Catharanthus roseus synthétise et accumule de nombreux alcaloïdes indolique monoterpénique (AIMs) dont certains sont utilisés dans des traitements par chimiothérapie. De nombreux travaux sont entrepris au sein de l'EA 2106 "Biomolécules et biotechnologies végétales", afin d'étudier notamment les mécanismes de régulation de la biosynthèse des AIMs d'intérêt. Dans ce cadre, le modèle utilisé est la souche cellulaire C2OD qui nécessite pour sa croissance la présence d'acide 2,4-dichlorophénoxy acétique (2,4-D) qui constitue un signal inhibiteur fort de la biosynthèse des AIMs. Le but de ce travail de thèse a été de caractériser les mécanismes de perception et de transduction du signal induit par le 2,4-D dans les cellules de C. Roseus. Tout d'abord, nous avons montré que le signal 2,4-D est lié à sa nature hormonale. Par ailleurs nous avons étudié le rôle du calcium comme messager secondaire potentiel dans la transduction du signal 2,4-D. Nous avons pu montrer une implication antagoniste des canaux calciques IP3R et RyR dans la régulation de la biosynthèse des AIMs à un niveau transcriptionnel. Enfin, nous avons engagé une étude de la transduction du signal 2,4-D par imagerie SIMS. Nous avons réalisé des images analytiques de la distribution de molécules marquées, comme un activateur du canal RyR marqué par du C et du N et d'un analogue structural et fonctionnel du 2,4-D marqué par deux atomes de brome. Ce travail de thèse a permis une réelle avancée dans la connaissance des mécanismes de régulation du métabolisme des AIMs induit par le 2,4-D qui semble constituer un modèle d'étude original d'un nouveau degré de complexité de la signature calcique cellulaire. / Catharanthus roseus synthesizes and accumulates numerous monoterpenoid indole alkaloids (MIAs) like vinblastine and vincristine, both used in chimiotherapeutic treatment. Numerous works, engaged in "Biomolecules et biotechnologies végétales" research team, study regulation of the biosynthesis of these valuables compounds. For this purpose, the model used is the C2OD strain cell that is dependant of the presence of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), a negative regulator of the MIAs biosynthesis. The aim of this PhD work was to characterize the perception and transduction mechanisms of the regulatory signal leading by 2,4-D. First, we show that the 2,4-D signal is linked to its hormonal nature. Moreover, we studied the role of calcium as a potential secondary messenger in the 2,4-D signal transduction. We show an antagonistic implication of the RyR and IP3R calcium channels in the regulation of the MIAs biosynthesis. Finally, we started a study of the transduction of the 2,4-D by SIMS imagery. We realized analytical images of the distribution of labeled compounds like a RyR activator labeled with C and N and a structural and functional 2,4-D analogue labeled with two bromide. This PhD work allowed significant progresses in the comprehension of the MIAs biosynthesis regulation by 2,4-D that could constitute an original model for studying new level of complexity of the cellular calcium signature.

Notre laboratoire a montré précédemment que le facteur NGF est produit par les cellules de cancer du sein et non par les cellules épithéliales mammaires normales. De plus, le NGF est un puissant facteur mitogène et anti-apoptotique pour les cellules de cancer du sein. Dans le cadre de ce travail, nous avons voulu déterminer l’implication du NGF dans l’angiogenèse tumorale ainsi que les mécanismes mis en jeu. Nous avons montré que le NGF est un puissant facteur angiogénique ayant un rôle essentiel dans la vascularisation tumorale dans des modèles expérimentaux chez la souris SCID. De plus, le NGF exerce des effets pléiotropiques sur les cellules endothéliales in vitro avec une intensité similaire au VEGF, le facteur angiogénique prototypique. Par ailleurs, l’effet stimulateur du NGF sur l’invasion des cellules endothéliales dépend de l’activation de son récepteur à activité tyrosine kinase TrkA et des voies de signalisation en aval telles que les voies PI3K/Akt et NO synthase. Enfin, nous avons montré que l’effet angiogénique du NGF est dévolu en partie à une activité du VEGF, puisque la neutralisation du VEGF à l’aide d’un anticorps conduit à une diminution de l’angiogenèse induite par le NGF. Ceci peut s’expliquer par le faite que le NGF augmente la sécrétion du VEGF par les cellules endothéliales et les cellules de cancer du sein. De façon intéressante, nous avons montré que la neurotrophine NT-4/5 exerce également un effet angiogénique in vitro. / Our laboratory has previously shown that the neurotrophic factor NGF (Nerve Growth Factor) is specifically produced by breast cancer cells and not by normal mammary epithelial cells. Furthermore, NGF is a powerful mitogenic and anti-apoptotic factor for breast cancer cells. To investigate the implication of NGF in breast cancer development, we wanted to determine its possible role in tumor angiogenesis and the underlying mechanisms. First, we showed that NGF is a powerful angiogenic factor playing an essential role in tumor vascularization in experimental models performed using SCID mice. Furthermore, NGF exerts pleiotropic effects on endothelial cells in vitro with intensity similar to VEGF. Moreover, NGF-stimulated invasion of endothelial cells depends on the activation of its receptor tyrosine kinase receptor TrkA and the downstream signaling pathways such as PI3K / Akt and NO synthase. Interestingly, we showed that angiogenic effect of NGF is partially due to VEGF, as NGF can increase secretion of VEGF by both endothelial cells and breast cancer cells; furthermore, neutralizing antibody against VEGF strongly reduces NGF-induced angiogenesis. In addition, we showed that neurotrophin factor NT-4/5 also exerts an angiogenic effect in vitro.

Les plantes détectent les pathogènes dans leur environnement et s’y adaptent pour survivre. Le groupe Stress Signalling de l’IPS2 cherche à décrire les mécanismes cellulaires mis alors en jeu et à proposer des stratégies permettant de développer des cultures plus résistantes aux stress. Les modules Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) semblent être des acteurs clés de la transduction du signal: ils sont en effet très rapidement activés par de nombreux stress et notamment par les Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Des approches de génétique, utilisant des mutants perte-de-fonction, ont montré que ces modules MAPKs régulaient de nombreux aspects de l’adaptation des plantes à leur environnement.Dans notre laboratoire, nous avons précédemment identifié des mutations capables de rendre les MAPKs de la plante modèle Arabidopsis thaliana constitutivement actives (CA). L’objectif de mon projet était de clarifier les rôles spécifiques des MAPKs activées par le PAMP flg22 à l’aide de ce nouvel outil. Pour cela, j’ai créé des plantes exprimant des CA MAPKs et j’ai caractérisé leur phénotype en conditions normales de croissance ou lors d’interactions avec des pathogènes. Je me suis particulièrement intéressé à la MAPK MPK3. J’ai montré que des plantes exprimant une version CA de MPK3 avaient un phénotype d’auto-immunité caractérisé par un nanisme associé à la mort cellulaire spontanée et à une accumulation de formes activées de l’oxygène. Des études métabolomiques, transcriptomiques et de génétique ont permis de préciser les réponses régulées par cette MAPK. J’ai en particulier montré que le phénotype des plantes CA-MPK3 était dépendant de la protéine EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1), un régulateur primordial des réponses aux pathogènes, et partiellement dépendant de l’acide salicylique. J’ai également créé et caractérisé des plantes exprimant des formes CA de MPK6 et MPK11.En conclusion, mon travail tirant partie des mutations CA a permis de proposer de nouveaux rôles spécifiques pour certaines MAPKs activées par le stress. Mes résultats préliminaires suggèrent également que les plantes exprimant des CA MAPK peuvent présenter une meilleure résistance aux pathogènes. / Plants can detect pathogens in their environment and adapt to survive it. The Stress Signalling group in IPS2 aims to decipher cellular mechanisms occurring after pathogens detection and to propose strategies to develop stress-resistant crops. Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) modules define key actors of signal transduction. MAPKs are indeed quickly activated in response to various stresses including pathogens-associated molecular patterns (PAMPs). Genetic approaches using loss-of-function mutants showed that MAPK modules regulate many aspects of plant adaptation to their environment.In our laboratory, we previously identified mutations which render MAPKs constitutively active (CA) in the plant model Arabidopsis thaliana.The main objective of my thesis was to clarify the specific roles of MAPKs activated by the PAMP flg22 using this new tool. For this, I created plants expressing CA MAPKs and characterized them in normal growth conditions or after pathogen infections. I mainly focused my project on the MAPK MPK3. I showed that plants expressing a CA version of MPK3 had an auto-immune phenotype characterized by a severe dwarfism, spontaneous cell death and accumulation of reactive oxygen species. Transcriptomic, metabolomic and genetic studies were performed to understand which pathways are regulated by this MAPK. This work demonstrates that MPK3 is a positive regulator of plant immunity, whose function depends on EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1), a key regulator of pathogens responses, and partially depends on the phytohormone salicylic acid. I also created and characterized plants expressing constitutively active MPK6 and MPK11. In conclusion, CA mutations allowed us to reveal new specific roles for several stress-activated MAPKs. My preliminary results also suggest that plants expressing CA MAPK may have a better resistance to pathogens.

Le métabolisme des phosphoinositides constitue un processus crucial parmi les systèmes permettant la terminaison de la transmission intracellulaire d’un stimulus extracellulaire. En effet, l’une de principales voies de signalisation intracellulaire engendrée en réponse à la liaison d’hormones ou de facteurs de croissance sur leurs récepteurs spécifiques fait intervenir la phosphorylation du PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 par une PI 3-kinase. Les enzymes responsables du métabolisme de ce second messager sont donc essentielles à la fonction normale de la cellule. L’ADNc de la 5-phosphatase SHIP2 a été cloné dans notre laboratoire. Cette enzyme présente au sein de sa structure primaire, en plus d’un domaine catalytique 5-phosphatase, un grand nombre de motifs permettant des interactions spécifiques avec d’autres protéines : un domaine SH2 N-terminal, des séquences riches en prolines, un motif NPXY et un domaine SAM. SHIP2 joue un rôle de régulateur négatif dans la voie PKB et MAPK in vitro dans plusieurs modèles cellulaires. De plus, l’affinité de SHIP2 pour le cytosquelette a été mise en évidence notamment dans les plaquettes sanguines. Notre travail de thèse s’intègre dans le cadre de l’étude biochimique de SHIP2 et plus particulièrement dans la recherche de ses partenaires protéiques. La Vinexine, protéine du cytosquelette impliquée dans l’adhérence cellulaire, avait été identifiée comme une protéine interagissant avec SHIP2 par la technique du double hybride. Nous avons confirmé cette association par des expériences d’immunoprécipitation en système transfecté (cellules COS-7) ainsi qu’en système natif (cellules HeLa et MEF). Nous avons montré que cette interaction n’était ni modulée par une stimulation à l’EGF (dans des cellules COS-7) ni par le sérum (dans des cellules MEF). Nous avons démontré une colocalisation de SHIP2 avec la Vinexine  à la périphérie des cellules COS-7 stimulées à l’EGF. Par la suite, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de cette interaction dans l’adhérence cellulaire. Nous avons montré que la surexpression de SHIP2 ou de la Vinexine  augmente l’adhérence des cellules COS-7 sur un substrat de collagène I. L’adhérence à ce même substrat est diminuée dans les cellules MEF issues des souris déficientes en SHIP2 comparées à des cellules contrôles SHIP2 +/+. De plus, il apparaît que la partie carboxy-terminale de SHIP2 ainsi que son activité catalytique sont importantes pour l’adhérence des cellules au substrat. Ces résultats suggèrent un rôle important de SHIP2 dans l’adhérence cellulaire et l’organisation du cytosquelette d’actine faisant intervenir un mécanisme probable de déphosphorylation du PtdInsP3.

La signalisation calcique est un mécanisme physiologique essentiel pour l’homéostasie cellulaire, et en particulier pour les cellules immunitaires telles que les lymphocytes B (LB). Chez l’homme, la caractérisation des molécules impliquées dans la signalisation calcique des LB est encore restreinte. Nous avons donc choisi d’étudier les molécules STIM1, STIM2, Orai1 et TRPC1 afin de rendre compte des modifications de la signalisation calcique observées dans deux modèles physiopathologiques : le Lupus Erythémateux Systémique (LES) et la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Pour les LB de LES, par rapport à des LB de témoins, ce travail a permis de montrer que la surexpression de la molécule STIM1 dans les LB de LES, surtout au stade des LB transitionnels, était associée avec un influx constitutif et extracellulaire de calcium et que cet influx était responsable d’une phosphorylation modérée de la MAPK Erk1/2 dans les cellules au repos. Cependant, cet effet positif est contrebalancé par un défaut de l’influx SOCE (strore operated calcium entry) et d’un défaut d’activation de la phosphorylation de la MAPK Erk après stimulation du récepteur à l’antigène des LB (BCR). Les effets positifs et négatifs observés sur la phosphorylation d.Erk1/2 sont directement attribuables au niveau d’expression de STIM1 comme nous l’avons démontré en sur-exprimant STIM1 dans des LB de témoins (vecteur pSTIM1-STIM1) ou en ayant recours à un siRNA spécifique de STIM1 dans les LB de LES. Le défaut d’activité régulatrice des LB de LES sur la prolifération des LT dans un modèle de co-culture autologue LT/LB en présence de CpG (activation du TLR9 des LB), et d’anticorps anti-CD3/CD28 (activation des LT) est levé en inhibant l’expression de STIM1 dans ces cellules ce qui permet de restaurer la production d.IL-10 par les LB de LES et la génération de LT régulateurs. Le défaut d’activation de la voie Erk/DNMT1/méthylation de l’ADN dans les LB de LES semble également contrôlée par le niveau d’expression de la molécule STIM1.Pour les LB CD5+ de LLC, l’analyse des partenaires calciques nous a permis de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe qui exprime le complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 et un second groupe qui n’exprime qu’Orai1. La présence du complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 est associée avec un influx constitutif de calcium, la phosphorylation d’Erk1/2, et un défaut d’activation du signal SOCE après stimulation du BCR. Le rôle de la molécule CD5 sur l’influx constitutif des LLC du groupe I a été démontré en utilisant des siRNA spécifiques pourCD5 et en analysant la lignée B humaine Jok-1 transfectée avec CD5. Enfin, l’utilisation d’un anticorps anti-STIM1 est capable d’induire l’apoptose in vitro des LB de LLC du groupe I, alors que l’anticorps anti-CD20, rituximab, n’est efficace que sur les LLC du groupe II.En conclusion, cette étude ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques en auto-immunité dans le LES et en cancérologie dans la LLC. / Calcium signaling is a central mechanism for cellular homeostasis, including for immune cells such as B lymphocytes (B cells). In human, the characterization of the molecules involved in B cell calcium signalisation is still limited and we have focused our study on STIM1, STIM2, Orai1 and TRPC1. In order to better understanding the role of these molecules, two pathologies, with known calcium dysregulations, were chosen : Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).For SLE B cells, compared to healthy control (HC) B cells, this work has established that overexpression of the STIM1 molecule characterizes SLE B cells, especially at the transitional B cell stage. STIM1 overexpression in SLE B cells was associated with a constitutive extracellular calcium influx that in turn contributes to the moderate phosphorylation of the MAPK Erk1/2. However, this positive effect is counterbalanced by a defective strore operated calcium entry (SOCE), and a defective Erk phosphorylation after B cell receptor (BCR) activation. The positive and negative effects on the MAPK Erk1/2 in SLE B cells are directly linked to level of STIM1 as demonstrated in HC B cells transfected with a STIM1 vector (pSTIM1-STIM1), or by using a specific siRNA to STIM1 (siSTIM1) in SLE B cells.The incapacity of SLE B cells to regulate T cell proliferation in an autologous co-culture T/B cell model is reversed by using siSTIM1 in SLE B cells. In this model, using siSTIM1 in SLE B cells also restores the production of IL-10 by B cells, and the generation of regulatory T cells. The defective Erk/DNMT1/DNA methylation pathway in SLE B cells is suspected to be under the control of STIM1 overexpression.For CD5+ CLL B cells, analysis of calcium partners has enabled us to distinguish two groups of patients: one group that expresses at the plasma membrane the complex STIM1/TRPC1/Orai1 and a second group that expresses onlyOrai1. The presence of the membrane complex STIM1/TRPC1/Orai1 in CLL group I is associated with a constitutive extracellular calcium influx, the basal phosphorylation of Erk1/2, and a defaut to mobilize SOCE upon BCR engagement. In the CLL group I patients, a role of CD5 on the constitutive extracellular calcium influx was shown using siRNA specific to CD5 and using the transfected CD5 expressing B cell line Jok-1. Finally, the in vitro use of an anti-STIM1 antibody is able to induce apoptosis in CLL B cells from group I patients, while the anti-CD20 antibody (rituxan) was only effective in the CLL B cells from group II patients.In conclusion, this study opens new diagnostic and therapeutic perspectives in autoimmunity and in cancer.

Le développement des organismes multicellulaires, la morphologie de leurs organes, la formation de connections nerveuses ou même la réponse immunitaire conduisent à la formation de cellules dont la mort a été programmée, ces cellules sont en apoptose. Les corps apoptotiques générés sont éliminés par phagocytose, que l'on peut ainsi considérer comme l'étape ultime du programme apoptotique. Cette élimination, assurée soit par des phagocytes professionnels ou des cellules environnantes est très efficace et peu de cellules en apoptose sont observées dans les différents tissus et organes. Deux familles de protéines, ELMO et DOCK, sont connues pour être au centre d'une voie de signalisation impliquée dans l'activation de la petite GTPase Rac et le remodelage du cytosquelette d'actine permettant l'internalisation de corps apoptotiques, mais la manière dont ELMO est activée par la reconnaissance des corps apoptotique reste largement méconnue. Récemment, ELMO a été identifiée comme cible de la kinase hématopoïétique Hck. La phosphorylation d'ELMO constitue un signal d'activation de la voie de phagocytose. Nous avons pu montrer que les domaines N et C-terminaux d'ELMO sont impliqués dans l'interaction avec le domaine SH3 de Hck. Contrairement au SH3 de DOCK, l'interaction du domaine C-terminal avec le SH3 de Hck est strictement dépendante de la présence du polyproline. Les données obtenues sur les cellules transfectées suggère l'interaction in cellulo du motif polyproline avec le domaine SH3 de Hck. La différence dans le comportement du domaine C-terminal d'ELMO avec les deux SH3 nous a mené à identifier un complexe ternaire entre les trois protéines. Le motif polyproline d'ELMO est adjacent à l'une des 5 tyrosines phosphorylées par Hck, la tyrosine 720, nos résultats montrent que la phosphorylation de cette tyrosine défavorise l'interaction entre le domaine C-terminal et le SH3 de Hck. Cette phosphorylation pourrait être à l'origine d'un effet régulateur de Hck sur le complexe ELMO/DOCK. / Multicellular organisms development, tissue organization and morphogenesis, nerve connection network or even immune response lead to programmed cell death or apoptosis. Phagocytosis is the mean for the engulfment of the apoptotic corpses and can thus be considered as the final step of the apoptotic pathway. Both non-professional and professional phagocytic cells are implicated to achieve an efficient clearance of the apoptotic cells and debris, and very little dead cells are actually present in tissues under normal circumstances, preventing secondary necrosis and further inflammation. Two family of proteins, ELMO and DOCK have been identified as major characters in the signaling pathway leading to the activation of the small GTPase Rac, and actin remodeling, that eventually leads to engulfment. Nevertheless, very little is yet known about the upstream events leading to ELMO activation. Recently, ELMO has been characterized as a target for the hematopoietic cell kinase Hck, and consequent phosphorylation participates in ELMO activation. In the course of the present work, we demonstrated that both N- and C-terminal domains of ELMO are binding the SH3 domain of Hck. In contrast with the SH3 domain of DOCK, the SH3 domain of Hck binding to the C-terminal of ELMO is strictly dependent upon the polyproline motif. Our data obtained using transfected cells, further suggest the polyproline dependent interaction also occurs in cells. Taking into account the differential behavior of both SH3 domains from DOCK and Hck we next demonstrated a ternary complex formation between ELMO and both partners in vitro. Finally, we investigated the possible role for the Hck phosphorylation of Y720 located at the edge of the polyproline motif of ELMO and demonstrated that this phosphorylation clearly increases the Kd of ELMO/Hck interaction suggesting this phosphorylation could be part of a regulation loop in Hck dependent ELMO activation.

La première implication des récepteurs aux interférons de type 1 (IFNAR1) dans le contrôle de la voie Jak/STAT induite par les IFNs a été établie par mon laboratoire il y a une dizaine d'années (Marchetti et al., 2006). Une des questions fondamentales était alors de déterminer comment et pourquoi l'endocytose des IFNARs pouvait contrôler la voie Jak/STAT. Deux acteurs clés du tri endosomal ont attiré notre attention : Hrs (Hepatocyte growth factor-Regulated tyrosine kinase Substrate) et STAM (Signal Transducing Adaptor Molecule). Ces deux protéines constituent le complexe ESCRT-0 (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport-0) les localisant, de manière idéale, à l'interface entre signalisation cellulaire et trafic membranaire.La combinaison de la biologie moléculaire et cellulaire, de la biochimie et de la microscopie à fluorescence, nous a permis d'établir que STAM s'associe au complexe IFNAR1 à la membrane plasmique afin d'y exercer son effet inhibiteur sur la signalisation Jak/STAT. Cette inhibition est levée lorsqu'IFNAR est libéré dans l'endosome et qu'il peut ainsi être recruté par Hrs sous la dépendance de l'IFN-α. En nous basant sur des expériences de déplétion par shRNA ou d'inhibition pharmacologique, nous avons identifié PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B) en tant qu'activateur de la voie Jak/STAT induite par les IFNs. Le blocage sélectif de l'endocytose d'IFNAR par déplétion de clathrin, nous a permis de montrer que l'activation de PTP1B est inhibée à la membrane plasmique. Cela a été confirmé par des expériences d'interaction protéine-protéine (Proximity Ligation Assay) indiquant que STAM est constitutivement associé à IFNAR1, tandis que l'interaction entre IFNAR1 et Hrs a seulement lieu à l'endosome.Ainsi, nos résultats permettent d'établir un modèle dans lequel, à la membrane plasmique, STAM est un frein permanent à la signalisation Jak/STAT, qui est levé après l'endocytose d'IFNAR et sa libération dans l'endosome de tri. De plus, nous avons montré que l'interaction Hrs/STAM dans l'endosome précoce permet de différencier, de manière sélective, l'activation de la signalisation Jak/STAT médiée par l'IFN-α ou l'IFN-β. / A decade ago, my laboratory established the first role of type I IFNs receptor (IFNAR) endocytosis in the control of Jak/STAT signaling induced by type 1 IFNs (Marchetti et al., 2006). A salient question is now to elucidate why and how IFNAR endocytosis could control the Jak/STAT pathway. Two key players of endosomal sorting retained our interest: Hrs (Hepatocyte growth factor-Regulated tyrosine kinase Substrate) and STAM (Signal Transducing Adaptor Molecule). These two classical components of the ESCRT-0 (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport-0) complex were ideally placed at the interface between signaling and membrane trafficking. By using a combination of molecular and cellular biology, biochemistry, and fluorescent microscopy, we could establish that STAM binds to the IFNAR complex at the plasma membrane to exert an inhibitory effect on Jak/STAT signaling. This inhibition is removed when IFNAR is delivered to the sorting endosome by interacting with Hrs upon IFN-α stimulation. Based on shRNA down-expression and pharmacological inhibition, we further involve the PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B) as it activates Jak/STAT signaling upon IFN stimulation. We could also show that PTP1B activation is inhibited by STAM at the plasma membrane from experiments where IFNAR endocytosis was blocked by siRNA-mediated clathrin down-expression. This was further confirmed by protein-protein interaction experiments (Proximity Ligation Assay) showing that STAM was constitutively associated with IFNAR1, whereas the interaction between IFNAR1 and Hrs occured only at the sorting endosome. Our results therefore allow to draw a model where STAM is a constitutive handbrake on Jak/STAT signaling at the plasma membrane that is released after IFNAR endocytosis and delivery to the sorting endosome. We further show that Hrs/STAM interaction at the early endosome allows to selectively distinguish the activation of Jak/STAT signaling mediated by IFN-α or IFN-β.

Les cysteinyl-leucotriènes (cysLTs) ont des rôles majeurs dans la pathophysiologie de l'asthme et sont impliqués dans le remodelage des voies respiratoires, un processus caractérisé par plusieurs changements structuraux incluant entre autre [i.e. autres] la fibrogenèse et l'hyperplasie des cellules musculaires lisses. Dans cette étude, nous avons investigué le rôle potentiel des cysLTs dans la modulation du « vascular endothelial growth factor » (VEGF), un facteur de croissance connu pour être important dans une autre facette du remodelage, c'est-à-dire l'angiogenèse. Nous avons montré que le LTD[indice inférieur 4] induit l'expression du VEGF chez les monocytes humains et les cellules musculaires lisses bronchiques humaines avec une inhibition complète par un antagoniste spécifique du récepteur CysLT1. De plus, des cellules de reins embryonnaires humaines (HEK-293) transfectées d'une façon stable avec CysLT1 ont été utilisées pour étudier la régulation transcriptionnelle du promoteur du VEGF. La stimulation de ces cellules avec des cysLTs mène à l'activation du promoteur du VEGF d'une façon dépendante de la concentration et résistante à la Bordetella pertussis toxin (PTX). Aussi, il en résulte une augmentation de l'expression de l'ARNm et de la protéine du VEGF d'une façon dépendante du temps de stimulation. L'utilisation de mutants tronqués en 5' de la construction du promoteur du VEGF de type sauvage démontre que la région en amont de -90 Pb n'est pas requise pour sa régulation transcriptionnelle par les cysLTs. De plus, un prétraitement avec des inhibiteurs pharmacologiques des MAPKs suggère l'implication de JNK et ERK, mais pas de p38 dans l'activation du promoteur du VEGF par LTD[indice inférieur 4]. Également, l'inhibition partielle de l'activation du promoteur du VEGF via la surexpression des formes dominantes négatives des protéines JunD, FosB et Ras suggère un rôle actif pour le complexe AP-1. Cependant, puisqu'un mutant du promoteur avec des substitutions dans le site de liaison d'AP-1 maintient toujours sa transactivation par LTD[indice inférieur 4], le complexe AP-1 semble agir d'une façon indirecte. En fait, l'inhibition complète de l'activation du promoteur du VEGF et de l'augmentation subséquente de son ARNm par un prétraitement avec la mithramycine, un inhibiteur de la transcription Sp1-dépendante, suggère que AP-1 pourrait agir indirectement sur Sp1 pour la modulation du VEGF par les cysLTs. Par surcroît, des expériences utilisant un promoteur du VEGF (-123 +50 pb) avec tous ses sites Sp1 mutés (4) ont montré que ces régions étaient nécessaires à la transactivation du VEGF par LTD[indice inférieur 4]. Bref, nos résultats indiquent pour la première fois que les cysLTs peuvent activer transcriptionnellement la production du VEGF via le récepteur CysLT1, avec l'implication de JNK, ERK, AP-1 et Sp1. Ces résultats proposent que les cysLTs pourraient être importants dans le processus d'angiogenèse associé au remodelage des voies respiratoires et indiquent un possible bénéfice jusqu'à maintenant insoupçonné dans l'utilisation des antagonistes des récepteurs CysLT1 dans la prévention ou le traitement du remodelage dans l'asthme.

Dans les cardiomyocytes, la concentration intracellulaire de Ca2+ doit être finement régulée pour maintenir l’homéostasie calcique. La protéine Stromal interaction molecule 1 (STIM1), qui joue un rôle important dans le maintien des niveaux intracellulaires de Ca2+ des cellules non excitables en opérant l’entrée capacitative de Ca2+ (SOCE), est aussi présente dans les cardiomyocytes. Plusieurs études démontrent que STIM1 et le SOCE jouent un rôle important dans le développement de l’hypertrophie des cardiomyocytes. De plus, récemment, un nouveau rôle de STIM1 a commencé à émerger. STIM1 pourrait moduler l’expression de certains canaux calciques à la membrane plasmique en régulant leur trafic intracellulaire. Le but de l’étude était d’identifier des partenaires d’interaction de STIM1 dans l’optique de révéler le mécanisme par lequel STIM1 induit l’internalisation d’un canal calcique voltage-dépendant. Les protéines recueillies par le pull-down à partir des lysats de coeurs de rats avec une colonne d’affinité composée du domaine ERM de STIM1, ont été analysées en spectrométrie de masse. La protéine Muscle related coiled-coil (MURC), une protéine de la famille des Cavin, a été retenue comme partenaire d’interaction potentiel de STIM1. Comme elle est exprimée dans les cardiomyocytes et dans les cellules musculaires squelettiques, qui sont des cellules où la régulation de la signalisation calcique est primordiale pour le bon fonctionnement des tissus et qu’elle semble interagir avec STIM1, qui est un acteur important de la signalisation calcique, notre objectif s’est élargi et nous avons investigué sur l’implication de MURC dans la signalisation calcique en général. Nous avons donc confirmé par co-immunoprécipitation que le domaine ERM de STIM1 interagissait avec MURC. Puis, par des essais d’imagerie calcique, nous avons démontré que la surexpression de MURC pouvait provoquer différentes réponses dans différents types cellulaires en fonction de l’activation de la mobilisation calcique. En effet, nous avons observé une augmentation du SOCE qui est indépendante de la voie RhoA/ROCK dans les cellules HEK293T, une diminution de l’entrée de calcium médiée par un récepteur (ROCE) qui est pourrait être dépendante de la voie RhoA/ROCK dans les cellules T6.11 et une diminution de l’activation de RhoA de façon dépendante de l’activation du SOCE dans les cardiomyocytes HL-1. Nous avons aussi montré que MURC pouvait interagir à la membrane plasmique avec les protéines Orai1, qui sont les protéines formant les canaux CRAC (Ca2+ release-activated Ca2+) du SOCE et ce de façon dépendante de l’activation de STIM1. Enfin, les résultats de cette étude suggèrent que MURC est un partenaire d’interaction de STIM1 impliqué dans la signalisation calcique. En effet, MURC peut moduler l’activation de RhoA, ce qui pourrait induire l’internalisation de canaux calciques. De plus, son interaction avec STIM1 et Orai1 pourrait notamment faire un pont facilitant l’interaction entre STIM1 et Orai1 ce qui aurait pour effet d’augmenter le SOCE et possiblement contribuer à augmenter l’hypertrophie des cardiomyocytes.

Depuis plusieurs années, le tissu adipeux est reconnu comme un organe complexe et extrêmement important au maintien de l'homéostasie chez les mammifères. En effet, une dérégulation de sa taille et/ou de ses fonctions endocrines peut mener à l'apparition de nombreuses pathologies potentiellement mortelles, telles que le diabète de type II, l'hypertension ou encore des troubles cardiovasculaires. Ainsi, il est d'une importance capitale de bien comprendre les phénomènes moléculaires qui entourent la différenciation des cellules graisseuses afin de mieux réagir en clinique lors de l'apparition de telles conditions. Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle d'une protéine kinase appelée dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) dans la formation du tissu graisseux en utilisant un modèle cellulaire murin à différenciation inductible, les 3T3-L1. À l'aide d'approches pharmacologiques et d'ARN interférence, j'ai pu démontrer que cette protéine est essentielle à l'adipogenèse. En effet, une diminution de l'expression de DLK dans les cellules 3T3-L1 bloque la différenciation à un stade précoce, i.e. entre la liaison du facteur de transcription C/EBP[béta] à l'ADN et l'expression de ses gènes cibles, tels que C/EBP[alpha] et PPAR[gamma]. L'étude plus poussée des voies de signalisation des MAPKs à l'aide d'inhibiteurs pharmacologiques dans des cellules où l'expression de DLK a été diminuée a révélé que l'action bénéfique de DLK lors de la différenciation se situe au niveau de la voie ERK. En effet, l'induction de DLK au cours de l'adipogenèse résulte en une diminution de l'association des protéines KSR-1, Mek et ERK, ce qui mène à une diminution temporaire de l'activité de ERK et de la phosphorylation inhibitrice sur la sérine 82 du régulateur central de la différenciation des adipocytes, PPAR[gamma]. Finalement, nous avons pu déterminer que l'induction de DLK au cours de la différenciation des cellules graisseuses est modulée par PPAR[gamma].