ainsi permettre de développer de nouveaux candidats présentant un effet thérapeutique tout en s'accompagnant de peu d'effets secondaires. La signalisation intracellulaire est habituellement caractérisée via l'utilisation de méthodes ne permettant l'analyse que d'un seul paramètre, tels que la mesure de la mobilisation du calcium intracellulaire ou encore la production d'AMPc. Or, l'étude de la sélectivité fonctionnelle requiert plutôt une approche permettant d'évaluer les réponses cellulaires globales suivant l'activation d'un récepteur. Dans cette optique, plusieurs biosenseurs sans marqueurs ont récemment été développés afin de répondre à ce besoin. Dans cette étude, nous avons donc utilisé la spectroscopie par résonance des plasmons de surface comme approche sans marquage pour étudier la signalisation de MOP suivant son activation par la morphine et le DAMGO, deux agonistes présentant des propriétés de signalisation nettement distinctes. Plus précisément, trois voies de signalisation de MOP ont été ciblées, soit le couplage aux protéines G, l'activation de ERK1/2 et l'internalisation du récepteur. Malgré le fait que les signaux SPR de la morphine et du DAMGO ne montrent aucune différence notable, les résultats obtenus démontrent que la SPR est une technique très sensible pour étudier la signalisation suivant l'activation de MOP. À cet effet, nos résultats montrent que les signaux SPR sont initiés par l'activation de la protéine Gαi et que les niveaux d'AMPc ainsi que les kinases ERK1/2 contribuent grandement au signal SPR. Finalement, nos résultats démontrent que certains antagonistes de MOP se comportent plutôt comme des agonistes partiels ou inverses.

Les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) sont des médiateurs lipidiques pro-inflammatoires impliqués dans l'asthme, liant trois récepteurs couplés aux protéines G: CysLT[indice inférieur 1], CysLT[indice inférieur 2] et GPR99. Des polymorphismes de deux de ces récepteurs, CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 2]-M201V, ont été fortement associés à l’atopie, une prédisposition aux allergies, alors que le polymorphisme CysLT[indice inférieur 1]-I206S n’y est pas significativement associé. Il a été montré précédemment que le variant CysLT[indice inférieur 2]-M201V avait une signalisation diminuée. L'objectif du projet était d'étudier la signalisation cellulaire des variants CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 1]-I206S, ainsi que l’interaction du variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S avec le récepteur CysLT[indice inférieur 2]-M201V. La lignée cellulaire HEK-293 a été transfectée avec les ADNs plasmidiques codant pour des récepteurs de type sauvage et mutants. L’expression de surface des récepteurs a été vérifiée par cytométrie en flux. La production d’inositol phosphates (IPs) et la transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l’IL-13 ont été mesurées par essai IP-1 et essai luciférase, respectivement, en réponse au LTD[indice inférieur 4] et LTC[indice inférieur 4]. Ensuite, la phosphorylation de principaux effecteurs de signalisation (Erk1/2, p65, p38 et c-Jun) suite à l’activation des récepteurs par le LTD[indice inférieur 4], a été évaluée par immunobuvardage Western. Enfin, l’interaction entre les récepteurs a été étudiée par des expériences de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et BiFC (Bimolecular Fluorescent Complementation), en plus d’expériences de type fonctionnel en co-expression. L’expression de surface des récepteurs mutants et de type sauvage est équivalente. Le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S induit une plus forte production d’IPs et une plus grande transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l'IL-13 que le récepteur de type sauvage. De plus, la phosphorylation de Erk1/2 est également augmentée par l’activation de ce variant. Par contre, le récepteur CysLT[indice inférieur 1]-I206S ne montre pas de différence significative dans sa transduction de signal. La co-expression des récepteurs CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 2]-M201V n’affecte pas leur expression de surface, mais résulte en une faible transactivation du promoteur de l’IL-8 et une production réduite d’IPs en réponse au LTD[indice inférieur 4]. Enfin, les récepteurs ont la capacité d’interagir et de dimériser entre eux. En conclusion, ces résultats suggèrent que le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S induit une plus forte réponse que le récepteur de type sauvage. Cependant, bien qu’il puisse dimériser et interagir avec le variant CysLT[indice inférieur 2]-M201V, ce dernier domine la réponse combinée lorsqu’il est co-exprimé avec le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S.

La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.

L'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] de l'angiotensine II (Ang II) est associée à différentes réponses cellulaires dont l'inhibition de prolifération, le contrôle de l'apoptose et l'induction de la différenciation. Au cours du développement, le récepteur AT[indice inférieur 2] est fortement présent dans les tissus foetaux mais son expression chute drastiquement, quelques heures après la naissance. Chez l'adulte, seulement quelques tissus expriment ce récepteur (cellules glomérulées de la surrénale, utérus, cellules granulosa de l'ovaire et certaines zones du cerveau) mais sa ré-expression peut être observée au cours de certaines conditions pathologiques (défaillance cardiaque ou rénale, dommages tissulaires, lésions du système nerveux central). Ces observations suggèrent que le récepteur AT[indice inférieur 2] joue un rôle important au cours du développement, dans les processus de réponses aux blessures et dans les mécanismes d'adaptation. Dans les cellules NG108-15, l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'Ang II induit la différenciation neuronale (Laflamme et al . 1996). Puisque les cibles intracellulaires du récepteur AT[indice inférieur 2] sont peu connues, le but de nos études était de déterminer les mécanismes d'action associés à son activation dans l'induction de l'élongation des neurites. Le récepteur AT[indice inférieur 2] n'est couplé à aucun des seconds messagers classiques (AMPc, production d'InsPs, Ca[indice supérieur 2+] ). Les effets connus du récepteur AT[indice inférieur 2] sont une augmentation ou une diminution des niveaux de monoxyde d'azote (NO) et de GMPc et, selon les modèles cellulaires et les conditions de culture utilisés, il peut activer ou inhiber les phosphatases et les p42/p44[indice supérieur mapk] en plus de modifier l'excitabilité membranaire (inhibition des courants calciques et activation des canaux potassiques). Dans les cellules NG108-15, nous avons trouvé que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'Ang II induit l'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] par un mécanisme indépendant de la petite protéine G p21[indice supérieur ras] , un processus essentiel à l'induction de l'élongation des neurites (Gendron et al . 1999). Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse montrent que la production de NO, suite à l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'Ang II, est impliquée dans l'induction de la différenciation neuronale. Nous avons en effet observé que l'Ang II, par un mécanisme dépendant des protéines G[alpha indice inférieur i] , mène à une augmentation rapide des niveaux intracellulaires de GMPc, un second messager impliqué dans l'élongation et dans le branchement neuritique des cellules NG108-15. Bien que cette voie est essentielle à la différenciation neuronale, nous avons trouvé qu'elle n'est pas impliquée dans l'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] .L'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] par l'Ang II, qui est Ras- et NO-indépendante, est plutôt induite par une voie alternative impliquant les protéines Rap1 et B-Raf.L'application d'Ang II dans les cellules NG108-15 mène en effet à l'activation rapide de Rap1 (1-5 min) et de B-Raf (5-15 min), événement essentiel à la fois pour l'activation des p42/p44[indice supérieur mapk] et pour l'induction de la différenciation des cellules NG108-15. Finalement, nous avons montré que l'activation de cette voie se fait par un mécanisme indépendant de l'AMPc et de la PKA. Ensemble, nos résultats montrent que le récepteur AT[indice inférieur 2] active les voies nNOS/NO/GCs/GMPc et Rap1/B-Raf/MEK/MAPK, et que ces cascades participent de façon parallèle, à l'induction de la différenciation neuronale des cellules NG108-15, par un mécanisme indépendant de l'AMPc et de la PKA.

L'endothélium constitue un véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant des fonctions cardiovasculaires vitales telles que le tonus et la croissance vasculaires. Ce tissu requiert la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la modulation de la concentration intracellulaire de Ca[indice supérieur 2+].L'un des moyens utilisés par les cellules endothéliales pour assurer une réponse calcique efficace et spécifique est la propagation des signaux sous forme de vagues. Dans ce travail, nous avons décortiqué les mécanismes de mobilisation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire menant à la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+]. Nous avons recueilli des données qui aideront à mieux comprendre à la fois l'organisation et la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+] dans les cellules endothéliales d'aorte de boeuf (BAEC). Nous montrons par vidéomicroscopie, que la stimulation des BAEC avec l'ATP ou avec la bradykinine (BIC) induit une réponse calcique oscillatoire finement régulée dans le temps et dans l'espace. En fait, le Ca[indice supérieur 2+] se propage d'une extrémité à l'autre de la cellule sous la forme d'une vague qui se produit en présence ou en absence de Ca[indice supérieur 2+] extracellulaire. Bien que les vagues de Ca[indice supérieur 2+] soient initiées à un endroit très précis près de la membrane plasmique, les cavéoles ne sont pas essentielles à leur propagation dans les BAEC, contrairement à ce qui a été observé dans certains autres types cellulaires. Toutefois, la dépolymérisation des microfilaments avec la latrunculine B et des microtubules avec la colchicine empêche la propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+]. Dans ces conditions, les BAEC présentent plutôt une augmentation calcique uniforme dans toute la cellule. Ces résultats suggèrent que, dans les BAEC, les cavéoles ne sont pas impliquées dans l'organisation de la réponse calcique sous forme de vague, mais que l'organisation du cytosquelette est essentielle. Nous montrons aussi que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] est constante d'un bout à l'autre d'une BAEC, ce qui est incompatible avec un mécanisme impliquant uniquement la diffusion de l'IP[indice inférieur 3] ou du Ca[indice supérieur 2+]. Nous montrons également que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] dépend de l'intensité de la stimulation et aussi de l'état fonctionnel de l'IP[indice inférieur 3]R qui peut être modulé par des kinases endogènes comme la PKA, la PKC et mTOR. Enfin, nous montrons que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] n'est pas directement reliée à l'amplitude de la relâche de Ca[indice supérieur 2+]. La vitesse de propagation des vagues de Ca[indice supérieur 2+] est un paramètre relativement nouveau dans le domaine de la signalisation calcique intracellulaire. Il reste à définir jusqu'à quel point ce paramètre peut être utile dans l'interprétation des différentes activités cellulaires.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisation de TPß en rapprochant dans un complexe multi-protéique le récepteur TPß et ses effecteurs G?q et PLCß2. Pour faire suite à cette étude, nous avons investigué le rôle de WDR36 dans l'activation de la voie des MAPKs produite par l'activation de TPß. Nous démontrons que WDR36 augmente l’activation de ERK1/2, mais pas de p38 ou JNK. L’activation progresse via la cascade PLCß-PKC-c-Raf-MEK1/2-ERK1/2. L’interaction entre WDR36 et les membres de cette cascade est présente de façon basale et est modulée par la stimulation de TPß. L’expression de WDR36 semble également être importante pour l’interaction c-Raf-ERK1/2 et MEK1/2-ERK1/2. Ces résultats suggèrent que WDR36 assemble un complexe multi-protéique facilitant la phosphorylation et l’activation de ERK1/2. Cette phosphorylation accrue se traduit par une augmentation de la translocation nucléaire de ERK1/2 activées, de la production de c-Fos et de la prolifération cellulaire. Finalement, l’effet positif de WDR36 sur l’activation de ERK1/2 peut également être observé suite à une stimulation des cellules avec des facteurs de croissance retrouvés dans le sérum. Ces deux études supportent un modèle dans lequel WDR36 agit à titre de protéine d'échafaudage dans la signalisation du récepteur TPß en rapprochant ce dernier de ses effecteurs G?q et PLCß2, et en réunissant les membres de la voie d'activation de ERK1/2. Cette caractérisation des rôles de WDR36 est d’autant plus importante, puisque différents variants de WDR36 sont maintenant associés à différents cancers. À cet égard, WDR36 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la recherche sur le cancer. [symboles non conformes]

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.