Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_torres_ioc_dout_2015.pdf: 4727913 bytes, checksum: 39b1968a4427b96bd96b03ae25ef6316 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O Diabetes mellitus é uma das principais doenças crônicas que afetam a população mundial. Além de hiperglicemia, os pacientes diabéticos exibem uma marcante hiperatividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) evidenciada pelo aumento dos níveis de glicocorticoides (GCs) circulantes. Este hipercortisolismo é importante em várias complicações diabéticas. No entanto, há poucas evidências da participação dos GCs em outras morbidades do diabetes, como na atrofia muscular, compartilhadas por pacientes com o diabetes e pessoas com Cushing, uma doença caracterizada pela hiperatividade deste eixo HPA. A redução na expressão do receptor nuclear PPAR-\03B3 tem sido demonstrada em órgãos de animais diabéticos acometidos por complicações da doença, e a ativação de PPAR-\03B3 é capaz de restaurar a funcionalidade desses órgãos. Além disso, o tratamento de pacientes com a doença de Cushing com ligantes de PPAR-\03B3 reduz os níveis de GCs circulantes. Desse modo, o nosso objetivo foi investigar o papel do PPAR-\03B3 na atividade do eixo HPA em animais diabéticos. O diabetes foi induzido por injeção intravenosa de aloxana em ratos em jejum. O agonista de PPAR-\03B3 rosiglitazona (rosi), o antagonista do receptor de GCs RU486 ou inibidor de PI3K wortmannin foram administrados diariamente durante 18 dias consecutivos, começando três dias após a injeção de aloxana. Observamos que a condição diabética induzida por administração de aloxana em ratos é caracterizada por hiperatividade do eixo HPA com redução na expressão de receptores de GCs na hipófise, hipertrofia adrenal e aumento dos níveis de GCs circulantes O papel destes hormônios esteroides sobre a atrofia muscular em animais diabéticos foi evidenciado pela melhoria no parâmetro microvascular funcional do músculo grácil, e aumento da massa do músculo gastrocnêmio observada em animais diabéticos tratados com RU486. Em paralelo com a hiperatividade do eixo HPA, observamos uma redução da expressão de PPAR-\03B3 nas adrenais e hipófise, bem como uma diminuição no ligante de PPAR-\03B3 15-d-PGJ2 no plasma dos animais diabéticos. O tratamento destes animais com rosi foi capaz de reduzir os níveis de GCs, em associação com a diminuição da hipertrofia adrenal e expressão de MC2-R. Em paralelo, a rosi restaurou os níveis de ACTH no plasma, em associação com a redução no número de células corticotróficas e expressão de POMC na hipófise dos ratos diabéticos, mesmo não restabelecendo o mecanismo de controle por retroalimentação da produção de GCs na hipófise através dos receptores de mineralocorticoides e GCs, respectivamente, MR e GR. Além disso, o tratamento com rosi aumentou a expressão de PPAR-\03B3 nas glândulas adrenais e hipófise dos ratos diabéticos, e o bloqueio de PPAR-\03B3 com GW9662 inibiu a capacidade da droga de reduzir os níveis plasmáticos de GCs. Os ratos diabéticos também apresentaram redução na expressão de PI3K na hipófise, e a rosi aumentou a expressão desta cinase nas glândulas adrenais e na hipófise. Além disso, o pré-tratamento de ratos diabéticos com wortmannin foi capaz de reduzir parcialmente a capacidade da rosi em reduzir os níveis de GCs no plasma. Assim, sugerimos que a hiperatividade do eixo HPA em animais diabéticos está diretamente relacionada com a atrofia muscular Além disso, a ativação de PPAR-\03B3 restaura a reatividade eixo HPA em ratos diabéticos através de um mecanismo dependente da ativação de PI3K, surgindo como um possível alvo no controle das complicações da doença / Diabetes mellitu s is one of the major chronic diseases that affect the world population . Beyond of hyperglycemia, diabetic patients exhi bit a marked hyperactivity of the hypothalam us - pituitary - adrenal (HPA) axis evidenced by increased levels of circulating glucocorticoids (GCs) . This hypercortisolism is important in several diabetic complications. However, there are few evidence s of the pa rticipation of GCs in other diabetic morbidities , including muscle atr o phy, that are shared by patients with diabet es and individuals with Cushing , a disease characterized by hyperactivity of HPA axis. The reduction in the expression of the nuclear recepto r PPAR - γ has been demonstrated in diabetic animal organs affected by complications of disease, and the PPAR - γ activation is able to restore the functionality of these organs. Furthermore, treatment of patients w ith Cushing’s disease with PPAR - γ ligands reduc es the levels of circulating GC s. Thereby, our aim was to investigate the role of PPAR - γ on HPA axis activity in diabetic animals. Diabetes was induced by the intravenous injection of alloxan into fasted rats. The PPAR -  agonist rosiglitazone (rosi) , GCs r eceptor antagonist RU486 or PI3K inhibitor wortmannin were administered daily for 18 consecutive days, starting three days after alloxan injection . We observed that the diabetic condition induced by alloxan administration in rats is characterized by a hype ractivity of the HPA axis with reduction in GCs receptor expression in the pituitary, adrenal hypertrophy and increase in circulating levels of GC s. The role of these steroid hormones on muscular atrophy in the diabetic animals was evidenced by improvement in the microvascular functional parameter of gracilis muscle, and increase of the mass of the gastrocnemius muscle observed in diabetic animals treated with RU486. In parallel with the hyperactivity of the HPA axis, we observed a reduction of PPAR - γ expre ssion in the adrenal and pituitary as well as a decreased on plasma PPAR - γ ligand 15 - d - PGJ 2 in the diabetic animals . Trea tment of these animals with rosi was able to reduce the GCs levels , in association with decrease of adrenal hypertrophy and MC2R expres sion. In parallel, rosi restore d plasma ACT H levels , in association with reduction of corticotrophic cells and POMC expressio n in pituitary of diabetic rats, despite of not restoring the feedback control of GCs production in the pituitary through mineraloc orticoid and GCs receptors, respectively MR and GR . Furthermore, treatment with rosi increase s the expression of PPAR - γ in both adrenal and pituitary glands in diabetic rats , and the blocka g e of PPAR - γ with GW9662 inhibited the capacity of the drug to reduce plasma GCs levels . Diabetic rats also presented reduction of PI3K expression in pituitary, and r osi increased the expression of this kinase in both adrenal and pituitary glands. In addition, pre - treatment of diabetic rats with wortmannin was able to partially reduce the ability of rosi to reduce plasma GCs levels . Thus, we suggest that the HPA axis h yperactivity in diabetic animals is directly related with muscle atrophy. Moreover, the activation of PPAR - γ restored HPA axis reactivity in diabetic rats via a mechanism dependent on PI3K activation , emerging as a possible target in the control of the disease complications / 2016-11-28

Introdução: A neurobiologia dos transtornos de ansiedade (TA) é complexa e envolve interações ambientais e genéticas ainda não conhecidas. Esses transtornos, comumente, iniciam durante a infância e adolescência, persistindo ao longo da vida. O comprometimento da resposta biológica frente ao estímulo estressor, encontrado em muitos pacientes com TA, sugere a influência do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) nestes transtornos e, portanto, os polimorfismos associados ao eixo HHA poderiam ser estudados em genes candidatos. Os estudos que almejam entender a etiologia dos TA devem, também, explorar as alterações epigenéticas (incluindo a metilação do DNA) decorrentes das influências ambientais. Objetivos: Estudar, em adolescentes, polimorfismos genéticos funcionais do eixo HHA, interações Gene x Ambiente (G x A) e metiloma do DNA, considerando as diferentes trajetórias dos TA. Métodos: Foi realizada a extração de DNA das células do epitélio bucal de 228 adolescentes (131 casos e 97 controles para os TA) e foram genotipados, por PCR em tempo real, polimorfismos funcionais envolvidos com o eixo HHA (FKBP5: rs3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 rs1360780, rs9470080 e rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198;: rs6198;: rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951;: rs2070951;: rs2070951; CRHR1CRHR1 CRHR1 : rs878886 : rs878886 e SERPINA6 SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Os participantes responderam à escala auto-aplicativa SCARED (Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated) e realizaram entrevistas semiestruturadas para avaliação diagnóstica utilizando o K-SADS-PL (Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime). O questionário CTQ (Childhood Trauma Questionnaire) foi aplicado em 90 adolescentes (54 casos e 36 controles para os TA) para avaliar a interação entre o trauma emocional e o polimorfismo do gene NR3C2 nos níveis séricos de BDNF. Uma subamostra de adolescentes (n=47) foi reavaliada, cinco anos após a primeira coleta, através das mesmas entrevistas psiquiátricas e nova extração de DNA salivar. Alguns participantes, na última avaliação, responderam ao MINI (Mini International Neuropsychiatric Interview) apropriado para a idade atual. A amostra foi organizada em 4 grupos, conforme o diagnóstico dos TA e o ano da coleta de saliva (anos de 2008 e 2013): (1) Desenvolvimento típico da adolescência (Controle; n=14); (2) Incidentes para os TA (ITA; n=11); (3) Persistentes para os TA (Caso; n=14) e (4) Remitentes para os TA (RTA; n=08). O metiloma do DNA foi analisado com o Infinium HumanMethylation 450 BeadChip da Illumina. Resultados: Não foi encontrada associação entre os polimorfismos estudados e os TA. Em relação à interação G x A, sugere-se que o polimorfismo rs2070951 do gene NR3C2 modera a associação entre negligência física e os níveis séricos de BDNF. Do ponto de vista epigenético, foi observada, nos grupos ITA e RTA, vias biológicas com padrão homogêneo e relacionadas ao sistema nervoso. Já nos grupos casos e controles para os TA, foram evidenciadas vias biológicas com padrão mais heterogêneo. Um perfil de hipometilação do DNA foi predominante nas vias encontradas. Na análise transversal, nós encontramos padrões opostos de metilação do DNA, conforme o período desenvolvimental avaliado: hipometilação no início da adolescência e hipermetilação em jovens adultos. Conclusão: Esse estudo abordou, em uma amostra de adolescentes, aspectos genéticos (genes candidatos envolvidos com o eixo HHA), ambientais (trauma emocional) e epigenéticos (metiloma do DNA) dos TA. Os achados sugerem que, embora sem associações entre os TA e genes envolvidos no eixo HHA, existe uma interação entre a presença de trauma emocional, polimorfismo genético do eixo HHA e marcadores biológicos. Os achados do metiloma do DNA sugerem, também, influências epigenéticas no curso dos TA. Novos estudos devem ser delineados para corroborar as influências genéticas e ambientais neste transtorno. / Background: The neurobiology of Anxiety Disorders (AD) is complex and involves environmental and genetic interactions understood. These disorders may have their onset during childhood and adolescence, persisting throughout life. The impairment of biological response against the stressor stimulus, described in many patients with AD, suggests a possible role of genetic polymorphisms of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in these individuals. Studies that aim to understand the etiology of AD should also explore the epigenetic changes (including DNA methylation) arising from environmental influences. Objective: To study, in adolescents, functional genetic polymorphisms of HPA axis, Gene x Environment (G x E) interactions and DNA methylome, considering different AD outcomes. Methods: Saliva DNA was extracted from 228 adolescents (131 cases and 97 controls to AD) and we genotyped, by real time PCR, the functional polymorphisms involved with HPA axis (FKBP5: rs3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198; : rs6198; : rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951; : rs2070951; CRHR1CRHR1CRHR1 CRHR1: rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and SERPINA6 SERPINA6 SERPINA6SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Participants responded to the scale self-applied Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated (SCARED) and were diagnosed according to the Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime (K-SADS-PL). The Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) was applied in 90 adolescents (54 cases e 36 controls to AD) to evaluate the interaction between emotional trauma and the NR3C2 polymorphism in the serum levels of BDNF. A sub-sample of adolescents (n = 47) was reassessed five years after the first evaluation by the same psychiatric semi-structured interviews and new extraction salivary DNA was performed. Some participants in the last evaluation responded to Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI), which is a semi structure interview appropriate for the present age. The sample was organized in four groups according to the diagnosis of AD and the year of saliva collection (2008 and 2013): (1) Typically Developing Controls (TDC; n = 14); (2) Incident Anxiety Disorder (IAD; n = 11); (3) Persistent Anxiety Disorder (PAD; n = 14); (4) Remittent Anxiety Disorder (RAD; n = 8). DNA methylome was evaluated with Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Results: We did not find any association between the genetic polymorphisms and AD. Considering the G x E interaction we suggest that rs2070951 polymorphism of NR3C2 gene moderates the association between physical neglect and serum BDNF levels. When we evaluated the DNA methylome, we observed more homogeneous biological pathways and mostly related with nervous system in individuals from IAD and RAD groups. On the other hand, in the TDC and PAD groups, we found biological pathways with a more heterogeneous pattern. A DNA hypomethylation profile was found predominant in the pathways. In a cross-sectional analysis, we found opposite patterns of DNA methylation, as the developmental period assessed: hypomethylation at the beginning of adolescence and hypermethylation in young adults. Conclusion: This study addressed, in an adolescent sample, genetics (candidate genes linked to HPA axis), environmental (emotional trauma) and epigenetic (DNA methylome) aspects of AD. The findings suggest that although there are no associations between AD and genes involved in HPA axis, there is an interaction between the presence of trauma, genetic polymorphism involved in this axis and biomarkers. The DNA methylome findings also suggest epigenetic influences on the course of TA. Further studies should be designed to corroborate the genetic influences in this disorder.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-11T18:05:38Z No. of bitstreams: 1 ailin_l_oliveira_ioc_bcm_0048_2011.pdf: 2784238 bytes, checksum: 109591f3b041c2482398b825d1bb7d51 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-11T18:05:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ailin_l_oliveira_ioc_bcm_0048_2011.pdf: 2784238 bytes, checksum: 109591f3b041c2482398b825d1bb7d51 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Pesquisa sobre o Timo. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No curso das doenças infecciosas, os circuitos neuroendócrinos e imunes atuam em conjunto facilitando a resposta do hospedeiro. Alterações no eixo hipotálamo-hipófise- adrenal são frequentemente associadas a infecções, como as causadas pelo Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Durante a fase aguda da infecção por T. cruzi, a ação pró-apoptótica de glicocorticóides (GC), sistemicamente aumentados, sobre timócitos CD4+CD8+ (DP), resulta em atrofia tímica. Recentemente, nosso grupo demonstrou expressão alterada de prolactina (PRL), um outro hormônio relacionado ao estresse, durante a infecção por T. cruzi. Com base no conhecimento das ações imunomoduladoras de PRL, como a proteção de timócitos da apoptose induzida por GC, pretendemos no presente estudo investigar uma possível função da ativação cruzada entre os receptores intratímicos de PRL e GC (PRLR e GR, respectivamente) no desencadeamento da atrofia tímica induzida por T. cruzi. Observamos um circuito intratímico específico de modulação de ambos os hormônios durante a infecção experimental por T. cruzi em camundongos adultos jovens. Enquanto os níveis plasmáticos de PRL e GC apresentaram-se aumentados no início da fase aguda da infecção, quando o processo de atrofia tímica é instaurado, os níveis intratímicos desses hormônios diminuíram, restabelecendo-se posteriormente aos níveis fisiológicos do controle não-infectado. Paralelamente, variações da expressão intratímica de PRLR e GR, ocorreram em acordo com a modulação local de seus ligantes. No início do processo de atrofia tímica, quando muitas células DP estão entrando em apoptose, observamos aumento da expressão de GR e diminuição de PRLR. Em um segundo momento, durante a fase mais tardia da infecção experimental por T. cruzi, houve restabelecimento da expressão gênica de ambos os receptores nessas células. Nessa fase, quando o processo de morte celular encontra-se estabilizado e somente algumas células aparentemente mais resistentes à ação pró-apoptótica de GC sobreviveram, observamos aumento da proteína Bcl-xl, um importante fator anti apoptótico induzido por PRL. Em acordo com esses achados, utilizando-se um modelo de indução de apoptose in vitro, verificamos maior Suscetibilidade de timócitos à morte induzida por GC nos períodos iniciais da infecção, bem como aos efeitos protetores de PRL, o que não foi observado na fase mais tardia da infecção. Tomados em conjunto, nossos dados apontam para uma função cruzada (cross-talk) entre PRLR e GR intratímicos, e que seria responsável pela manutenção da homeostasia tímica. Nesse sentido, alterações desse circuito podem contribuir para o processo de atrofia tímica característico da fase aguda da infecção pelo T. cruzi. / During infectious diseases, neuroendocrine and immune networks act in concert, facilitating host response. Disorders in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis are frequently observed associated to infections. It has been demonstrated that increased level of circulating glucocorticoids (GC) systemic levels during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection, the etiological agent of Chaga ́s disease, results in thymus atrophy. Such steroid can trigger apoptosis on cortical thymocytes bearing the phenotype CD4+CD8+ (DP) via a specific glucocorticoid receptor (GR). Changes in thymocyte development may have an important consequence for the disease, i.e., further autoimmune reactions. Recently our group demonstrated altered expression of prolactin (PRL), another hormone related to stress, during T. cruzi infection. Based on studies showing expression of PRL receptors (PRLR) on lymphocytes, and its effects on growth, differentiation, and apoptosis in lymphoid cells, this hormone is supposed to functions as an immunomodulator. Furthermore, prolactin protects T cells from GC- induced apoptosis both in vivo and in vitro, which corroborates to this hypothesis. Based on these data, here we aim to investigate the possible role of intrathymic GR- PRLR cross-talk to the outcome of T. cruzi induced thymus atrophy. Our results demonstrate altered intrathymic PRL and corticosterone levels during the acute phase of T. cruzi infection. When the same hormones were evaluated on plasma, a different modulation was detected, suggesting an independence of intrathymic and systemic circuits that may be related to thymus atrophy. Furthermore, we detected the variation of PRLR and GR intrathymic expression, that ocurred in accordance to the modulation of their locally produced ligands. The analysis of DP cells that survived to the apoptosis process at the late phase of acute infection, demonstrated increased PRLR expression in parallel to the decrease of GR levels, This receptor expression profile courses with an increase of anti apoptotic proteins and the stabilization of the thymus atrophy process and seems an important factor for the survival of these cells. Using an in vitro model of thymocyte apoptosis induction, we observed that such alterations result in different GC-induced cell death susceptibility as well as an altered answer to prolactin anti -apoptotic effects. Taken together our results point to an relevant intrathymic PRLR-GR cross-talk involved in thymus homeostasis. In this way, changes of this circuit may contribute to the outcome of the thymus atrophy characteristic of the acute phase of T. cruzi infection.

Introdução: A neurobiologia dos transtornos de ansiedade (TA) é complexa e envolve interações ambientais e genéticas ainda não conhecidas. Esses transtornos, comumente, iniciam durante a infância e adolescência, persistindo ao longo da vida. O comprometimento da resposta biológica frente ao estímulo estressor, encontrado em muitos pacientes com TA, sugere a influência do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) nestes transtornos e, portanto, os polimorfismos associados ao eixo HHA poderiam ser estudados em genes candidatos. Os estudos que almejam entender a etiologia dos TA devem, também, explorar as alterações epigenéticas (incluindo a metilação do DNA) decorrentes das influências ambientais. Objetivos: Estudar, em adolescentes, polimorfismos genéticos funcionais do eixo HHA, interações Gene x Ambiente (G x A) e metiloma do DNA, considerando as diferentes trajetórias dos TA. Métodos: Foi realizada a extração de DNA das células do epitélio bucal de 228 adolescentes (131 casos e 97 controles para os TA) e foram genotipados, por PCR em tempo real, polimorfismos funcionais envolvidos com o eixo HHA (FKBP5: rs3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 rs1360780, rs9470080 e rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198;: rs6198;: rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951;: rs2070951;: rs2070951; CRHR1CRHR1 CRHR1 : rs878886 : rs878886 e SERPINA6 SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Os participantes responderam à escala auto-aplicativa SCARED (Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated) e realizaram entrevistas semiestruturadas para avaliação diagnóstica utilizando o K-SADS-PL (Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime). O questionário CTQ (Childhood Trauma Questionnaire) foi aplicado em 90 adolescentes (54 casos e 36 controles para os TA) para avaliar a interação entre o trauma emocional e o polimorfismo do gene NR3C2 nos níveis séricos de BDNF. Uma subamostra de adolescentes (n=47) foi reavaliada, cinco anos após a primeira coleta, através das mesmas entrevistas psiquiátricas e nova extração de DNA salivar. Alguns participantes, na última avaliação, responderam ao MINI (Mini International Neuropsychiatric Interview) apropriado para a idade atual. A amostra foi organizada em 4 grupos, conforme o diagnóstico dos TA e o ano da coleta de saliva (anos de 2008 e 2013): (1) Desenvolvimento típico da adolescência (Controle; n=14); (2) Incidentes para os TA (ITA; n=11); (3) Persistentes para os TA (Caso; n=14) e (4) Remitentes para os TA (RTA; n=08). O metiloma do DNA foi analisado com o Infinium HumanMethylation 450 BeadChip da Illumina. Resultados: Não foi encontrada associação entre os polimorfismos estudados e os TA. Em relação à interação G x A, sugere-se que o polimorfismo rs2070951 do gene NR3C2 modera a associação entre negligência física e os níveis séricos de BDNF. Do ponto de vista epigenético, foi observada, nos grupos ITA e RTA, vias biológicas com padrão homogêneo e relacionadas ao sistema nervoso. Já nos grupos casos e controles para os TA, foram evidenciadas vias biológicas com padrão mais heterogêneo. Um perfil de hipometilação do DNA foi predominante nas vias encontradas. Na análise transversal, nós encontramos padrões opostos de metilação do DNA, conforme o período desenvolvimental avaliado: hipometilação no início da adolescência e hipermetilação em jovens adultos. Conclusão: Esse estudo abordou, em uma amostra de adolescentes, aspectos genéticos (genes candidatos envolvidos com o eixo HHA), ambientais (trauma emocional) e epigenéticos (metiloma do DNA) dos TA. Os achados sugerem que, embora sem associações entre os TA e genes envolvidos no eixo HHA, existe uma interação entre a presença de trauma emocional, polimorfismo genético do eixo HHA e marcadores biológicos. Os achados do metiloma do DNA sugerem, também, influências epigenéticas no curso dos TA. Novos estudos devem ser delineados para corroborar as influências genéticas e ambientais neste transtorno. / Background: The neurobiology of Anxiety Disorders (AD) is complex and involves environmental and genetic interactions understood. These disorders may have their onset during childhood and adolescence, persisting throughout life. The impairment of biological response against the stressor stimulus, described in many patients with AD, suggests a possible role of genetic polymorphisms of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in these individuals. Studies that aim to understand the etiology of AD should also explore the epigenetic changes (including DNA methylation) arising from environmental influences. Objective: To study, in adolescents, functional genetic polymorphisms of HPA axis, Gene x Environment (G x E) interactions and DNA methylome, considering different AD outcomes. Methods: Saliva DNA was extracted from 228 adolescents (131 cases and 97 controls to AD) and we genotyped, by real time PCR, the functional polymorphisms involved with HPA axis (FKBP5: rs3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198; : rs6198; : rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951; : rs2070951; CRHR1CRHR1CRHR1 CRHR1: rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and SERPINA6 SERPINA6 SERPINA6SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Participants responded to the scale self-applied Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated (SCARED) and were diagnosed according to the Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime (K-SADS-PL). The Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) was applied in 90 adolescents (54 cases e 36 controls to AD) to evaluate the interaction between emotional trauma and the NR3C2 polymorphism in the serum levels of BDNF. A sub-sample of adolescents (n = 47) was reassessed five years after the first evaluation by the same psychiatric semi-structured interviews and new extraction salivary DNA was performed. Some participants in the last evaluation responded to Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI), which is a semi structure interview appropriate for the present age. The sample was organized in four groups according to the diagnosis of AD and the year of saliva collection (2008 and 2013): (1) Typically Developing Controls (TDC; n = 14); (2) Incident Anxiety Disorder (IAD; n = 11); (3) Persistent Anxiety Disorder (PAD; n = 14); (4) Remittent Anxiety Disorder (RAD; n = 8). DNA methylome was evaluated with Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Results: We did not find any association between the genetic polymorphisms and AD. Considering the G x E interaction we suggest that rs2070951 polymorphism of NR3C2 gene moderates the association between physical neglect and serum BDNF levels. When we evaluated the DNA methylome, we observed more homogeneous biological pathways and mostly related with nervous system in individuals from IAD and RAD groups. On the other hand, in the TDC and PAD groups, we found biological pathways with a more heterogeneous pattern. A DNA hypomethylation profile was found predominant in the pathways. In a cross-sectional analysis, we found opposite patterns of DNA methylation, as the developmental period assessed: hypomethylation at the beginning of adolescence and hypermethylation in young adults. Conclusion: This study addressed, in an adolescent sample, genetics (candidate genes linked to HPA axis), environmental (emotional trauma) and epigenetic (DNA methylome) aspects of AD. The findings suggest that although there are no associations between AD and genes involved in HPA axis, there is an interaction between the presence of trauma, genetic polymorphism involved in this axis and biomarkers. The DNA methylome findings also suggest epigenetic influences on the course of TA. Further studies should be designed to corroborate the genetic influences in this disorder.

Introdução: A neurobiologia dos transtornos de ansiedade (TA) é complexa e envolve interações ambientais e genéticas ainda não conhecidas. Esses transtornos, comumente, iniciam durante a infância e adolescência, persistindo ao longo da vida. O comprometimento da resposta biológica frente ao estímulo estressor, encontrado em muitos pacientes com TA, sugere a influência do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) nestes transtornos e, portanto, os polimorfismos associados ao eixo HHA poderiam ser estudados em genes candidatos. Os estudos que almejam entender a etiologia dos TA devem, também, explorar as alterações epigenéticas (incluindo a metilação do DNA) decorrentes das influências ambientais. Objetivos: Estudar, em adolescentes, polimorfismos genéticos funcionais do eixo HHA, interações Gene x Ambiente (G x A) e metiloma do DNA, considerando as diferentes trajetórias dos TA. Métodos: Foi realizada a extração de DNA das células do epitélio bucal de 228 adolescentes (131 casos e 97 controles para os TA) e foram genotipados, por PCR em tempo real, polimorfismos funcionais envolvidos com o eixo HHA (FKBP5: rs3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 rs1360780, rs9470080 e rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198;: rs6198;: rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951;: rs2070951;: rs2070951; CRHR1CRHR1 CRHR1 : rs878886 : rs878886 e SERPINA6 SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Os participantes responderam à escala auto-aplicativa SCARED (Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated) e realizaram entrevistas semiestruturadas para avaliação diagnóstica utilizando o K-SADS-PL (Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime). O questionário CTQ (Childhood Trauma Questionnaire) foi aplicado em 90 adolescentes (54 casos e 36 controles para os TA) para avaliar a interação entre o trauma emocional e o polimorfismo do gene NR3C2 nos níveis séricos de BDNF. Uma subamostra de adolescentes (n=47) foi reavaliada, cinco anos após a primeira coleta, através das mesmas entrevistas psiquiátricas e nova extração de DNA salivar. Alguns participantes, na última avaliação, responderam ao MINI (Mini International Neuropsychiatric Interview) apropriado para a idade atual. A amostra foi organizada em 4 grupos, conforme o diagnóstico dos TA e o ano da coleta de saliva (anos de 2008 e 2013): (1) Desenvolvimento típico da adolescência (Controle; n=14); (2) Incidentes para os TA (ITA; n=11); (3) Persistentes para os TA (Caso; n=14) e (4) Remitentes para os TA (RTA; n=08). O metiloma do DNA foi analisado com o Infinium HumanMethylation 450 BeadChip da Illumina. Resultados: Não foi encontrada associação entre os polimorfismos estudados e os TA. Em relação à interação G x A, sugere-se que o polimorfismo rs2070951 do gene NR3C2 modera a associação entre negligência física e os níveis séricos de BDNF. Do ponto de vista epigenético, foi observada, nos grupos ITA e RTA, vias biológicas com padrão homogêneo e relacionadas ao sistema nervoso. Já nos grupos casos e controles para os TA, foram evidenciadas vias biológicas com padrão mais heterogêneo. Um perfil de hipometilação do DNA foi predominante nas vias encontradas. Na análise transversal, nós encontramos padrões opostos de metilação do DNA, conforme o período desenvolvimental avaliado: hipometilação no início da adolescência e hipermetilação em jovens adultos. Conclusão: Esse estudo abordou, em uma amostra de adolescentes, aspectos genéticos (genes candidatos envolvidos com o eixo HHA), ambientais (trauma emocional) e epigenéticos (metiloma do DNA) dos TA. Os achados sugerem que, embora sem associações entre os TA e genes envolvidos no eixo HHA, existe uma interação entre a presença de trauma emocional, polimorfismo genético do eixo HHA e marcadores biológicos. Os achados do metiloma do DNA sugerem, também, influências epigenéticas no curso dos TA. Novos estudos devem ser delineados para corroborar as influências genéticas e ambientais neste transtorno. / Background: The neurobiology of Anxiety Disorders (AD) is complex and involves environmental and genetic interactions understood. These disorders may have their onset during childhood and adolescence, persisting throughout life. The impairment of biological response against the stressor stimulus, described in many patients with AD, suggests a possible role of genetic polymorphisms of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in these individuals. Studies that aim to understand the etiology of AD should also explore the epigenetic changes (including DNA methylation) arising from environmental influences. Objective: To study, in adolescents, functional genetic polymorphisms of HPA axis, Gene x Environment (G x E) interactions and DNA methylome, considering different AD outcomes. Methods: Saliva DNA was extracted from 228 adolescents (131 cases and 97 controls to AD) and we genotyped, by real time PCR, the functional polymorphisms involved with HPA axis (FKBP5: rs3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198; : rs6198; : rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951; : rs2070951; CRHR1CRHR1CRHR1 CRHR1: rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and SERPINA6 SERPINA6 SERPINA6SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Participants responded to the scale self-applied Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated (SCARED) and were diagnosed according to the Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime (K-SADS-PL). The Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) was applied in 90 adolescents (54 cases e 36 controls to AD) to evaluate the interaction between emotional trauma and the NR3C2 polymorphism in the serum levels of BDNF. A sub-sample of adolescents (n = 47) was reassessed five years after the first evaluation by the same psychiatric semi-structured interviews and new extraction salivary DNA was performed. Some participants in the last evaluation responded to Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI), which is a semi structure interview appropriate for the present age. The sample was organized in four groups according to the diagnosis of AD and the year of saliva collection (2008 and 2013): (1) Typically Developing Controls (TDC; n = 14); (2) Incident Anxiety Disorder (IAD; n = 11); (3) Persistent Anxiety Disorder (PAD; n = 14); (4) Remittent Anxiety Disorder (RAD; n = 8). DNA methylome was evaluated with Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Results: We did not find any association between the genetic polymorphisms and AD. Considering the G x E interaction we suggest that rs2070951 polymorphism of NR3C2 gene moderates the association between physical neglect and serum BDNF levels. When we evaluated the DNA methylome, we observed more homogeneous biological pathways and mostly related with nervous system in individuals from IAD and RAD groups. On the other hand, in the TDC and PAD groups, we found biological pathways with a more heterogeneous pattern. A DNA hypomethylation profile was found predominant in the pathways. In a cross-sectional analysis, we found opposite patterns of DNA methylation, as the developmental period assessed: hypomethylation at the beginning of adolescence and hypermethylation in young adults. Conclusion: This study addressed, in an adolescent sample, genetics (candidate genes linked to HPA axis), environmental (emotional trauma) and epigenetic (DNA methylome) aspects of AD. The findings suggest that although there are no associations between AD and genes involved in HPA axis, there is an interaction between the presence of trauma, genetic polymorphism involved in this axis and biomarkers. The DNA methylome findings also suggest epigenetic influences on the course of TA. Further studies should be designed to corroborate the genetic influences in this disorder.

Ecstasy é o nome popular do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), uma droga de abuso utilizada por adultos jovens. Diversos relatos têm mostrado existência de correlações positivas entre o abuso do Ecstasy e o aparecimento de doenças infecciosas. Muitos estudos em modelos animais mostram que o MDMA induz alterações de imunidade inata e adquirida; entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais estes efeitos ocorrem. Desta forma, buscamos neste trabalho os mecanismos neuroimunes pelos quais o MDMA diminui a atividade de neutrófilos e altera a distribuição de leucócitos nos diferentes compartimentos imunes. Além disso, avaliamos se os efeitos induzidos pelo MDMA afetam a resposta a uma infecção experimental induzida por Listeria monocytogenes. Nossos resultados mostram que 60 minutos após a administração de MDMA na dose 10mg/kg, houve 1) diminuição do burst oxidativo de neutrófilos induzido por SAPI e PMA e, também, da porcentagem e da intensidade da fagocitose dos neutrófilos sanguíneos; 2) diminuição da celularidade total da medula óssea e aumento da mesma no baço, além de diminuição do peso relativo do baço; 3) aumento na porcentagem de neutrófilos e diminuição na porcentagem de linfócitos sanguíneos; e 4) diminuição da expressão de NFB de neutrófilos sanguíneos. O tratamento com metirapona ou RU-486 prévio ao tratamento com MDMA foi capaz de inibir 5) os efeitos observados em todos os parâmetros avaliados na diminuição da atividade de neutrófilos; 6) as alterações das porcentagens de neutrófilos e linfócitos sanguíneos e 7) a diminuição da expressão de NFB. Observamos, ainda, que o tratamento com 6-OHDA ou ICI-118,551 prévio ao tratamento com MDMA 8) não foram capazes de inibir os efeitos induzidos pelo MDMA na atividade de neutrófilos e na contagem diferencial de leucócitos sanguíneos; no entanto, 9) preveniram as alterações de celularidade induzidas por MDMA na medula óssea e no baço, e 10) a diminuição do peso relativo do baço. Por fim, observamos em um modelo de infecção experimental por LM que o MDMA 11) induziu mielosupressão (diminuição do CFU na medula óssea e aumento no baço); 12) diminuiu o número de leucócitos sanguíneos e a celularidade da medula óssea; 13) aumentou a celularidade do baço; 14) diminuiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) e quimiocina (MCP-1) nas primeiras 24 h; e 15) aumentou a produção das mesmas citocinas e quimiocina após 72 h da indução da infecção. Desta forma, concluímos que os efeitos induzidos pelo MDMA sobre a atividade de neutrófilos foram provavelmente mediados pela diminuição da expressão de NFB induzido pela ação da corticosterona e que a corticosterona, também está envolvida com as alterações na contagem diferencial de neutrófilos e linfócitos. As catecolaminas periféricas responderam pelas alterações na distribuição de leucócitos entre baço e medula óssea, e diminuição do peso relativo do baço. Além disso, o MDMA pode ser considerado uma droga imunossupressora visto que diminuiu a resistência a uma infecção por LM por mecanismos neuroimunes / Ecstasy is the popular name of 3,4-metylendioxymetamphetamine (MDMA), a drug of abuse mainly used by young adults. Several reports have shown the existence of a positive correlation between Ecstasy abuse and increased susceptibility to infectious diseases. Some studies using animal models report that MDMA induces alterations in both innate and adaptive immunity, however little is known about the mechanisms that generate such alterations. Therefore, we sought for neuroimmune mechanisms that could be involved in the previously reported decreasing on neutrophil activity and alteration in the leukocyte distribution. Moreover, we analyzed the host resistance to Listeria monocytogenes after MDMA treatment. We show that MDMA (10 mg/kg), 60 min after administration: 1) decreases SAPI and PMA-induced oxidative burst and percentage/intensity of phagocytosis of circulating neutrophils; 2) decreases bone marrow cellularity while increases it in the spleen, and also decreases spleen relative weight; 3) increases neutrophil percentage while decreases lymphocyte percentage in the blood; and 4) decreases NFB expression on circulating neutrophils. Metyrapone or RU-486 prior to MDMA treatment abrogates 5) the MDMA effects previously reported on neutrophil activity; 6) alterations in the percentage of circulating neutrophils and lymphocytes, and 7) decreasing of NFB expression. We also show that 6-OHDA or ICI-118,551 prior to MDMA treatment were not able to 8) abrogated the MDMA effects previously reported on neutrophil activity and blood leukocyte differential counts; nevertheless, 9) they abrogated the previously reported alterations on bone marrow and spleen cellularity, and 10) reduction on spleen relative weight. Finally, in a model of host resistance to Listeria monocytogenes we show that MDMA: 11) induces myelosuppression by decreasing CFU on bone marrow while increasing it on spleen; 12) decreases circulating leukocytes and bone marrow cellularity; 13) increases spleen cellularity; 14) decreases pro-inflammatory cytokines production (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) and chemokine (MCP-1) after 24h of the infection; and 15) increases the production of the pro-inflammatory cytokines and chemokines previously reported after 72h of the infection. Thus, we conclude that the MDMA effects on neutrophil activity were mediated by the reduction of NFB expression, and this effect was induced by corticosterone elevation in the serum. Corticosterone is also involved in the alterations on neutrophil and lymphocyte counts. Catecholamines were shown to be involved in the alterations on leukocyte distribution in the bone marrow and spleen, and in the reduction of relative weight of spleen. Additionally, MDMA reduced the host resistance to Listeria monocytogenes. Therefore, MDMA can be considered an immunosuppressive drug and those effects are mediated by neuroimmune mechanisms

Ecstasy é o nome popular do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), uma droga de abuso utilizada por adultos jovens. Diversos relatos têm mostrado existência de correlações positivas entre o abuso do Ecstasy e o aparecimento de doenças infecciosas. Muitos estudos em modelos animais mostram que o MDMA induz alterações de imunidade inata e adquirida; entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais estes efeitos ocorrem. Desta forma, buscamos neste trabalho os mecanismos neuroimunes pelos quais o MDMA diminui a atividade de neutrófilos e altera a distribuição de leucócitos nos diferentes compartimentos imunes. Além disso, avaliamos se os efeitos induzidos pelo MDMA afetam a resposta a uma infecção experimental induzida por Listeria monocytogenes. Nossos resultados mostram que 60 minutos após a administração de MDMA na dose 10mg/kg, houve 1) diminuição do burst oxidativo de neutrófilos induzido por SAPI e PMA e, também, da porcentagem e da intensidade da fagocitose dos neutrófilos sanguíneos; 2) diminuição da celularidade total da medula óssea e aumento da mesma no baço, além de diminuição do peso relativo do baço; 3) aumento na porcentagem de neutrófilos e diminuição na porcentagem de linfócitos sanguíneos; e 4) diminuição da expressão de NFB de neutrófilos sanguíneos. O tratamento com metirapona ou RU-486 prévio ao tratamento com MDMA foi capaz de inibir 5) os efeitos observados em todos os parâmetros avaliados na diminuição da atividade de neutrófilos; 6) as alterações das porcentagens de neutrófilos e linfócitos sanguíneos e 7) a diminuição da expressão de NFB. Observamos, ainda, que o tratamento com 6-OHDA ou ICI-118,551 prévio ao tratamento com MDMA 8) não foram capazes de inibir os efeitos induzidos pelo MDMA na atividade de neutrófilos e na contagem diferencial de leucócitos sanguíneos; no entanto, 9) preveniram as alterações de celularidade induzidas por MDMA na medula óssea e no baço, e 10) a diminuição do peso relativo do baço. Por fim, observamos em um modelo de infecção experimental por LM que o MDMA 11) induziu mielosupressão (diminuição do CFU na medula óssea e aumento no baço); 12) diminuiu o número de leucócitos sanguíneos e a celularidade da medula óssea; 13) aumentou a celularidade do baço; 14) diminuiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) e quimiocina (MCP-1) nas primeiras 24 h; e 15) aumentou a produção das mesmas citocinas e quimiocina após 72 h da indução da infecção. Desta forma, concluímos que os efeitos induzidos pelo MDMA sobre a atividade de neutrófilos foram provavelmente mediados pela diminuição da expressão de NFB induzido pela ação da corticosterona e que a corticosterona, também está envolvida com as alterações na contagem diferencial de neutrófilos e linfócitos. As catecolaminas periféricas responderam pelas alterações na distribuição de leucócitos entre baço e medula óssea, e diminuição do peso relativo do baço. Além disso, o MDMA pode ser considerado uma droga imunossupressora visto que diminuiu a resistência a uma infecção por LM por mecanismos neuroimunes / Ecstasy is the popular name of 3,4-metylendioxymetamphetamine (MDMA), a drug of abuse mainly used by young adults. Several reports have shown the existence of a positive correlation between Ecstasy abuse and increased susceptibility to infectious diseases. Some studies using animal models report that MDMA induces alterations in both innate and adaptive immunity, however little is known about the mechanisms that generate such alterations. Therefore, we sought for neuroimmune mechanisms that could be involved in the previously reported decreasing on neutrophil activity and alteration in the leukocyte distribution. Moreover, we analyzed the host resistance to Listeria monocytogenes after MDMA treatment. We show that MDMA (10 mg/kg), 60 min after administration: 1) decreases SAPI and PMA-induced oxidative burst and percentage/intensity of phagocytosis of circulating neutrophils; 2) decreases bone marrow cellularity while increases it in the spleen, and also decreases spleen relative weight; 3) increases neutrophil percentage while decreases lymphocyte percentage in the blood; and 4) decreases NFB expression on circulating neutrophils. Metyrapone or RU-486 prior to MDMA treatment abrogates 5) the MDMA effects previously reported on neutrophil activity; 6) alterations in the percentage of circulating neutrophils and lymphocytes, and 7) decreasing of NFB expression. We also show that 6-OHDA or ICI-118,551 prior to MDMA treatment were not able to 8) abrogated the MDMA effects previously reported on neutrophil activity and blood leukocyte differential counts; nevertheless, 9) they abrogated the previously reported alterations on bone marrow and spleen cellularity, and 10) reduction on spleen relative weight. Finally, in a model of host resistance to Listeria monocytogenes we show that MDMA: 11) induces myelosuppression by decreasing CFU on bone marrow while increasing it on spleen; 12) decreases circulating leukocytes and bone marrow cellularity; 13) increases spleen cellularity; 14) decreases pro-inflammatory cytokines production (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) and chemokine (MCP-1) after 24h of the infection; and 15) increases the production of the pro-inflammatory cytokines and chemokines previously reported after 72h of the infection. Thus, we conclude that the MDMA effects on neutrophil activity were mediated by the reduction of NFB expression, and this effect was induced by corticosterone elevation in the serum. Corticosterone is also involved in the alterations on neutrophil and lymphocyte counts. Catecholamines were shown to be involved in the alterations on leukocyte distribution in the bone marrow and spleen, and in the reduction of relative weight of spleen. Additionally, MDMA reduced the host resistance to Listeria monocytogenes. Therefore, MDMA can be considered an immunosuppressive drug and those effects are mediated by neuroimmune mechanisms