La tyrosine kinase cytoplasmique Src est un régulateur essentiel de la croissance et de l’adhésion cellulaires induites par de nombreux stimuli extracellulaires, dont les facteurs de croissance et certains composants de la matrice extracellulaire. La dérégulation de son activité catalytique lui confère des propriétés oncogéniques importantes conduisant à la formation de tumeurs agressives chez l’Homme. La plupart des connaissances actuelles sur sa régulation catalytique repose sur des données structurales de cristallographie qui ont révélé l’importance des interactions intramoléculaires SH2 et SH3-dépendantes dans le contrôle des conformations ouvertes et actives de Src. Les domaines SH3, SH2 et kinase de Src sont associés au domaine SH4 N-terminal d'ancrage à la membrane plasmique via un domaine unique (DU) flexible. Le rôle du DU dans la régulation de Src reste obscur car il est intrinsèquement désordonné et par conséquent, cette région n'a pas été incluse dans les analyses structurales originelles. L'analyse par RMN de l'extrémité N-terminale de Src a révélé une conformation partiellement structurée du DU par le contact de séquences peptidiques spécifiques avec les lipides membranaires et le domaine SH3 (Perez et al, 2013; Maffei et al, 2015). De plus, cette interaction est régulée par phosphorylation des Ser69 et Ser75 localisées à proximité de ce domaine. L’objectif de ma thèse était d’adresser la relevance biologique de ces données structurales en me focalisant sur le rôle d’une partie du DU identifiée comme importante par RMN. J’ai montré que l’inactivation de cette région par des mutations perte de fonction, diminue fortement la signalisation de Src dans les cellules non transformées humaines ainsi que ses propriétés tumorales dans les cellules cancéreuses colorectales métastatiques révélant la pertinence biomédicale du système. Des analyses de protéomique m’ont permis de révéler un mécanisme original par lequel cette région contrôle la capacité de Src à phosphoryler ses substrats. En conclusion, ces données confirment un rôle important du DU sur l'activité et la signalisation de Src et révèlent un rôle critique des domaines désordonnés dans les tumeurs chez l’Homme. L’inhibition de cette région unique par de petites molécules devrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cancer. / The membrane-anchored non-receptor tyrosine kinase Src is involved in numerous signal transduction pathways and hyperactive Src is a potent oncogene and driver of human metastasis. Most of our knowledge on Src kinase regulation relies on structural data, which revealed SH2 and SH3-dependent intramolecular interactions to control active conformations of the protein. The kinase, SH3 and SH2 domains of Src are attached to the membrane-anchored SH4 domain through the flexible unique domain (UD). The role of this UD remains obscure due to its intrinsically disordered properties for which reason it was not included in original structural analyses. Interestingly, membrane-associated intrinsic disordered domains are more prevalent among signaling and cancer-related proteins and they are thought to play critical roles in human disease. NMR analysis of Src N-terminus in the presence of lipids revealed a partially structured conformation of the UD through the contact of a small peptide sequence with membrane lipids and the SH3 domain of the protein (Perez et al, 2013; Maffei et al, 2015). This interaction was regulated by phosphorylation of Ser69 and Ser75 surrounded this central region. The aim of my thesis project was to assess the biological relevance of this structural data. Interestingly, I showed that expression of Src mutants with UD loss of function drastically affected Src activity and signaling in human non-transformed cells as well as Src oncogenic properties in metastatic colorectal cancer cells. This highlights the biomedical relevance of the system. Further proteomic analysis revealed an unsuspected mechanism by which this region controls the Src capacity to phosphorylate specific substrates involved in cancer cell activity. These data support a previously unrecognized important role of the UD on Src activity and signaling and reveals a critical role of intrinsic disordered domains in the regulation of kinase signaling in human disease. Targeting this unique region by small molecules may be of therapeutic value in human cancer.

L’ATP extracellulaire, à travers l’activation du récepteur P2X7, joue un rôle important dans l’immunité inné comme signal de danger responsable de l’assemblage de l’inflammasome, de la migration des cellules immunitaires et de la mort cellulaire. Bien que le rôle de la voie ATP/P2X7 dans l’immunité adaptative reste sous-estimé, il a été rapporté que le récepteur P2X7 participe aux mécanismes de signalisation impliqués dans l’activation des lymphocytes T, leur prolifération et leur différentiation. Notre laboratoire a récemment montré que les lymphocytes T effecteurs (CD4+ ou CD8+) en fin de réponse immunitaire secondaire, exprimant à la membrane la tyrosine phosphatase de membrane B220, sont totalement résistant à l’activation du récepteur P2X7 à cause d’une perte d’adressage de ce récepteur à la membrane. Le but de ce travail de thèse est d’étudier la sensibilité des lymphocytes T, à différents stades d’activation, aux activités cellulaires induites par l’ATP, notamment le clivage de la molécule de homing CD62L ou L-sélectine, l’ouverture du canal ionique, la formation du pore et l’externalisation de la PS. Mes principaux résultats montrent que les activités cellulaires dépendantes du récepteur P2X7 sont dissociées. Les lymphocytes T au stade effecteur/mémoire sont moins sensibles au clivage de la molécule CD62L que les lymphocytes T au stade naïf et récemment activé. Les lymphocytes naïfs T récemment activé en réponse immunitaire primaire sont les plus sensibles à la formation du pore. De plus, les lymphocytes T récemment activés, aussi bien en réponse immunitaire primaire que secondaire, sont les plus sensibles à l’externalisation de la PS. Enfin, dans les lymphocytes T récemment activé, les activités de pore et d’externalisation de PS, mais pas le clivage de CD62L, sont dépendantes du taux de calcium. / Extracellular ATP through the receptor P2X7 (P2X7R) plays a key role in innate immunity as a danger signal that causes the activation of the inflammasome, enhancement of immune cell migration and cell death. Although the role of the ATP/P2X7R pathway in adaptative immunity remains underestimated, it has been reported that P2X7R regulates signaling events involved in T-cell activation, proliferation, and differentiation into effector lineages. Moreover, we have previously shown that effector T lymphocytes (either CD4+ or CD8+) that express the B220 isoform of CD45 at the plasma membrane at the end of the secondary immune response are totally resistant to ATP stimulation due to loss of P2X7R membrane expression. In the present study, we compared the sensitivity of T lymphocytes to cellular activities trigerred by P2X7R according to their stage of activation. Interestingly, our results showed that P2X7-dependent cellular activities are dissociated. T lymphocytes at effector/memory stage are less sensitive to CD62L shedding than naïve or recently activated T lymphocyte during primary immune response. Naive T lymphocytes recently activated during primary immune response are the most sensitive to pore formation. Furthermore, recently activated T lymphocytes at both primary and secondary immune responses are the most sensitive to PS externalization. Finally, pore formation, PS externalization but not CD62L shedding, are dependent on calcium signaling.

La production d’anion superoxyde (O2-) par le complexe NADPH oxydase 2 (NOX2) du polynucléaire neutrophile (explosion oxydative, EO) contribue à l’élimination d’agents pathogènes. Cette fonction de défense est stimulée par divers agents pro-inflammatoires, notamment par des peptides bactériens (fMLP), qui déclenchent une cascade de signalisation impliquant différentes protéines kinases (PKC, AKT, MAP-Kinases) et aboutissant à l’activation de la NOX2 (également nommée gp91phox), le coeur catalytique du complexe. Dans cette thèse, j’ai identifié la protéine kinase mTOR comme un nouvel effecteur majeur de l’EO dans les neutrophiles sains et j’ai comparé son mode d’action transductionnel dans les neutrophiles de patients ayant une cirrhose alcoolique décompensée en vue de comprendre leur grande susceptibilité aux infections bactériennes.Une contribution majeure de mTOR dans la production d’O2- induite par le fMLP a pu être démontrée à l’aide de son antagoniste spécifique, le médicament Rapamycine et par une approche antisense. mTOR agit en amont de la p38-MAPK qui phosphoryle la p47phox, un composant majeur du complexe NADPH oxydase. Dans les neutrophiles de patients cirrhotiques, l’EO est fortement défaillante, associée à un défaut d’activation de la voie p38-MAPK/p47phox(S345). Ce déficit d’EO est aggravé par la Rapamycine. Les neutrophiles de patients cirrhotiques présentent également un déficit d’expression de la gp91phox (NOX2), p22phox, p47phox et mTOR. Un déficit d’expression de la NOX2 a pu être reproduit en traitant les neutrophiles sains par le fMLP ou du plasma des patients. De plus, ce phénomène met en jeu une dégradation protéolytique insoupçonnée de la gp91phox impliquant l’élastase. Enfin, la déficience fonctionnelle des neutrophiles de patients a pu être corrigée dans des neutrophiles isolés et dans du sang total des patients cirrhotiques à l’aide d’un agoniste de récepteurs « Toll-like receptor (TLR) » qui agit en favorisant la transcription du gène de la gp91phox et sa synthèse protéique.En conclusion, mTOR émerge comme un nouvel effecteur transductionnel majeur de l’EO des neutrophiles, favorisant l’activation de la voie p47phox/gp91phox via les MAPK. Cette nouvelle voie de signalisation est fortement impactée au cours de la cirrhose alcoolique, ce qui favorise la susceptibilité des patients aux infections bactériennes. Bien que notre étude soulève ainsi des inquiétudes quant à l’utilisation d’inhibiteurs de mTOR chez les patients immunodéprimés, elle suscite par ailleurs la perspective de pouvoir corriger les déficits fonctionnels des neutrophiles à l’aide d’agents capables de stimuler des TLR intracellulaires. / Superoxide anion (O2-) production by NADPH oxidase 2 (NOX2) complex of polymorphonuclear neutrophil (i.e respiratory burst, RB) contributes to efficient elimination of pathogens. This defense function is stimulated by various pro-inflammatory agents, especially by bacterial peptides (fMLP) which trigger a signaling cascade involving many protein kinases (PKC, AKT, MAP-Kinases) resulting in activation of NOX2, also called gp91phox, the catalytic core of the complex. In this thesis, I identified the protein kinase mTOR as a novel major RB effector of healthy neutrophils and I compared its transductional activity in neutrophils from patients suffering from alcoholic decompensated liver cirrhosis, aiming at understanding their high susceptibility to bacterial infections.A major contribution of mTOR to fMLP-induced neutrophil superoxide production was demonstrated using its specific drug antagonist Rapamycin, and by an antisens strategy. mTOR is activated upstream of p38-MAPK which phosphorylates p47phox, a major component of the NADPH oxidase complex. In neutrophils from cirrhotic patients, the RB is dramatically impaired and this was associated with a deficient activation of the p38-MAPK/p47phox(S345) signaling pathway. This RB deficiency was aggravated by Rapamycin. Neutrophils from cirrhotic patients also exhibited a deficient expression of gp91phox (NOX2), p22phox, p47phox and mTOR. A deficient NOX2 expression can be reproduced by treating healthy neutrophils with fMLP or plasma from cirrhotic patients. Furthermore, this phenomenon involved an unexpected proteolytic degradation of gp91phox mediated by elastase. Finally, this deficient superoxide production by neutrophil from cirrhotic patients can be corrected ex vivo in isolated neutrophils and in patients’ whole blood, using a Toll-like receptor agonist that acts by promoting the transcription and traduction of gp91phox .In conclusion, mTOR emerges as a novel and major signaling effector of neutrophil RB, promoting the activation of p47phox/gp91phox through MAPKs. This novel signaling pathway is strongly impaired during alcoholic liver cirrhosis, which increases patients’ susceptibility to bacterial infections. Although our study raises concerns about the use of mTOR inhibitors in immunocompromised patients, it also provides therapeutic propects for correcting neutrophil functional deficiencies using agents capable of stimulating intracellular TLR .

Le fer est un élément essentiel pour les cellules car il est le cofacteur de nombreuses protéines impliquées dans de multiples processus biologiques comme la photosynthèse et la respiration. Cependant, l'excès de fer peut être délétère pour la cellule, car il peut réagir avec l'oxygène pour former des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les ferritines sont des protéines chloroplastiques codées par le génome nucléaire permettant de stocker le fer en excès sous forme non toxique. Chez les végétaux, la synthèse des ferritines est majoritairement régulée au niveau transcriptionnel en réponse au fer contrairement aux animaux où elle est majoritairement régulée au niveau post-transcriptionnel. Toutefois, une régulation post-transcriptionnelle a été mise en évidence pour le gène de ferritine AtFer1. L'ARNm d'AtFer1 est déstabilisé en réponse à un stress oxydatif généré par un excès de fer. Cette régulation fait intervenir un élément cis nommé DST (DownSTream) localisé dans la région 3' transcrite non traduite de ce transcrit (3'UTR). Chez deux mutants précédemment identifiés comme agissant en trans (dst1 et dst2), cette régulation est affectée. Une caractérisation physiologique de ces mutants a permis de montrer que cette voie de dégradation est un mécanisme essentiel contrôlant la physiologie et la croissance de la plante en réponse à un stress oxydatif. D'autre part, l'expression d'AtFer1 ainsi que d'autres gènes codant des protéines chloroplastiques est régulée par un acteur de la machinerie de dégradation des ARNm, l'exoribonucléase XRN4. Ces ARNm codant des protéines chloroplastiques seraient localisés à la surface des chloroplastes. Cette localisation ferait intervenir des acteurs de la machinerie de dégradation des ARNm. La localisation subcellulaire du transcrit AtFer1 a été estimée par deux approches. L'ARNm d'AtFer1 a été visualisé par une technique d'imagerie, l'hybridation in situ révélé par fluorescence (FISH) (i). L'accumulation d'ARNm codant des protéines chloroplastiques a été évaluée dans deux fractions (chloroplastes isolés et feuilles entière) afin de savoir si certain ARNm se retrouvent enrichis dans la fraction chloroplastique (ii). Les résultats obtenus suggèrent que l'ARNm d'AtFer1 serait localisé autour des chloroplastes, cependant cette localisation ne semble pas être affectée chez le mutant xrn4. Enfin, ce travail a permis de caractériser la régulation et la fonction des ferritines dans les racines d'Arabidopsis. Le fer en excès induit la synthèse de ferritines dans les racines, AtFer1 puis AtFer3 sont les gènes de ferritines les plus exprimés dans cet organe. Les racines de plantes cultivées en excès de fer présentent des spots de fer dans les cellules de l'endoderme et du péricycle, là où l'expression des gènes AtFer1 et AtFer3 est retrouvée. Ces spots sont absents dans un triple mutant fer1-3-4. L'excès de fer diminue la longueur de la racine primaire de manière indépendante des ferritines. Par contre, l'excès de fer modifie la densité et l'élongation des racines latérales, ces deux modifications requièrent la présence des ferritines. Lors d'un excès de fer, les ferritines participent à la mise en place du gradient de H2O2 et de O2.- entre les zones de prolifération et de différentiations. Ce gradient est impliqué dans le contrôle la croissance racinaire. / Iron is essential for cells because it is the cofactor of many proteins involved in many biological processes such as photosynthesis and respiration. However, iron in excess can be deleterious to the cell due to its capacity to react with oxygen to form reactive oxygen species (ROS). Ferritins are plastidial proteins encoded by nuclear genes in order to store iron in a safe form. In plants, ferritin synthesis is mainly regulated at the transcriptional level in response to iron in contrast to animals, where it is mainly regulated at the post-transcriptional level.However, post-transcriptional regulation has been shown for the ferritin gene AtFer1. The AtFer1 mRNA is destabilized in response to oxidative stress generated by an excess of iron. This regulation involves a cis element called DST (DownSTream) located in the 3' untranslated region (3'-UTR) of this transcript. In two mutants previously identified as trans-acting (dst1 and dst2), this regulation is affected. Physiological characterizations of these mutants have shown this pathway is an important mechanism to control physiology and plant growth in response to oxidative stress.On the other hand, AtFer1 expression and expression of other genes encoding chloroplast proteins are regulated by a component of the mRNA decay machinery, the exoribonuclease XRN4. These mRNAs encoding chloroplast proteins would be localized on the surface of chloroplasts. This location would involve component of the mRNA decay machinery. The subcellular localization of AtFer1 mRNA was estimated by two approaches. AtFer1 mRNA was visualized by an imaging technique, fluorescent in situ hybridization revealed by (FISH) (i). Accumulation of mRNA encoding chloroplast proteins was evaluated in two fractions (purified chloroplasts and total leaves) to determine if some mRNAs are found enriched in the chloroplast fraction (ii) . Our results suggest that the AtFer1 mRNA is localized around chloroplasts, however, this location does not seem to be affected in the xrn4 mutant. Finally, this work has shown the regulation and function of ferritins in the roots of Arabidopsis. Iron in excess induces ferritin synthesis in roots, and AtFer1 then AtFer3 are the most expressed ferritin genes in this organ. Roots grown in iron excess present spots of iron in the cellular layers of the endoderm and pericycle, where AtFer1 and AtFer3 ferritin genes are expressed. This staining disappears in a triple fer1-3-4 ferritin mutant. Fe in excess decreases primary root length independently of the ferritins. In contrast, Fe excess mediated alteration of lateral root density and mean length requires ferritins, in particular at the highest Fe concentration tested. During an iron excess, ferritin are involved in the establishment of the H2O2 and O2.- gradient between proliferation and differentiation zones. This gradient is known to control of root growth.

Les cytokines de la famille de l’IL-6 possèdent comme caractéristique commune la capacité à recruter une chaine réceptrice membranaire nommée gp130. Au début de notre étude, cette famille comptait 8 membres : IL-6 et son homologue viral (vIL-6), IL-11, LIF, OSM, CNTF, CT-1 et CLC. Depuis, cette famille s’est enrichie de trois nouveaux membres, NP, IL-27 et IL-31. Ces cytokines sont essentielles au développement (LIF et CT-1) ou sont impliquées dans l’hématopoïèse, les réponses immunitaires et l’inflammation (IL-6, IL-11, IL-27, IL-31 et OSM) alors que d’autres agissent plus particulièrement au niveau du système nerveux, comme NP, CLC et CNTF. Le premier axe de recherche de ma thèse a porté sur l’identification d’un nouveau membre de cette famille,la neuropoïétine (NP), et plus précisément sur la caractérisation de son profil d’expression tissulaire et l’identification de son récepteur, des principales voies de signalisation intracellulaire induites ainsi que ses fonctions biologiques. Le deuxième axe de recherche a consisté à étudier la capacité de CLC à se comporter comme un ligand alternatif du récepteur tripartite au CNTF, impliqué dans le développement neuronal. Pour cela, nous avons mis en évidence la présence de la cytokine CLC et de ses partenaires de sécrétion, dans l’environnement des motoneurones lors du développement embryonnaire chez la souris. Enfin, le dernier axe de recherche s’est focalisé sur le rôle des états de glycosylation de CLC sur la sécrétion des cytokines composites CLC/CLF et CLC/solCNTFRα. / Members of the interleukin 6 (IL-6) cytokine family share a common characteristic, the capacity to signal via thegp130 subunit receptor. This family contains 8 members : IL-6 and its viral counterpart (vIL-6), IL-11, LIF, OSM, CNTF, CT-1 and CLC. This family has been more recently enriched with three new members, neuropoietin (NP), IL-27 and IL-31. These proteins are involved in development (LIF and CT-1), in hematopoiesis, immune responses and inflammation, such as IL-6, IL -11, IL-27, IL-31 and OSMor act in the nervous system (NP, CLC and CNTF). My first research work was focused on the identification of a new member of this family, neuropoietin. More specifically, this study allowed determining its tissue expression profile, its complex receptor and the signaling pathways induced, and its biological functions. A second research project was focused on determining whether CLC may constitute an alternative ligand for the CNTF receptor, involved in the neuronal development. We have evidenced the presence of CLC and its secretory partners, in the environment of motoneurons during embryonic development in mice. Finally, I have evaluated the role of the glycosylationstates of CLC on the secretion of the composite cytokines CLC/CLF and CLC/solCNTFR.

L’adaptateur LNK est un régulateur négatif des voies de signalisation, dont la voie JAK/STAT,essentielle au développement du système hématopoïétique. Son implication dans les hémopathies chroniques, notamment les Néoplasmes Myéloprolifératifs (NMP), a été mise en évidence par l’analyse de souris invalidées pour cet adaptateur et l’identification de mutations de LNK chez les patients atteints de ces pathologies. Toutefois, le mécanisme permettant la régulation de ses partenaires, dont la kinase JAK2, et l’implication fonctionnelle des mutations de LNK dans les NMP, restent à définir. Ainsi, mon projet de thèse a porté sur l’analyse structurale et fonctionnelle des complexes de signalisation LNK/JAK2 et sur le développement d’une stratégie moléculaire pour l’utilisation thérapeutique de LNK dans les NMP. Nos résultats ont montré pour la première fois, la fonction inhibitrice de la région N-terminale incluant le domaine d’homologie à la Pleckstrine deLNK sur JAK2 normale et de manière plus importante, sur la forme mutée JAK2-V617F, retrouvée chez les patients atteints de NMP. De plus, nos études sur les mutations de LNK localisées dans cette région régulatrice, ont permis de comprendre leur contribution dans le développement de ces hémopathies et de proposer un mécanisme d’inhibition de l’activation de JAK2 par LNK. Nos résultats permettent d’utiliser le ciblage de la région N-terminale de LNK comme stratégie moléculaire inhibant spécifiquement la forme oncogénique JAK2-V617F à l’aide de peptides pénétrants (CPP). A long terme, cette approche pourrait être utilisée comme outil thérapeutique dans le traitement de patients atteints de NMP positifs pour JAK2-V617F. / The LNK adaptor protein is a key negative regulator of signalling pathways, such as JAK/STAT, important in the development of the hematopoietic system. Its implication in chronic blood diseases, such as Myeloproliferative Neoplasms (MPN) has been confirmed by studies on Lnk-deficient mice, as well as the identification of LNK mutations in MPN patients. However, the LNK mechanism of regulation on its partners and the functional implication of LNK mutations in MPN pathogenesis, are still unclear. Therefore, my PhD project covers the structural and functional analysis of theLNK/JAK2 signalling complex and the development of a molecular strategy to use LNK as a therapeutic tool for the treatment of MPN patients. Our study showed, for the first time, the inhibitory function of the N-terminal region and the pleckstrin homology domain of LNK on JAK2 activity, which occurs more importantly on JAK-V617F than JAK2 wild type form. Moreover, our study provided evidence on how LNK mutations located in this LNK region could contribute to these haematological diseases and has allowed us to propose a model for LNK regulatory function on JAK2activity. Furthermore, we developed a cell penetrating peptide-based strategy to deliver this regulatory region of LNK in hematopoietic cells to specifically inhibit JAK2-V617F oncogenic form. The finalaim is to use this region as a therapeutic molecule to treat JAK2-V617F-positive MPN patients.

Les récepteurs 5-HT2A de la sérotonine et mGlu2 du glutamate suscitent un grand intérêt vu la dérégulation des deux récepteurs observée dans la schizophrénie et leur statut de cibles des antipsychotiques dits atypiques et de nouvelle génération, respectivement. Même si les antipsychotiques atypiques ciblant le récepteur 5-HT2A ont montré une efficacité contre les symptômes positifs, leur effet reste très limité contre les symptômes négatifs et cognitifs, et leurs effets secondaires nombreux. Depuis les années 1990, une nouvelle classe d’antipsychotiques ciblant le système glutamatergique, en particulier le récepteur mGlu2, est en développement. Les tests cliniques n’ont montré leur efficacité que pour les patients n’ayant pas été traités auparavant par des antipsychotiques atypiques. Ceci suggère une interaction fonctionnelle forte entre les récepteurs 5-HT2A et mGlu2 dans le mode d’action de ces deux classes d’antipsychotiques. De plus, plusieurs études ont démontré l’existence d’un hétéromère des deux récepteurs dans le cortex préfrontal qui semble important pour la réponse aux hallucinogènes et aux antipsychotiques ciblant l’un ou l’autre récepteur. Ainsi, étant donné l’impact du profil de phosphorylation adopté par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sur leur fonction, j’ai caractérisé au cours de ma thèse l’impact de la co-expression du récepteur 5-HT2A sur le profil de phosphorylation du récepteur mGlu2 en réponse à différentes stimulations. Parmi les 5 sites de phosphorylation identifiés, la phosphorylation de la Ser843 est potentialisée en réponse à la stimulation par un agoniste du récepteur mGlu2 uniquement lorsque le récepteur 5-HT2A est co-exprimé. Ces résultats ont été validés grâce à la génération d’un nouvel anticorps dirigé spécifiquement contre la forme phosphorylée de la Ser843 sur culture cellulaire HEK-293 et in vivo dans le cortex préfrontal de souris, région où les deux récepteurs sont co-exprimés. Des études fonctionnelles ont démontré que la phosphorylation de la Ser843 est nécessaire à la potentialisation de l’activité Gi/o du récepteur mGlu2 en réponse à ses agonistes et constitue un cross-talk fonctionnel entre les deux récepteurs puisque les agonistes du récepteur 5-HT2A stimulent également la phosphorylation de la Ser843 du récepteur mGlu2. Ainsi, mes résultats de thèse ont permis d’identifier la phosphorylation du récepteur mGlu2 sur la Ser843 comme un événement moléculaire clé du cross-talk fonctionnel avec le récepteur 5-HT2A et apporte un élément important dans la compréhension du mode d’action des antipsychotiques atypiques et de nouvelle génération. / The serotonin 5-HT2A and glutamate mGlu2 receptors keep on attracting particular attention given their implication in psychosis associated with schizophrenia and in the mechanism of action of atypical antipsychotics and of a new class of antipsychotics, respectively. Though atypical antipsychotics, targeting 5-HT2A receptor, are efficient against positive symptoms, these drugs do not act against negative, cognitive symptoms and display many side effects. Since the 90’s, new classes of antipsychotics triggering glutamatergic system, in particular mGlu2 receptor, have been developed. Their clinical trials have shown efficacy only in patients who have not been previously treated with atypical antipsychotics. This suggests a strong interaction between 5-HT2A and mGlu2 receptors in the mechanism of action of both classes of antipsychotics. Moreover, a large body of evidence indicates the presence, in prefontal cortex, of 5-HT2A/mGlu2 heteromer that is important for the response to hallucinogens and antipsychotics targeting one receptor or the other. Thus, in view of the importance of the phosphorylation profile adopted by G-protein coupled receptor (GPCR) on their activity, I characterized the impact of 5-HT2A receptor co-expression on the phosphorylation profile of mGlu2 receptor in response to various stimulations. Among the five identified phosphorylated residues, the phosphorylation of Ser843 increases upon mGlu2 receptor stimulation only when the 5-HT2A receptor is co-expressed. A new antibody against the phosphorylated form of Ser843 confirmed these results in HEK-293 cells and in mouse prefrontal cortex, area where both receptors are co-expressed. Functional studies demonstrated that Ser843 phosphorylation is necessary to enhance Gi/o signaling of mGlu2 receptor and constitutes a functional crosstalk between 5-HT2A and mGlu2 receptor since 5-HT2A receptor agonists also stimulate Ser843 phosphorylation. Collectively, my thesis findings identify mGlu2 receptor phosphorylation at Ser843 as a key molecular event of the functional crosstalk with 5-HT2A receptor that might be critical to understand the mechanism of action of atypical and potential future antipsychotics treatments.

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme. Sa croissance et sa progression sont dépendantes de signaux hormonaux, tels que les œstrogènes, et de l’interaction des cellules cancéreuses avec le microenvironnement matriciel. La perte d’expression du récepteur aux estrogènes ERα est un marqueur de mauvais pronostic et de non réponse à l’hormonothérapie. Dans ces tumeurs agressives, l’expression du SDC-1, un protéoglycane transmembranaire impliqué dans l’angiogenèse, la prolifération et l’invasion, est augmentée suggérant un antagonisme entre la signalisation œstrogénique et le SDC-1 dans ces tumeurs. En utilisant les cellules de carcinome mammaire ER(+) MCF7, nous avons montré que les œstrogènes via le récepteur ERα sont capables d’inhiber l’expression du SDC 1 par un mécanisme nécessitant une néosynthèse protéique et la phosphorylation d’ERα par la kinase IKK. Parallèlement, nos résultats montrent que la dérégulation de l’expression du SDC-1 affecte la réponse proliférative des œstrogènes dans les cellules MCF7 en modifiant la localisation subcellulaire d’ERα. Nos résultats montrent à la fois l’inhibition tonique et E2-induite de l’expression du SDC-1 par ERα dans les cellules MCF7 et la potentialité du SDC-1 à réduire la réponse œstrogénique de ces cellules. Ainsi, ces résultats sont autant d’arguments qui renforcent l'hypothèse d'un antagonisme entre la signalisation médiée par ERα et le SDC-1 lequel influencerait l'orientation phénotypique des cellules de carcinome mammaire. / Breast cancer is the most common cancer in women. Its growth and progression depend on hormone signals, such as estrogens, and on interactions with the matrix microenvironment. The loss of the estrogen receptor ERα expression is a poor prognosis marker and predicts a resistance to antihormonal therapies. In these aggressive tumors, SDC-1 expression, a transmembrane proteoglycan involved in angiogenesis, proliferation and invasiveness is increased suggesting an antagonism between estrogenic signaling and SDC-1 in breast tumors. Using ER (+) MCF7 mammary carcinoma cells, we have shown that estrogens via the ERα are able to inhibit the expression of SDC-1 by a mechanism requiring protein synthesis and phosphorylation of ERα by the IKK kinase. Additionally, our results show that dysregulation of SDC-1 expression affects the proliferative response to estrogens in MCF7 cells by altering the subcellular localization of ERα. Our results show both a tonic and E2-induced inhibition of SDC-1 expression by ERα in MCF7 cells and the potentiality of SDC-1 to reduce the estrogenic response of these cells. Thus, these results support the hypothesis that an antagonism between ERα signaling and SDC-1 which could influence the phenotypic orientation of mammary carcinoma cells.

Le vieillissement de la population augmentera l’incidence des troubles osseux, notamment les fractures ostéoporotiques, menant ainsi à des pertes osseuses de taille critique. La méthode privilégiée afin de combler ces pertes, l’autogreffe, comporte cependant des limitations. L’une des alternatives étudiées est l’utilisation de matériaux biomimétiques. Afin d’optimiser la régénération osseuse, les biomatériaux doivent interagir avec le tissu environnant. Ainsi, ces matériaux peuvent être fonctionnalisés avec des peptides d’adhésion, le peptide Arg-Gly-Asp (RGD) étant l’une des séquences les plus fréquemment utilisées. De plus, afin de favoriser la différenciation des cellules en ostéoblastes, l’utilisation de facteurs de croissance tels que les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) s’avère efficace, la BMP-2 et la BMP-7 étant approuvées par la Food and Drug Administration pour des applications commerciales de régénération osseuse. La BMP-9 a montré avoir un potentiel ostéogénique supérieur à ces dernières. Par contre, peu d’études portent sur l’influence des peptides d’adhésion sur la réponse des cellules aux BMPs. Ce projet de maîtrise a donc pour principal objectif d’étudier l’impact d’un film de polycaprolactone (PCL) fonctionnalisé par des peptides d’adhésion dérivés de la sialoprotéine osseuse (PCL-pBSP) ou de la fibronectine (PCL-pFibro) sur la réponse de cellules souches mésenchymateuses (MSCs) C3H10T1/2 à la BMP-9 et à ses peptides dérivés (pBMP-9 et SpBMP-9). En effet, les BMPs étant coûteux à produire et purifier, des peptides dérivés moins dispendieux ont été développés. Le premier volet de ce mémoire consiste en une revue de la littérature qui vient d’être acceptée dans le journal Frontiers in Bioscience. Le tissu osseux, le processus de réparation osseuse et les types d’interactions entre les cellules osseuses et les biomatériaux y sont décrits. Elle présente aussi le processus de différenciation ostéogénique des MSCs afin d’identifier les molécules pouvant être utilisées dans le développement de matériaux biomimétiques en plus de décrire les plus récents matériaux biomimétiques fonctionnalisés par des peptides d’adhésion utilisés conjointement avec des facteurs de croissance. Le deuxième volet décrit les résultats expérimentaux obtenus qui font l’objet d’un article soumis dans le journal Acta Biomaterialia. Il a été démontré que le PCL-pFibro par rapport au PCL-pBSP permettait une meilleure organisation du cytosquelette des C3H10T1/2 et une activation plus rapide de la focal adhesion kinase, protéine impliquée dans l’adhésion cellulaire. De plus, les 2 films de PCL fonctionnalisés ont montré un effet contraire au niveau de la signalisation JNK; le PCL-pFibro l’activait tandis que le PCL-pBSP l’inhibait. Or JNK est indispensable à la différenciation ostéogénique des C3H10T1/2 induite par la BMP-9. Suite à une stimulation des MSCs par la BMP-9 ou ses peptides dérivés, les C3H10T1/2 adhérant sur le PCL-pFibro ont montré une activation et une translocation nucléaire des Smad1/5/8 plus importantes que sur PCL-pBSP. À plus long terme, l’expression de Runx2, marqueur de la différenciation ostéogénique des MSCs, était plus importante sur PCL-pFibro que sur PCL-pBSP. En conclusion, ces travaux ont permis de démontrer le potentiel du PCL-pFibro comme matériau biomimétique capable d’induire une signalisation intracellulaire favorable à l’action de la BMP-9 et de ses peptides dérivés dans un processus de différenciation ostéogénique des MSCs. Ce matériau pourrait donc être prometteur dans une stratégie de réparation des pertes osseuses en combinaison avec le pBMP-9 ou SpBMP-9.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.