Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le récepteur à chimiokine CXCR4 est à ce jour l’un des récepteurs couplés aux protéines G les plus étudiés. Le CXCL12, sa chimiokine endogène induit l’activation de plusieurs voies de signalisation cruciales à plusieurs processus physiologiques. Par ailleurs, dans de nombreux processus pathologiques comme le cancer, le récepteur CXCR4 et/ou son ligand endogène sont surexprimés et facilite la dissémination et le maintien de conditions favorables à la prolifération cancéreuse. Afin d’étudier le récepteur CXCR4 et sa signalisation, notre approche vise à développer des ligands ciblant le CXCR4 en se basant sur CXCL12. Par des études de relation structure-activité et du design rationnel, nous avons conçu des chimères du CXCR4. Ces outils pharmacologiques nous permettent de mieux extraire les déterminants structuraux impliqués dans l’activation du CXCR4 mais aussi d’étudier les voies de signalisation associées à ces nouvelles entités chimiques. Nos données de relation structure-activité ont permis de mettre en évidence deux positions clés sur le N-terminal de nos chimères, la position 3 et la position 7 cruciales pour l’affinité et l’efficacité respectivement. Nous avons pu moduler l’efficacité ainsi que l’affinité de nos chimères en introduisant des acides aminés non naturels capables de potentialiser l’effet pharmacologique. Nous avons également corrélé nos résultats de SAR avec de la dynamique moléculaire réalisée à partir des deux structures cristallographiques du CXCR4. Nos données de dynamique moléculaire montrent des différences structurales importantes au niveau des domaines transmembranaires 3 et 7 en présence ou non de nos chimères. Par ailleurs, nous avons développé un nouveau déterminant avec des propriétés pharmacocinétiques améliorées comparativement au déterminant d’affinité des chimères de première génération. La caractérisation de ce déterminant a par ailleurs révélé son caractère agoniste inverse. Tous ces résultats apportent des éléments clés pour un meilleur design de molécules à visée thérapeutique ciblant le CXCR4.

L'apeline, ligand endogène du Récepteur Couplé aux Protéines G, APJ, joue un rôle majeur au niveau cardiovasculaire, notamment dans l'angiogenèse physiologique et la néovascularisation tumorale. Par une étude profiling array, notre équipe à mis en évidence que le gène de l'apeline est surexprimé dans un tiers des adénocarcinomes humains, et de manière intéressante, avec une fréquence très élevée (2/3) dans les cancers du pancréas. Ainsi, mon projet de thèse avait pour but de caractériser l'implication du système apelinergique dans le cancer du pancréas. L'adénocarcinome pancréatique canalaire (ADK) est la forme la plus commune des cancers du pancréas et la découverte de biomarqueurs et nouvelles cibles potentielles est particulièrement importante pour ce cancer dont le diagnostic est tardif et les traitements peu efficaces. Par une approche immunohistochimique sur des coupes d'ADK humains (49 patients), nous avons mis en évidence que l'apeline et APJ sont fortement exprimés par les cellules tumorales pancréatiques. Dans le but de caractériser l'expression spatio-temporelle de l'apeline et de son récepteur au cours de la carcinogenèse pancréatique, nous avons étudié par immunohistochimie leur expression dans des modèles murins d'ADK. Ainsi, dans les souris K-ras (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) récapitulant les stades précoces de la pathologie, et le modèle murin KPC (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) qui développe un ADK jusqu'au stade invasif, nos résultats mettent en évidence que l'apeline et son récepteur APJ sont exprimés par les cellules tumorales et ce, dès les premiers stades de la carcinogenèse. Afin d'étudier la fonction de la voie de signalisation apeline, nous avons caractérisé les cascades de transduction activées par l'apeline dans la lignée tumorale pancréatique humaine MiaPaCa qui exprime de façon endogène APJ et l'apeline comme retrouvé in vivo.Dans ces cellules, l'apeline induit la stimulation transitoire des ERKs et de la p70S6 Kinase, l'activation prolongée d'Akt et la phosphorylation inhibitrice de GSK3 stabilisant ainsi la Beta-caténine. De manière intéressante, mes travaux mettent en évidence que l'activation de la voie MAPK induite par l'apeline est dépendante de la protéine Gi. A l'inverse, la stimulation soutenue de la voie PI3K/Akt est indépendante de la voie G mais implique l'internalisation du récepteur. De plus, l'apeline régule positivement la quantité protéique de c-myc et cycline D1 tous deux impliqués dans la prolifération cellulaire, ainsi que de l'Hexokinase 2 permettant de maintenir un fort flux glycolytique, essentiel aux besoins énergétiques de la cellule tumorale. Ces résultats sont en accord avec les effets cellulaires que nous observons puisque l'apeline stimule la prolifération, la capture du glucose ainsi que la migration des cellules tumorales, des propriétés essentielles participant à la progression tumorale.Dans ce contexte, la surexpression de l'apeline et de son récepteur dans l'ADK et l'effet de cette de voie de signalisation sur la cellule tumorale fait de ce couple ligand/récepteur une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement du cancer du pancréas. / Apelin, the endogenous ligand of the human G-protein coupled receptor, APJ, is a key regulator of cardiovascular system, notably during physiological and tumor angiogenesis. Using a cancer profiling array approach, our team clearly showed that apelin gene is overexpressed in one third of the human carcinomas, with the highest frequency (2/3) in pancreatic cancers. Thus, the aim of my PhD project was to characterize apelin signaling function during pancreatic carcinogenesis. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common form of pancreatic cancer and the discovery of biomarkers and new therapeutic targets is of crucial interest for this cancer since this cancer is diagnosed too late and there is no effective therapy. By an immunohistochemistry approach on human PDAC slides (49 patients), we show that apelin and APJ are strongly expressed by pancreatic tumor cells. In order to characterize apelin and APJ spatio-temporal expression during pancreatic carcinogenesis, we have studied their expression by immunohistochemistry in genetically engineered mouse models of PDAC. In the K-ras mouse model (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) which recapitulates early stages of the disease, and in the KPC mouse model (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) which develops PDAC until invasive stages, our results demonstrate that apelin and its receptor are expressed by tumor cells since the first steps of carcinogenesis. In order to study apelin signaling function, we have characterized signal transduction pathways activated by apelin in MiaPaCa human pancreatic cancer cell line endogenously expressing apelin and APJ as observed in vivo. In these cells, apelin induces transient activation of ERKs and p70S6 Kinase, a sustained Akt activation and an inhibitory phosphorylation of GSK3 thus allowing Beta-catenin stabilization. Interestingly, my results demonstrate that the MAPK pathway activation apelin induced is Gi protein dependent. Conversely, long term stimulation of PI3K/Akt pathway is G protein independent but instead involves receptor internalization. Moreover, apelin positively regulates on one hand c-myc and cyclin D1 protein levels, both of them being implicated in cell proliferation and on the other hand, intracellular protein content of Hexokinase 2 in order to ensure high glycolytic flux which is essential for tumor cells energy supply. These results are in agreement with cellular effects that we observed since apelin stimulates proliferation, glucose uptake and migration of tumor cells which are essentials properties for tumor progression. Accordingly, apelin and APJ overexpression in PDAC and the effects of this signaling pathway on tumor cells make of this ligand/receptor couple a new potential therapeutic target for pancreatic cancer treatment.

Les maladies à prions et d’Alzheimer appartiennent à un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans le système nerveux central (SNC) de protéines amyloïdes, respectivement la PrPSc et les peptides Aβ. Même si ces maladies ont des étiologies et des manifestations physiopathologiques distinctes, il est suspecté que des mécanismes communs de neurodégénérescence puissent être mobilisés dans ces différentes affections du SNC. Les maladies à prions s’imposent comme un paradigme qui permet l’étude des maladies neurodégénératives amyloïdes. Disposer d’un agent infectieux, la protéine prion scrapie, PrPSc, présente l’avantage de pouvoir initier un processus neurodégénératif et de cerner la nature et la séquence des événements menant à la perte d’homéostasie neuronale. Les mécanismes mis en évidence grâce à l’infection à prions peuvent être objectivés dans d’autres maladies neurodégénératives. Dans les maladies à prions, il est clairement établi que la PrPSc exerce sa toxicité dans les neurones en déviant la/les fonction(s) de la forme non pathologique des prions, la protéine prion cellulaire, PrPC. Les travaux du laboratoire ont permis d’assigner une fonction de signalisation à la PrPC et d’identifier plusieurs intermédiaires de signalisation contrôlés par la PrPC, ce qui a conduit à proposer plusieurs rôles pour la PrPC dans les neurones : régulation de l’équilibre d’oxydoréduction, adhérence, neuritogenèse, survie, contrôle des fonctions associées au neuromédiateur. Une partie de mes travaux de thèse a permis d’illustrer une nouvelle facette de la PrPC dans le contrôle des fonctions neuronales. Au travers d’un couplage à la kinase Lyn et d’une interaction avec la protéine LRP1 et le cuivre, la PrPC du corps cellulaire gouverne l’état d’activation de la kinase GSK3β, qui à son tour, contrôle le trafic et l’activité d’un autorécepteur sérotoninergique, le récepteur 5HT1B. En modulant l’activité de ce récepteur, la PrPC favorise la neurotransmission. A partir de l’infection à prions, mes travaux dévoilent des mécanismes de neurodégénérescence communs aux maladies à prions et à la maladie d’Alzheimer (AD). Dans les neurones infectés par les prions, comme les neurones dérivés de souris modèles pour AD, la suractivation de la kinase PDK1 provoque la phosphorylation et l’internalisation de l’αsécrétase TACE, ce qui annule l’activité neuroprotectrice de TACE à la membrane plasmique. TACE internalisée est découplée de trois de ses substrats, (i) la PrPC, ce qui favorise sa conversion en PrPSc, (ii) la protéine précurseur des peptides amyloïdes APP, ce qui augmente la production des peptides neurotoxiques Aβ et (iii) les récepteurs au TNFα, ce qui rend les neurones malades vulnérables au stress inflammatoire. In vitro comme in vivo, l’inhibition de PDK1 permet de rétablir l’activité neuroprotectrice de TACE et de contrecarrer les effets neurotoxiques de la PrPSc ou de Aβ. Mes travaux établissent également que les Rho kinases (ROCK) sont des régulateurs positifs de l’activité de PDK1. Dans un contexte physiologique, les ROCK interagissent avec PDK1 et phosphorylent PDK1, contribuant à son activité basale. Dans un contexte infectieux, le gain d’activité des ROCK augmente le « pool » de molécules de PDK1 qui interagissent avec et sont phosphorylées par les ROCK, à l’origine de la suractivation de PDK1. Inhiber les ROCK exerce un double effet protecteur dans les neurones infectés par les prions en abaissant le niveau de PrPSc via le module de signalisation PDK1TACE et en préservant la polarité et la connectivité des neurones par action sur le cytosquelette d’actine. Le module ROCKPDK1 émerge comme une cible thérapeutique potentielle pour les maladies à prions et autres maladies neurodégénératives amyloïdes. / Pas de résumé en anglais

La voie Wnt est une voie de signalisation importante pour l’embryogenèse, la morphogenèse et l’homéostasie des tissus au stade adulte. Des mutations dans cette voie de signalisation sont souvent associées à une létalité embryonnaire ou à des pathologies sévères.Une caractéristique singulière de la signalisation Wnt est sa grande complexité génétique. Chez les vertébrés, ce sont 19 ligands Wnt différents qui peuvent potentiellement lier les 10 membres de la famille des récepteurs Frizzled (Fz). De plus, la liaison d’un ligand Wnt à un récepteur Fz peut conduire à l’activation d’au moins trois voies de transduction distinctes. Pourtant, l’interaction Wnt/Fz est incompatible avec une reconnaissance monospécifique étant donné que Wnt et Fz interagissent via des résidus conservés dans les deux familles. Les patrons d’expression des différents Wnt et des différents Fz sont complexes et souvent chevauchant. Malgré cela, la délétion sélective d’un Wnt peut conduire à des phénotypes spécifiques non-observés lors de la délétion d’un autre ligand Wnt co-exprimé. C’est notamment le cas des ligands Wnt7a et Wnt7b. Seules leurs expressions par les progéniteurs neuronaux permettent d’activer la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules endothéliales malgré l’expression simultanée d’autres ligands Wnt. Dès lors, comment les cellules des vertébrés sont-elles capables de discriminer les différents ligands Wnt ?L’étude de l’activation des signalisations induites par les ligands Wnt7a et Wnt7b permet d’illustrer par quel mécanisme moléculaire des co-récepteurs, tels que Gpr124 et Reck, médient la reconnaissance spécifique d’un ligand Wnt et permettent la formation d’un signalosome spécifique. Reck est un récepteur spécifique des ligands Wnt7a et Wnt7b qui permet de les discriminer de tous les autres ligands Wnt. Il interagit avec ceux-ci via une région intrinsèquement désordonnée et divergente dans la famille Wnt appelée « le peptide linker ». Etant donné que cette région est exposée au solvant et qu’elle ne comprend pas les sites d’interaction avec le récepteur Fz, elle pourrait jouer un rôle critique dans la discrimination des différents ligands Wnt. Gpr124, quant à lui, interagit avec Reck via son domaine extracellulaire et permet la co-localisation de ce dernier et des récepteurs Fz dans le même signalosome. Pour ce faire, Gpr124 interagit avec la protéine adaptatrice Dvl via son domaine intracellulaire. Le recrutement membranaire et la polymérisation de Dvl permettent la formation d’une plateforme d’ancrage facilitant la formation du complexe Reck/Gpr124/Fz/Lrp5/6 qui active alors sélectivement la voie la signalisation Wnt/β-caténine en réponse aux ligands Wnt7a et Wnt7b. L’identification d’un tel mécanisme de décodage laisse supposer qu’il pourrait exister plusieurs modules de reconnaissance spécifique adaptés à d’autres ligands Wnt assurant ainsi un réglage précis de la signalisation Wnt en fonction du contexte moléculaire de la membrane plasmique. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un des cancers les plus létaux, tuant environ 95% des patients diagnostiqués à 5 ans. A l'heure actuelle, aucune chimiothérapie curative n'est disponible. La voie PI3K est une des voies les plus altérées dans les cancers. En particulier, dans la moitié des cancers pancréatiques, une augmentation d'activité de la voie PI3K/Akt/mTOR a été décrite et corrélée à un mauvais pronostic. Les enzymes de signalisation phosphoinositide-3-kinase (PI3K) de classe I sont présentes chez les mammifères sous plusieurs isoformes (p110a, p110ß p110d et p110y). Les isoformes p110a et p110ß sont ubiquitaires alors que p110d et p110y sont majoritairement exprimées dans les cellules immunitaires. Toutes les isoformes de classe I présentent un domaine d'activation par Ras, dont la fonctionnalité reste à être approfondie. Les PI3Ks de classe I phosphorylent le PIP2 en PIP3, un second messager lipidique capable de réguler des fonctions biologiques très variées telles que la prolifération ou la différenciation cellulaire. Bien que les rôles physiologiques des différentes isoformes de PI3K commencent à être connus, le débat actuel dans le domaine des PI3Ks est de savoir quelle isoforme cibler dans le traitement des cancers. Il a récemment été publié que la dépendance à la voie PI3K/Akt d'une tumeur est liée, selon l'organe et les altérations génétiques associées, à l'activité d'une isoforme. La mutation activatrice de l'oncogène KrasG12D est retrouvée dans plus de 90% des cas d'adénocarcinomes pancréatiques et est reconnue comme la mutation " initiatrice " du PDAC. Les souris qui présentent une activation constitutive de l'oncogène KrasG12D reproduisent toutes les étapes de la carcinogenèse pancréatique humaine, des lésions prénéoplasiques jusqu'à l'adénocarcinome (5% des souris à 12 mois). Partant des constats que les PI3K et Kras interagissent physiquement et que seules p110a et p110ß sont exprimées dans le pancréas sain, l'objectif de mon projet de thèse était de déterminer si les deux isoformes ubiquitaires de PI3K pouvaient jouer des rôles différents dans l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. Pour cela, nous avons généré un nouveau modèle murin qui associe la mutation de l'oncogène KrasG12D avec une inactivation conditionnelle de l'activité kinase de p110a ou de p110ß, mimant ainsi l'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique spécifique. Durant ma thèse, j'ai démontré que seule l'isoforme p110a est nécessaire à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. De manière dose-dépendante, l'inactivation d'une seule copie de p110a prolonge significativement la survie des animaux, tandis que les souris présentant une inactivation complète de l'activité kinase de p110a ne développent pas de lésion prénéoplasique. L'inactivation de cette seule isoforme bloque totalement la transdifférenciation des acini, normalement induite par Kras muté ou lors d'une pancréatite aigüe. p110a contrôle cette reprogrammation cellulaire, ainsi que les modifications morphologiques associées, en régulant les petites GTPases Rho, intermédiaires de signalisation essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. De plus, l'activité kinase de p110a est essentielle au maintien d'autres voies de signalisation oncogéniques comme les voies EGFR/MAPK, NF-kB ou encore IL6/STAT3. Dans un modèle de carcinogenèse pancréatique agressif où le suppresseur de tumeur p53 est partiellement inactivé, p110a exprimée dans l'épithélium est impliquée dans la progression tumorale en régulant la prolifération des cellules canalaires mais également, celle des cellules du microenvironnement par une action possiblement paracrine. Cette étude est la première démonstration génétique in vivo de l'implication d'une isoforme de PI3K dans le cancer du pancréas, et apporte un rationnel en faveur de l'utilisation des inhibiteurs spécifiques de p110a dans le traitement du cancer du pancréas. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal cancers, with a 5-yr survival rate <5% of diagnosed patients. No efficient chemotherapy is currently available. PI3K signaling is one of the most altered signaling pathways in cancer. In half of PDAC, PI3K/Akt/mTOR activation is increased and correlated with poor prognosis. Mammals have four isoforms of Class I PI3K (p110a, p110ß p110d and p110y)which activate the Akt/mTOR signaling pathway. p110a and p110ß are ubiquitously expressed whereas p110d and p110y are mainly expressed in immune cells. All PI3K isoforms possess a Ras-binding domain whether it is functional for all isoforms remains to be demonstrated. Upon cell stimulation by cell surface receptors, PI3K generate the phosphatidylinositol tri-phosphate (PIP3), a lipid messenger involved in many cellular processes such as cell growth, proliferation, migration or cell differentiation. PI3K isoforms have nonredundant roles under physiological, nondisease conditions. In cancer, this redundancy of PI3K isoforms appears more complex and intensely debated. It is thus crucial to delineate and understand which PI3K isoform we have to target for each cancer type. Recently, it was shown that PI3K/Akt tumour dependency is tissue-specific and depends on genetic alterations. KrasG12D -activating mutation is found in more than 90% of PDAC and known as the PDAC-initiative mutation. Pancreatic specific expression of a KrasG12D allele in mice faithfully reproduces human pancreatic cancerogenesis, from preneoplastic lesions to adenocarcinoma. Based on the fact that PI3K isoforms and Kras interacts physically and that Kras is the major mutation in PDAC, the aim of my PhD project aims to determine if the two ubiquitous PI3K isoforms, p110a and p110ß, could have non redundant roles during Kras-driven pancreatic cancer initiation. In order to dissect the putative divergent role of p110a and p110ß in the inititation of Kras-driven pancreatic cancerogenesis, we generated new mice models which combined the expression of mutated-Kras and an inactivation of the p110a or p110ß-kinase domains in the pancreas using a conditional targeting strategy, mimicking pharmacological blockade of p110a or p110ß activity. During my PhD, I demonstrated that PI3K p110a isoform is required for Kras-driven pancreatic cancerogenesis. Inactivation of one copy of the pik3ca gene is sufficient to prevent mouse lethality and complete inactivation of p110a catalytic activity completely blocked the occurrence of all types of preneoplastic lesions induced by mutated Kras. Inactivation of this single isoform abrogates the transition of exocrine acinar cells into pancreatic preneoplastic ductal lesions induced by oncogenic Kras and/or pancreatic injury. p110a signaling through small GTPase Rho and actin cytoskeleton controls the reprogramming of acinar cells and regulates cell morphology in vivo and in vitro. Moreover, p110a kinase activity is required for the maintenance of other oncogenic signaling pathways as EGFR/MAPK, NF-kB or IL6/STAT3 axis. Finally, epithelial p110a was necessary for pancreatic ductal cancers to arise from Kras-induced pancreatic preneoplastic lesions by increasing epithelial and stromal cells proliferation in the context of mutated p53. This is the first genetic demonstration of the physiopathological implication of one PI3K isoform in PDAC in vivo and my data provide a strong rational for the use of selective p110a inhibitors in pancreatic cancer therapeutic strategy.

Les plasmodesmes sont des nanopores membranaires qui traversent la paroi des cellules végétales. Ces nanostructures jouent un rôle central en communication intercellulaire et agissent comme des centres de signalisation capables de générer et de relayer le signal de cellule à cellule via l’activité de récepteurs. En tant qu’éléments clés de la communication intercellulaire, les plasmodesmes coordonnent les processus liés à la croissance et au développement des plantes ainsi que les réponses aux stress environnementaux. Dans cette étude, nous avons identifié trois récepteurs de la famille des récepteurs riches en leucine (LRRRLK), capables de relocaliser de manière dynamique au niveau des plasmodesmes après un stress abiotique. L'association plasmodesmale est rapide et survient en moins de 2 minutes. Cette association dynamique n’est pas un comportement général des protéines associées à la membrane plasmique ou aux microdomaines membranaires. En focalisant notre étude sur SAK1 (Sucrose Activated Kinase) nous avons démontré que l'association dynamique aux plasmodesmes est indépendante de la composition en stérols ou en sphingolipides et est partiellement dépendante du statut de phosphorylation de cette protéine. Nous avons identifié un strech d'acide aminé polybasique dans le domaine Juxtamembrane (JMD) de SAK1, décrit chez l’homme comme interagissant avec les lipides anioniques, qui est indispensable à l'association conditionnelle aux plasmodesmes. Au total, nos données indiquent que les changements dans la membrane signature moléculaire des domaines spécialisés plasmodesmes accompagne les réponses aux stimuli externes. / Plasmodesmata pores sustain intercellular communication in plants. They act as specialized signalling hubs clustering receptor activities, and are capable of generating and relaying signalling from cell-to-cell. As key elements in intercellular communication, plasmodesmata coordinate processes related to plant growth, development and environmental stresses responses. In this study, we identified three PM-located Leucine Rich Repeat Receptor Like Kinases (LRR-RLKs) that are able to dynamically and conditionally relocate to plasmodesmata upon abiotic stress. Plasmodesmal association occurs within 2 minutes and is not a general behaviour of PM or microdomain-associated proteins. Focusing on SAK1 (SUCROSE ACTIVATED KINASE) we demonstrated that the plasmodesmal dynamic association is neither dependent of sterol or sphingolipid composition and nor driven by the protein phosphorylation status. Importantly, we identified a polybasic amino acid motif in the Juxtamembrane Domain (JMD) of SAK1 predicted to bind anionic lipids that is critical for conditional plasmodesmal association. Altogether our data indicate that changes in the membrane molecular signature of plasmodesmata specialized domains accompanies responses to external stimuli.

Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+ jouent un rôle crucial dans l'établissement de la tolérance au soi, le contrôle des réponses inflammatoires et le maintien de l'homéostasie du système immunitaire. La compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de ces cellules représente un défi important. Chez le rat, la déficience en Themis1, une nouvelle molécule de la signalisation du TCR, associée à un locus de 117kb d'origine BN induit un défaut fonctionnel des Tregs et le développement spontané d'une maladie inflammatoire des intestins. Au sein de ce locus, le rat BN présente deux polymorphismes non-synonymes, un au niveau du gène C3 et un au niveau du gène Vav1 (R63W). Ce dernier est un candidat potentiel du fait du rôle joué par Vav1 dans l'activation des lymphocytes T et de sa régulation par Themis1. Dans ce travail de thèse, j'ai étudié l'effet de la déficience en Themis1 associé au polymorphisme R63W de Vav1 chez la souris de fond génétique C57BL/6 sur les fonctions des lymphocytes T régulateurs. J'ai montré que la déficience en Themis1 associé au polymorphisme R63W induit un défaut fonctionnel des Tregs in vitro et in vivo dans un modèle de colite. Ce défaut est associé à une production accrue de cytokines pro-inflammatoires par ces Tregs. J'ai également mis en évidence que l'association de ces deux mutations induit une sensibilité accrue à la colite induite par le DSS. Au niveau moléculaire, j'ai mis en evidence que ce défaut fonctionnel est associé à une réduction de la signalisation du TCR impliquant les vois Erk et NF-ĸB. De plus, j'ai montré que l'inhibition d'une phosphatase de la signalisation du TCR, SHP-1, permet de restaurer les fonctions suppressives des Tregs Vav1R63W-Themis1-/-. Cette étude souligne l'importance de l'intégrité du hub de la signalisation impliquant Vav1, Themis1 et SHP-1 dans la plasticité des lymphocytes T régulateurs et dans le maintien de leur fonction suppressive. Ainsi ce hub de signalisation représente une cible thérapeutique pour augmenter les fonctions des Tregs dans le cadre des maladies inflammatoires ou réduire leurs fonctions suppressives pour favoriser les réponses immunes anti-tumorales dans le cadre du cancer. / Regulatory T cells (Treg) are of paramount importance for restraining excessive immune responses and their manipulation holds enormous therapeutic potential. Our recent results using a congenic rat model suggested that the integrity of Vav1/Themis1 T-cell receptor signaling hub plays a crucial role in Treg suppressive function. Indeed, Themis1 deficiency in BN, but not in LEW rats, led to the development of inflammatory bowel disease (IBD), linked to a defect in Treg suppressive function. Genetic studies revealed that this phenotype depended on a 117 Kb genomic locus, containing the R63W polymorphism on Vav1 that impacted its expression and functions. To test the importance of the Vav1/Themis1 TCR signaling hub in Treg function, we generated Themis1-T-/- mice expressing conditionally Themis1 in thymocytes, but not in peripheral T cells. In contrast to regular germline Themis1 knockout mice, these mice were not lymphopenic and exhibited normal proportions of CD4+ T cells in the thymus and in peripheral lymphoid organs. Next, Themis1-T-/- mice were crossed with Vav1R63W mice to assess the impact of these combined mutations on Treg suppressive functions. Using in vitro approaches, together with in vivo analyses of IBD, we showed that suppressive activity of Treg was impaired in Themis1-deficient mice harboring the mutated Vav1; this defect is linked to higher production of IL-17 and IFNg. Functional studies showed that Themis1-deficient associated with the mutated Vav1 induced a defect in Erk and P65 phosphorylation after TCR engagement. Interestingly, the inhibition of the SHP-1 phosphatase restore the functional defect of Tregs. Together, these data showed that Themis1, Vav1 and SHP-1 cooperate in the signaling hub to regulate the suppressive function of regulatory T cells. Thus, this signaling hub represents a therapeutic target to enhance the suppressive functions of Tregs in the context of autoimmune and inflammatory diseases or to decrease their functions to favor anti-tumoral immune responses.

Le trafic routier entraine de nombreux effets néfastes, dont la pollution, l'insécurité et la congestion. La plupart de méthodes développées, pour la régulation du trafic urbain au niveau des carrefours, cherche à réduire les temps d’attente et les longueurs des files d'attente. Ces méthodes se fixent principalement comme objectif l’optimisation des cycles de feu sur un horizon fini.Pour la description du trafic, nous adoptons une modélisation par les réseaux de Pétri Hybrides (RdPH), qui représente, simultanément, deux niveaux de représentation complémentaires : l'évolution continue des files d'attente et l'évolution discrète des feux tricolores. Ces deux niveaux sont, respectivement, articulés autour des réseaux de Pétri à vitesses variables et des réseaux de Pétri discrets temporisés.Nous élaborons en plus, une nouvelle stratégie pour résoudre le problème de la régulation du trafic urbain intervenant d'une manière adaptée au niveau des feux de signalisation. Nous cherchons à éviter, en premier lieu,la congestion et la sursaturation des files d'attente, qui ne doivent pas dépasser l'optimum des capacités des voies de l'intersection et, en second lieu, à réduire le temps d'évacuation des véhicules au niveau du carrefour et surtout les temps d'attente des conducteurs.Dans ce sens, un premier algorithme est élaboré pour calculer les longueurs des files d'attente, utilisant une approche qui se base sur la simplification de la modélisation d'un carrefour. Pour optimiser le temps moyen d’attente et le temps total d'évacuation sont, considérés et appliqués, avec succès, une heuristique de contrôle et une stratégie de régulation à feux fixe et à feux variables, suite à la détermination de la durée de feu vert correspondante à la situation de l'intersection en temps réel.Nous envisageons, de généraliser les résultats de nos travaux exploitant le modèle RdPH aux intersections plus complexes pour des situations réelles d'un réseau de carrefour. / Road traffic causes many adverse effects, including pollution, insecurity and congestion. Most of the developedmethods for regulation of urban traffic at crossroads, seeking to reduce wait times and lengths of queues. Thesemethods are mainly set objective optimization fire cycles over a finite horizon.To describe the composition of traffic, we opted for a traffic modeling by hybrid Petri nets, representingsimultaneously two complementary levels of representation: the continuing evolution of queues and discreetchanging traffic lights. These two levels are respectively articulated about Petri nets variable speed and discretetimed Petri nets.We chose, as well, for a new strategy to solve the problem of urban traffic control intervening in an appropriatemanner to the level of the signal lights. We sought to avoid first, congestion and the super saturation of queues,which must not exceed the optimum capacity of the intersection of routes studied and, second, to reduce theevacuation time of vehicles at the crossroads and especially waiting times for drivers.In this sense, a first algorithm is developed to calculate the lengths of queues, using a modeling simplificationapproach to a junction. To optimize the average waiting time and the total evacuation time are considered andapplied successfully by a heuristic control lights and a fixed control strategy and floating lights, following thedetermination of the duration of corresponding green light to the situation in real time intersectionWe plan to generalize the results of our work exploiting RDPH model to complex intersections for real situations of acrossroads network.