Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--Case Western Reserve University, 2006. / [School of Medicine] Department of Pharmacology. Includes bibliographical references. Available online via OhioLINK's ETD Center.

Les capacités de guérison humaine étant limitées et grandement associées à la fibrose, la possibilité de régénérer tous tissus contribueraient grandement à l’amélioration de la santé des patients. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons publié un article montrant les limitations de certains modèles de recherche en ce qui a trait à la guérison des plaies. Ces limitations sont d’autant plus importantes lorsque la recherche traite de régénération tissulaire. Aussi, cette publication positionne l’axolotl (Ambystoma mexicanum) comme un excellent modèle pour étudier le processus de régénération épimorphique ainsi que l’importance de la signalisation TGF-β. La cytokine multifonctionnelle TGF-β est impliquée dans la guérison, l’induction des cicatrices, la différenciation, la croissance et la migration cellulaire. Cette cytokine est responsable de la guérison quasi parfaite des muqueuses buccales chez les mammifères, mais est aussi liée à la cicatrisation de plusieurs autres types tissulaires. La famille des TGF-β est aussi impliquée dans la régénération épimorphique chez l’échinoderme, ainsi que dans la régénération hépatique (hyperplasie compensatoire), ce qui confirme son rôle régulateur de la guérison parfaite. Des travaux précédents ont montré que l’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la signalisation des TGF-β (SB-431542) empêche la régénération (Lévesque et al., 2007). Comme la voie canonique de signalisation de TGF-β s’opère via les protéines Smads (Smad2 & 3), l’étude de ces deux protéines est au cœur du second article. Lors du processus de régénération, Smad2 est phosphorylé entre 6h et 48h post-amputation (pa), ce qui correspond à la phase de migration cellulaire et au début de la prolifération. D’un autre côté, Smad3 est phosphorylé plus tôt, entre 3h et 6h pa, alors que la quantité de protéine totale diminue lors de la phase de préparation. L’administration de l’inhibiteur SB-431542 au moment de l’amputation bloque l’activation de Smad2 et de Smad3. Aucun blastème ne se forme, bien que la plaie ferme normalement. L’utilisation des inhibiteurs SIS3 et Naringenin (spécifique à Smad3) réduisent la phosphorylation de Smad3 d’environ 50 % (lorsque mesurée par immunobuvardage). Le processus de régénération ne semble toutefois pas affecté. La régulation différentielle des Smads est donc centrale au processus de régénération de l’axolotl. Dans le cadre de ce projet, nous avons aussi tenté de bloquer spécifiquement l’expression, ainsi que l’activation de Smad2. J’ai premièrement établi que Smad2 et Smad3 étaient présents dans la lignée cellulaire AL-1 et qu’ils peuvent être phosphorylés. J’ai ensuite tenté, par différentes techniques, de réduire l’activation spécifique de Smad2, sans succès. D’autre part, plusieurs expériences complémentaires confirment que l’activation de Smad3 est difficilement détectable et est peu importante pour la formation du blastème. La capacité exceptionnelle de régénération de l’axolotl est intimement liée à une activation différentielle des protéines Smad2 et Smad3. L’activation de Smad2 est associée à une prolifération cellulaire importante. D’autre part, l’absence de fibrose est potentiellement due à la faible activation de Smad3 au cours du processus de régénération. / Since wound healing in human is imperfect and associated with fibrosis, understanding how regeneration works would be a great asset to improve patient’s health. During this PhD project, we have published a paper exposing the weaknesses of certain research models when studying wound healing. Those limitations are even more striking when studying regeneration. This publication sets the stage for the use of the axolotl (Ambystoma mexicanum) as an excellent model to study regeneration and the importance of TGF- for the process. The multifunctional cytokine TGF-β is involved in healing, scarring, cellular differentiation, growth and migration. This cytokine is associated with the near perfect healing of oral tissues in humans, but is also associated with scarring of multiple tissue types. TGF-β is also associated with epimorphic regeneration in echinoderm and liver hyperplasia. Previous work had shown that treatment of regenerating axolotl limbs with a specific inhibitor of TGF-β canonical signalling (SB-431542) prevents regeneration (Lévesque et al., 2007). Since canonical signaling goes through Smad2 and Smad3, those two proteins are at the center of the second publication. During limb regeneration, Smad2 is phosphorylated at 6h-48h post-amputation (pa), which corresponds to the cellular migration phase and the beginning of the proliferative phase. On the other hand, Smad3 phosphorylation happens earlier (3h-6h pa), while the total protein expression is lower. Treatment with SB-421543 blocks the phosphorylation of both Smad2 and Smad3. No blastema is formed, but the wound closes at the same rate. Treatment with other inhibitors, SIS3 or Naringenin (specifically targeting Smad3), blocks approximately 50% of Smad3 phosphorylation (as determined by western blotting), but regeneration is not affected. Differential regulation of Smads is essential for proper regeneration to occur. Lastly, we have tried multiple approaches to diminish specifically the activation of Smad2. Using the only axolotl cell line available (AL-1), we have tried inhibition with LNA molecules, long antisense and overexpression of a competitor. None of these approaches specifically reduced the levels of Smad2. In addition, other experiments confirmed that activation of Smad3 during the regeneration process is limited. The extraordinary ability to regenerate that the axolotl possesses is tightly linked to a differential activation of Smad2 and Smad3 proteins. Smad2 phosphorylation is associated with cellular proliferation and migration, hence blastema formation, while the apparent lack of Smad3 activity might partly explain why these animals do not form scar tissues.

[EN] Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is the pulmonary disease with higher incidence and worse prognosis. Recent evidence suggests that cucurbitaceae, selective inhibitors of the JAK2/STAT3 pathway, may improve the pathogenesis of IPF, as anti-inflammatory and antioxidative properties have been confirmed in other diseases. However the role in IPF is unknown. Two pharmacological models were investigated in the present study. In the preventive model, Wistar rats were instilled intratracheally with a single dose of bleomycin (BLM)(3.75 U/kg; n=12) to induce lung injury. CuI (20mg/kg/day; n=6) or CuI vehicle (control and IPF group) was administered intraperitoneally daily for 21 days. The therapeutic model was exactly the same starting CuI administration on day 7 until day 21. Animal evolution together with the ventilation-perfusion ratio was controlled through CT/SPECT imaging. Cellular count and characterization was performed in broncoalveolar lavage (BAL) together with the total protein content and the IL-6 and IL-13 concentration in BAL and lung tissue. Hematoxilin-eosin and masson trichrome stains allowed the study of the lung's tissue histology. TGF-ß1, CTGF, COL1A and ET-1 gene and protein expression were both measured by real time PCR and WB as pulmonary vascular remodeling markers. P-STAT3, P-SMAD3 and P-JAK2 proteins were determined by protein and immunohistochemistry quantification. Finally, JAK2 and STAT3 expression and distribution was studied in lung tissue of fibrotic patients with pulmonary hypertension. CT/SPECT quantification showed reduction of the fibrotic areas in the CuI treated group by reestablishing the air space in the lungs back to day 0 levels for the preventive and the therapeutic model. Furthermore, ventilation/perfusion correlation was restored in the therapeutic model after administrating CuI during 14 days. Hematoxilin-eosine stains demonstrated how the group treated pharmacologically presented an improvement in the lung tissue architecture, reversing vascular remodeling and right heart hypertrophy. Masson trichrome stain revealed a reduction of the collagen deposits. Ashcroft score, used to determine the severity of pulmonary fibrosis, was measured and diminished significantly in the CuI treated group. The results showed a gene and protein overexpression of TGF-ß1, CTGF, COL1A and ET-1 in BLM relative to Control rats. This was counteracted with CuI treatment which reduced the expression back to control. In terms of immunohistochemistry, the results demonstrated a decrease in the COL1A deposits in the treated group versus the absence of treatment group. Protein and immunohistochemistry analysis of JAK2, STAT3 and SMAD3 demonstrated an overexpression in bleomycin rats while the protein expression was inhibited in the CuI treated group. In accordance to the results obtained, the immunohistochemistry analysis of the lung parenchyma in patients with pulmonary hypertension related to pulmonary fibrosis showed and overexpression of the phosphorylated forms of JAK2 and STAT3, lacking its expression in healthy lung tissue. The preventive and therapeutic administration of JAK2/STAT3 inhibitor can be a potential treatment for pulmonary fibrosis, as it improves the parameters related to the disease. / [ES] La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es la enfermedad pulmonar con mayor incidencia y peor pronóstico. Estudios recientes sugieren que la familia de las cucurbitaceae, inhibidores selectivos de la ruta JAK2/STAT3, pueden mejorar la patogénesis de la enfermedad, al haberse confirmado sus propiedades antinflamatorias y antioxidantes en otras enfermedades. Sin embargo se desconoce su papel en FPI. En el presente trabajo se estudiaron dos modelos farmacológicos. En el modelo preventivo las ratas Wistar fueron instiladas con una dosis única de bleomicina intratraqueal (BLM)(3.75 U/kg; n=12) para inducir las lesión pulmonar. Durante 21 días se administró CuI (20mg/kg/día; n=6) o vehículo de CuI (control y grupo FPI) por vía intraperitoneal. El modelo curativo se diferencia del preventivo en el comienzo de la administración farmacológica a los 7 días de inducir la enfermedad. El seguimiento de la evolución animal y el ratio de ventilación-perfusión se realizó mediante las técnicas de imagen TC/SPECT. Se realizó el recuento y caracterización de las células totales extravasadas en lavado broncoalveolar (LBA) así como el contenido de proteína total y la concentración de IL- 6 e IL-13 en LBA y tejido pulmonar. Las tinciones de hematoxilina-eosina y masson tricrómico permitieron el estudio de la histología del tejido pulmonar. Se determinó la expresión génica y proteica de TGF-ß1, CTGF, COL1A y ET-1 mediante las técnicas de real time PCR y WB como marcadores de remodelado vascular. Las proteínas P-STAT3, P-SMAD3 y P-JAK2, fueron determinadas mediante cuantificación proteica e inmunohistoquimia. Por último se estudió la expresión y distribución de JAK2 y STAT3 en tejido de pacientes con fibrosis pulmonar e hipertensión pulmonar. La cuantificación de las imágenes TC/SPECT mostraron una reducción de las áreas fibróticas en el grupo tratado con CuI. El tratamiento farmacológico permitió el restablecimiento del espacio aéreo pulmonar hasta valores control en ambos modelos estudiados. El grupo con tratamiento farmacológico restauró el ratio de ventilación/perfusión tras administrar CuI durante 14 días. Las tinciones de hematoxilina eosina revelaron como el grupo animal tratado farmacológicamente presenta una mejora de la histología pulmonar, revirtiendo el remodelado vascular y la hipertrofia del ventrículo derecho. La tinción de masson tricrómico mostró una disminución de los depósitos de colágeno. Se determinó el valor de Ashcroft, evaluador del grado de fibrosis pulmonar, que descendió significativamente en el grupo tratado con CuI. Los resultados presentan una sobrexpresión génica y proteica de TGF-ß1, CTGF, COL1A y ET-1 en los grupos de bleomicina frente a las ratas control. Dicha condición fue revertida mediante el tratamiento con CuI que restableció los valores a niveles control. Los análisis proteicos e inmunohistoquíimicos de JAK2, STAT3 y SMAD3 revelaron una sobreexpresión en las ratas con bleomicina mientras que la expresión proteica fue inhibida en el grupo tratado con CuI. En consonancia con los resultados obtenidos, el análisis inmunohistoquímico del parénquima pulmonar de pacientes con FPI e HP asociada muestran una sobreeexpresión de las formas fosforiladas de JAK2 y STAT3 frente a la ausencia de expresión en tejido pulmonar sano. La administración curativa y preventiva de un inhibidor de la ruta JAK2/STAT3 puede ser un potencial tratamiento para la fibrosis pulmonar, ya que mejora parámetros indicativos de la patología. / [CAT] La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és la enfermetat pulmonar amb major incidència i pitjor pronostic. Estudis recents suggereixen que la família de les cucurbitàcies, Inhibidors selectius de la ruta JAK2 / STAT3, poden millorar la patogènesi de la malaltia, en haver-se confirmat les seues propietats antiinflamatòries i antioxidants En altres patologies. No obstant això es desconeix el seu paper en FPI. En el present treball es van estudiar 2 models farmacològics. En el model preventiu les rates Wistar foren instilades amb una dosi única de bleomicina intratraqueal (BLM) (3,75 U / kg; n = 12) per a induir les lesions pulmonars. Durant 21 dies es va administrar CuI (20 mg / kg / dia, n = 6) o Vehicle de CuI (control i grup FPI) per vía intraperitoneal. El model curatiu es diferència del preventiu en el començament de l'administració farmacológica als 7 dies d'induir l'enfermetat. El seguiment de l'evoluciò dels animals i el ratio de Ventilació-perfusió es va realitzar mitjançant tècniques d'imatge TC/SPECT. Es realitzà el recompte i caracterització de les cèl·lules totals extravasades en el llavat broncoalveolar (LBA). Així com el contingut de proteina total i la concentració d'IL-6 i IL-13 en LBA i teixit pulmonar. Les tincions d'hematoxilina-eosina i tricròmic de Masson van permetre l'estudi de la histologia del teixit pulmonar. Es va determinar l'expressió gènica i proteica de TGF-ß1, CTGF, COL1A i Et-1 mitjançant tècniques de PCR en temps real i WB com marcadors de remodelat vascular. Les proteïnes P-STAT3, P-SMAD3 i P-JAK2, varen ser determinades mitjançant quantificació proteica i inmunohistoquimia. Per últim se estudià l'expressió i distribució de JAK2 i STAT3 en teixit de pacients amb fibrosi pulmonar e hipertensió pulmonar. La quantificació de les imatges TC/SPECT mostraren una reducció de les àrees fibrótiques en el grup tractat amb CuI. El tractament farmacològic permet el restabliment de l'espai aeri pulmonar fins valors de control en els dos models estudiats. El grup amb tractament farmacològic va restaurar el ratio de ventilació/perfusió tras administrar Cul durant 14 dies. Les tincions d'hematoxilina eosina van revelar com el grup animal tractat farmacològicament presenta una Millora de la histologia pulmonar, revertint el remodelat vascular i la hipertròfia del ventricle dret. La tinció de tricròmic de Masson va mostrar una disminució dels dipòsits de col·lagen. Es va determinar el valor d'Ashcroft, avaluador del grau de fibrosi pulmonar, que va baixar significativament a el grup tractat amb CuI. Els resultats presenten una sobreexpressió gènica i proteica de TGF-ß1, CTGF, COL1A i Et-1 en els grups de bleomicina en comparacióa les rates control. Aquesta condició va ser revertida mitjançant el tractament amb CuI que va restablir els valors fins a nivel dels control. A nivell immunohistoquímic els resultats mostren una disminució dels dipòsits de COL1A en el grup tractat comparativament al grup sense tractament. Els anàlisi proteics i inmunohistoquíimics de JAK2, STAT3 i SMAD3 van revelar una sobreexpressió en les rates amb bleomicina mentre que l'expressió proteica va ser inhibida en el grup tractat amb CuI. D'acord amb els resultats obtinguts, l'anàlisi immunohistoquímic del parènquima pulmonar de pacients amb FPI i HP associada mostren sobreeexpresió de les formes fosforilades de JAK2 i STAT3 davant l'absència d'expressió en teixit pulmonar sa. La administració curativa i preventiva d'un inhibidor de la ruta JAK2 / STAT3 pot ser un potencial tractament per la fibrosi pulmonar, ja que millora paràmetres indicatius de la patologia. / Hernández Ribes, G. (2016). ESTUDIO DE LA RUTA CELULAR JAK2/STAT3 COMO POTENCIAL INHIBIDOR EN EL MODELO DE FIBROSIS PULMONAR [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/64087 / TESIS

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Este estudo in vitro teve como objetivo avaliar os efeitos moleculares do TGF-β1, com diferentes períodos de suplementação, sobre a formação do fenótipo osteogênico das células MC3T3-E1, comparando-os com células tratadas com AA+β-GP suplementados com Dex e/ou TGF-β1, sem e com a neutralização dos receptores de TGF-β1. A expressão gênica do próprio TGF-β1 e Smad3 foram analisadas, bem como, a diferenciação das células osteogênicas e a biomineralização. As células tratadas com TGF-β1 sem neutralização de receptores apresentam efeito inibitório nos estágios mais avançados da diferenciação dos osteoblastos e da biomineralização in vitro, mas expressarem alguns marcadores importantes envolvidos na mineralização. Observaram-se nódulos de mineral em todos os tratamentos das células que tiveram os receptores de TGF-β1 neutralizados, mas houve uma diminuição na expressão de alguns genes. Os resultados confirmam a complexidade da via de sinalização do TGF-β1, mostrando que existem lacunas para que seja entendido o mecanismo dessa molécula na biologia osteoblástica. / This in vitro study aimed to evaluate the molecular effects of TGF-β1, with different supplementation time periods on the establishment of MC3T3-E1 cells, comparing with cells treated with AA+β-GP supplemented with Dex and/or TGF-β1, without or with neutralization of TGF-β1 receptors. The gene expression of the TGF-β1 and Smad3 were analyzed, as well as the osteoblast differentiation and biomineralization. The cells treated with TGF-β1 without neutralization of receptors have had inhibitory effect on some important stages of osteoblast differentiation and biomineralization in vitro, but expressed some important mineralization markers. Mineral nodules were observed in all treatments of cells with their TGF-β1 receptors neutralized, but there was a decrease in the expression of some important genes. The results confirm the complexity of the pathway signaling of TGF-β1, showing that there are gaps for understand the mechanisms of this molecule in the biology of osteoblasts.

Este estudo in vitro teve como objetivo avaliar os efeitos moleculares do TGF-β1, com diferentes períodos de suplementação, sobre a formação do fenótipo osteogênico das células MC3T3-E1, comparando-os com células tratadas com AA+β-GP suplementados com Dex e/ou TGF-β1, sem e com a neutralização dos receptores de TGF-β1. A expressão gênica do próprio TGF-β1 e Smad3 foram analisadas, bem como, a diferenciação das células osteogênicas e a biomineralização. As células tratadas com TGF-β1 sem neutralização de receptores apresentam efeito inibitório nos estágios mais avançados da diferenciação dos osteoblastos e da biomineralização in vitro, mas expressarem alguns marcadores importantes envolvidos na mineralização. Observaram-se nódulos de mineral em todos os tratamentos das células que tiveram os receptores de TGF-β1 neutralizados, mas houve uma diminuição na expressão de alguns genes. Os resultados confirmam a complexidade da via de sinalização do TGF-β1, mostrando que existem lacunas para que seja entendido o mecanismo dessa molécula na biologia osteoblástica. / This in vitro study aimed to evaluate the molecular effects of TGF-β1, with different supplementation time periods on the establishment of MC3T3-E1 cells, comparing with cells treated with AA+β-GP supplemented with Dex and/or TGF-β1, without or with neutralization of TGF-β1 receptors. The gene expression of the TGF-β1 and Smad3 were analyzed, as well as the osteoblast differentiation and biomineralization. The cells treated with TGF-β1 without neutralization of receptors have had inhibitory effect on some important stages of osteoblast differentiation and biomineralization in vitro, but expressed some important mineralization markers. Mineral nodules were observed in all treatments of cells with their TGF-β1 receptors neutralized, but there was a decrease in the expression of some important genes. The results confirm the complexity of the pathway signaling of TGF-β1, showing that there are gaps for understand the mechanisms of this molecule in the biology of osteoblasts.

Même si le docking protéine-protéine devient un outil incontournable pour répondre aux problématiques biologiques actuelles, il reste cependant deux difficultés inhérentes aux méthodes actuelles: 1) la majorité de ces méthodes ne considère pas les possibles déformations internes des protéines durant leur association. 2) Il n'est pas toujours simple de traduire les informations issues de la littérature ou d'expérimentations en contraintes intégrables aux programmes de docking. Nous avons donc tenté de développer une approche permettant d'améliorer les programmes de docking existants. Pour cela nous nous sommes inspirés des méthodologies mises en place sur des cas concrets traités durant cette thèse. D'abord, à travers la création du complexe ERBIN PDZ/Smad3 MH2, nous avons pu tester l'utilité de la Dynamique Moléculaire en Solvant Explicite (DMSE) pour mettre en évidence des résidus importants pour l'interaction. Puis, nous avons étendu cette recherche en utilisant divers serveurs de docking puis la DMSE pour cibler un résultat consensus. Enfin, nous avons essayé le raffinage par DMSE sur une cible du challenge CAPRI et comparé les résultats avec des simulations courtes de Monte-Carlo. La dernière partie de cette thèse portait sur le développement d'un nouvel outil de visualisation de la surface moléculaire. Ce programme, nommé MetaMol, permet de visualiser un nouveau type de surface moléculaire: la Skin Surface Moléculaire. La distribution des calculs à la fois sur le processeur de l'ordinateur (CPU) et sur ceux de la carte graphique (GPU) entraine une diminution des temps de calcul autorisant la visualisation, en temps réel, des déformations de la surface moléculaire.