O objetivo desse projeto foi o de produzir sílica mesoporosa ordenada (SMO) do tipo SBA-15 com fósforos. A incorporação dos fósforos às paredes da sílica foi realizada através de um único processo de síntese. Os métodos experimentais utilizados para caracterização das amostras foram: RBS (Rutherford Backscattering Spectrometry) para a análise química, SAXS (Small Angle X Ray Scattering), XRD (X Ray Diffraction) e NAI (Nitrogen Adsorption Isotherms) para a análise estrutural destes materiais, além da fotoluminescência. Para a caraterização morfológica complementar das amostras, foi utilizado o SEM (Scanning Electron Microscopy). A incorporação de Eu na matriz de sílica preserva a estrutura de poros ordenada. Os resultados de XRD mostraram a formação de óxidos de európio. A partir dos resultados obtidos observaram-se diferentes efeitos da presença e ausência de sobrenadante durante o período de secagem nas amostras preparadas, como por exemplo, alterações de morfologia. As amostras preparadas com sobrenadante apresentaram menor área superficial e volume de poros. Materiais que mantiveram o sobrenadante apresentaram maior conteúdo de Eu e maior intensidade de luminescência. / The aim of this project was to synthesize ordered mesoporous silica (OMS) with phosphorus. The incorporation of phosphorus to the silica walls was performed by means of a one pot synthesis process. The experimental methods used to characterize the samples were: RBS (Rutherford Backscattering Spectrometry) for chemical analysis, SAXS (Small Angle X Ray Scattering), XRD (X Ray Diffraction) and NAI (Nitrogen Adsorption Isotherms) for structural analysis, besides fluorescence. SEM (Scanning Electron Microscopy) was used for complementary morphological characterization of the samples. The Eu incorporation in the silica matrix preserves the ordered mesoporous structure. The XRD results showed the presence of europium oxides. The presence and absence of the liquid solution during the drying process caused the formation of samples with different properties, as, for example, modification in morphology. Samples prepared in the presence of the liquid solutions showed smaller surface area and pore volume. Materials prepared with the liquid solution during the drying process presented larger Eu content and higher photoluminescence intensity.

A proteína tirosina fosfatase eta de rato (rPTPeta), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP eta e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP eta pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTPeta (rPTPetaDC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTPeta . Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A His6-rPTPetaDC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/microg a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTPetaDC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTPetaDC mostrou-se estável a 18 graus Celsius e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87Å. Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(1)2(1)2(1) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Å, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTPetaDC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com Rg de 2,65nm e Dmax de 8,5nm. A conformação da rPTPetaDC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTPalfa-D1. Alem disso, a caracterização da rPTPetaDC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o Kd do dímero da rPTPetaDC é de 21,6 + 2,0uM e a variação da energia livre de Gibbs dímero-monômero é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C ). / The rat protein tyrosine phosphatase eta, rPTPeta, is a transmembrane RPTP, with an intracellular portion composed of a unique catalytic region. The rPTPeta and the human homolog DEP-1 are down-regulated in rat and human neoplastic cells, respectively. However, the malignant phenotype is reverted after exogenous reconstitution of rPTPeta, suggesting that its function restoration could be an important tool for gene therapy of several types of cancer. Therefore, the objective of our project aimed on the molecular, biophysical and structural study of the catalytic domain of rPTPeta, rPTPetaDC. We began our study cloning the rPTPetaDC into PET28a(+) vector, followed by its expression in Escherichia coli, and purification. The His6-tag from the rPTPetaDC purified was subsequently removed by thrombin digestion. PhastGel IEF electrophoresis demonstrated that the isoelectric point of the 41kDa was 7.3. To assess the functionality of the rPTPetaDC we used the pNPP hydrolysis assay and observed that the enzyme has a specific activity of 9nmol/min/ug. The experimentally determined rPTPetaDC specific activity showed to be in the same range as the previously reported activities for RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 and SHP2. The secondary structure and stability of the recombinant protein was analyzed by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The results demonstrated that rPTPetaDC was stable at 18 Celsius and properly folded (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. In attachment A). Then, the purified protein was submitted to different crystallization conditions and structural studies in solution. Crystals appeared at 0.1M MES, pH 6.5 and 20% PEG 10,000 and diffracted with resolution of 1.87Å. The crystals belong to spatial group P2(1)2(1)2(1) with unit cell parameters of a=46.46, b=63.07, c=111.64Å and contained one molecule for asymmetric unit (Matozo, et al., Acta crystallog. F, 2006. In attachment B). Also, the structural of rPTPetaDC, in solution, was analyzed by SAXS and fluorescence anisotropy. SAXS data showed that the protein forms elongated dimers in solution with an Rg of 2.65nm and a Dmax of 8.5nm. The rPTPetaDC conformation in solution, studied by homology models, suggested that the rPTPetaDC dimer architecture is more closely related to the crystal structure of RPTPalfa-D1. The characterization of rPTPetaDC by fluorescence anisotropy measurements demonstrated that the Kd of the dimer is 21.6 + 2.0uM and the energy Gibbs dimer-monomer is equal to 7.2kcal/mol (Matozo, et al., Bioph. J., 2007. In attachment C).

Orientador: Watson Loh / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T12:25:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Padula_Lilian_M.pdf: 1356647 bytes, checksum: f598e703185d3612f096dbc7d319e2d8 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Polieletrólitos e surfatantes de carga oposta associam-se fortemente, levando à formação de fases líquido cristalinas com estruturas supramoleculares. A geometria da fase líquido cristalina depende de parâmetros tais como: concentração, razão molar (surfatante/ monômero), características do polímero, presença de aditivos e cossolventes. O objetivo desse trabalho é estudar o equilíbrio de fases e mudanças estruturais das fases líquido cristalinas em sistemas binários contendo complexo polietilenoimina-dodecilsulfato - (PEI-DS) e água, observando assim, a dependência das fases em relação às variáveis tais como razão molar surfatante/ monômero, massa molar e estrutura do polímero (ramificado ou linear) e quantidade de água. Os complexos apresentaram diferenças de comportamento quando utilizados polímeros de diferentes massas molares. O polímero de maior massa molar (2000 'g.mol POT. -1') apresentou apenas estruturas lamelares, já o polímero de menor massa molar (423 'g.mol POT. -1') apresentou estruturas lamelares e hexagonais. Depois de estudados os efeitos das diferentes características do polímero sobre o sistema binário composto por complexo e água, foi escolhido um determinado complexo cuja razão molar 'N IND. SURFATANTE'/ 'N IND. MONÔMERO' é 0,75. Este foi estudado na presença de água e um cossolvente. Os cossolventes escolhidos foram decanol e p-xileno, para ambos os sistemas houve predominância de fase hexagonal. De maneira geral, a troca do contra-íon simples, Na+, pelo contra-íon polimérico, PEI, provocou diferenças no comportamento das mesofases tanto na geometria quanto nas dimensões estruturais, tanto para os sistemas binários quanto para os sistemas ternários / Abstract: Polyelectrolytes associate strongly with oppositely charged surfactants in water, being able to generate liquid crystalline phases with interesting supramolecular structures. The geometry of the liquid crystalline phase depends on parameters such as: concentration, surfactant/monomer ratio, polymer characteristics and presence of cosolvents. The objective of this work is to study the phase equilibria and the structural changes of liquid crystalline phases in binary systems which contain a complex polyethyleneimine dodecylsulfate - (PEI-DS) and water, analyzing the dependence of these phases on variables such as surfactant/monomer ratio, polymer molar mass and structure (branched or linear) and water content. Different polymers led to different phase behavior. While complex with PEI 2000 'g.mol POT. -1' formed only lamellar phases the PEI 423 'g.mol POT. -1' formed lamellar and hexagonal ones. The complex formed with surfactant/ monomer ratio of 0.75 was studied in the presence of water and cosolvents. The cosolvents were decanol and p-xylene and for both systems the hexagonal phase predominate. The counterion exchange from simple, Na+, to polymeric, PEI, produced differences on mesophases geometry and structural dimensions, both in binary and ternary systems / Mestrado / Físico-Química / Mestre em Química

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Micelles are thermodynamically stable systems, formed after reaching a minimum concentration of surfactant in the solution, and is called the critical micellar concentration (CMC). The tensoactives are amphiphilic substances, that is, they have a polar region (head) and another apolar (tail) well defined in the molecular structure, being the tensoactive tween 80 chosen for this work. The CMC of this surfactant was found by ultraviolet-visible spectroscopy, through the absorption of a probe molecule that was ibuprofen at work. The CMC value is between 1.10-4 and 2.10-4 mM. Micelles have a great potential in the solubilization of poorly soluble drugs in aqueous solution that are being reused for different purposes than the current ones, besides taking drugs that have previously been abandoned due to their lack of solubility, for example in blood plasma, with we can increase the bioavailability of the same in the body, and can function as nanoreservatories of drugs thus minimizing the side effects of these, and help in the correct direction in which these drugs are discharged. Given this relevance, this work aims to understand how and where the interaction of the tween-80 formed micelles with the drugs, varying the pH and the concentrations of these. The drugs used in this study were carisoprodol, ibuprofen and sodium ibuprofen, since they have different characteristics in relation to the molecular polarity distribution. The technique used to perform these analyzes was the low angle X-ray scattering (SAXS), through which it is possible to analyze changes of shapes and sizes of the nanometric order. From the experimental observations, it was possible to say that for more effective interaction between the micelles and the drugs, it is necessary that they have a well defined and expressive apolar region, in terms of volume, in some region of the molecule, since the carisoprodol did not alter the SAXS curves of the micelles when it was present in the solution. Ibuprofen and sodium ibuprofen were able to cause significant changes in the SAXS curves, either in terms of low or high angle displacement or effects of attractive or repulsive interferences on the micelles. The modeling of the SAXS curves revealed the geometries acquired by the micelles, which at pH 4 and pH 7 alternated between a core and a cylindrical shell with an elliptical or circular cross-section depending on the drug or its concentration and at pH 9, The only cross section presented was elliptical geometry. The internal cylinder size of pH 4 micelles without drug was 33.9 Å, increasing to 43.4 Å with 30 mM ibuprofen and 53.7 Å with 30 mM ibuprofen sodium. At pH 7 and 9, there was little change in these lengths. A theoretical study was also carried out to better understand the micelle-drug interaction and, for this, the atomic charges, the polar and polar light, and the optimization of the structures of the substances used in this work were obtained. Tween 80 was optimized by the semi-empirical method PM3 (Parametric Method Number 3), while both carisoprodol and ibuprofen were optimized by the ab initio DFT (Density Functional Theory) method. / As micelas são sistemas termodinamicamente estáveis, formadas após atingirem uma concentração mínima de tensoativo na solução, que é chamada de concentração micelar crítica (CMC). Já os tensoativos são substâncias anfifílicas, ou seja, possuem uma região polar (cabeça) e outra apolar (cauda) bem definidas na estrutura molecular, sendo o tween 80 o tensoativo escolhido para este trabalho. A CMC deste tensoativo foi encontrada por meio da espectroscopia no ultravioleta-visível, por meio da absorbância de uma molécula sonda que, neste trabalho, foi o ibuprofeno. O valor da CMC está entre 1.10-4 e 2.10-4 mM. As micelas apresentam um grande potencial na solubilização de fármacos pouco solúveis em solução aquosa que estão sendo reutilizados para diversos fins, diferentes dos atuais, além de aproveitar drogas que anteriormente foram abandonadas devido a sua falta de solubilidade, por exemplo, no plasma sanguíneo, com isso, conseguem aumentar a biodisponibilidade dos mesmos no organismo, podendo funcionar como nanoreservatórios de fármacos minimizando, desse modo, os efeitos colaterais destes, além de ajudar no direcionamento correto em que essas drogas deverão ser descarregadas. Diante de tal relevância, este trabalho propõe-se a entender como e onde ocorre a interação das micelas formadas por tween 80 com os fármacos, variando o pH e as concentrações destes. Os fármacos utilizados neste trabalho foram o carisoprodol, o ibuprofeno e o ibuprofeno sódico, uma vez que apresentam características distintas em relação à distribuição de polaridade molecular. A técnica utilizada para realizar essas análises foi a de espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS), por meio da qual é possível analisar mudanças de formas e tamanhos da ordem nanométrica. A partir das observações experimentais, foi possível dizer que para ocorrer interação mais efetiva entre as micelas e os fármacos é necessário que estes tenham uma região apolar bem definida e expressiva, em termos de volume, em alguma região da molécula, tendo em vista que o carisoprodol não alterou as curvas de SAXS das micelas, quando estava presente na solução. Já o ibuprofeno e o ibuprofeno sódico conseguiram causar mudanças significativas nas curvas de SAXS, seja em termos de deslocamento para baixo ou alto ângulo ou efeitos de interferências atrativas ou repulsivas nas micelas. O modelamento das curvas de SAXS revelou as geometrias adquiridas pelas micelas, que em pH 4 e pH 7 alternava-se entre um núcleo e uma casca cilíndrica com seção transversal elíptica ou circular a depender do fármaco ou de sua concentração e em pH 9, a única seção transversal apresentada foi a geometria elíptica. O tamanho do cilindro interno das micelas em pH 4 sem fármaco foi de 33,9 Å, passando para 43,4 Å com 30 mM de ibuprofeno e 53,7 Å com 30 mM de ibuprofeno sódico. Já em pH 7 e 9 houve pouca alteração nesses comprimentos. Foi feito também um estudo teórico para melhor compreender a interação micela-fármaco e, para isso, foram obtidos as cargas atômicas, o raio apolar e polar, além da otimização das estruturas das substâncias utilizadas neste trabalho. O tween 80 foi otimizado pelo método semi-empírico PM3 (Parametric Method Number 3), ao passo que tanto o carisoprodol quanto o ibuprofeno foram otimizados pelo método ab initio DFT (Teoria do Funcional de Densidade). / São Cristóvão, SE

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Ricardo Aparício / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pelloso_AlexandreCesar_M.pdf: 8109350 bytes, checksum: fc162ef3c04f105331de4e0c0bb979f3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Após o sequenciamento do genoma da Xylella fastidiosa, linhagem 9a5c houve um grande aumento de informações relacionadas a este organismo. Porém grande parte das proteínas desta bactéria ainda não apresentam funções preditas. No presente estudo, objetivou-se a caracterização inicial de três proteínas deste micro-organismo, a saber: XfCysB (orf Xf0683), XfLysRL (orf Xf1448) e XfycjZ (orf Xf1480). Essas proteínas apresentam alta similaridade com membros da família de reguladores transcricionais do tipo LysR (LTTR). Os LTTR constituem a família de reguladores mais comuns em procariotos e apresentam funções diversas tais como regulação de genes envolvidos no metabolismo, divisão celular, quorum sense, virulência, resposta ao estresse oxidativo, entre outras. Dentre as proteínas em estudo, a única proteína que possui predição dentro da família LysR é a XfCysB, cujas proteínas homólogas, já caracterizadas, estão envolvidas na regulação do operon cys, o qual está envolvido na biossíntese de cisteína. Após a clonagem das proteínas, a caracterização estrutural foi feita por Cromatografia de Exclusão por Peso Molecular, em que foi possível observar o estado oligomérico da proteína; Dicroísmo Circular para verificar se a proteína apresenta estrutura secundária estruturada e SAXS (Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos) ,apenas para a proteína XfLysRL, para a determinação do envelope da proteína em solução. A caracterização funcional foi feita pela análise da expressão das proteínas durante as diferentes fases de formação do biofilme (5, 10, 15, 20 e 30 dias de crescimento) de X. fastidiosa por Western blot utilizando anticorpos específicos para cada proteína em estudo. Com os resultados obtidos pode-se estimar que a massa molecular da proteína XfLysRL é de 50 kDa quando em solução, indicando que a XfLysRL encontra-se na forma dimérica, uma vez que a massa molecular do monômero é de 23,7 kDa. Possui também a estrutura secundária estruturada, sendo estável de 4°C a 44 ° C. Foi possível verificar também que a proteína está monodispersa quando em solução, é estruturalmente globular e pôde-se produzir, com os dados obtidos, um primeiro modelo para a estrutura da proteína. Já a proteína XfCysB teve a sua massa estimada em 45,3 kDa quando em solução e de 195,1 kDa quando na presença do seu co-indutor específico, além de apresentar uma estrutura secundária estruturada. Em relação à proteína XfycjZ pôde-se observar que esta quando em solução possui uma massa molecular estimada em 174,8 kDa demonstrando que sua forma oligomérica é de tetrâmero. Os estudos funcionais indicam que as três proteínas são expressas durante a formação do biofilme de X. fastidiosa, ou seja, estão presentes nos 6 tempos analisados. Deste modo, o estudo detalhado das presentes proteínas torna-se importante devido a sua presença na formação do biofilme de X. fastidiosa, um dos mecanismos de patogenicidade da bactéria. Outro fator importante é a utilização dos resultados da caracterização estrutural na elucidação do papel desempenhado pelas proteínas, visto que a estrutura protéica está diretamente envolvida com sua função / Abstract: After sequencing the genome of Xylella fastidiosa, strain 9a5c, there was a large increase in information related to this organism, but most of the proteins produced by these bacteria do not have predicted functions. In this study, the objective was the initial characterization of three proteins of this organism, namely XfCysB (orf Xf0683) XfLysRL (orf Xf1448) and XfycjZ (orf Xf1480). These proteins show high similarity to members of the family of LysR-type transcriptional regulators (LTTR). The LTTR family of regulators is the most common in prokaryotes and has diverse functions such as regulation of genes involved in metabolism, cell division, quorum sense, virulence, oxidative stress response, among others. Among the proteins under study, the only protein that has more specific prediction of classification within the family is the LysR XfCysB, which already characterized homologous proteins are involved in the regulation of cys operon, which is involved in the biosynthesis of cysteine. After cloning the protein, structural characterization was performed using the techniques of Exclusion Chromatography for Molecular Weight that shows the oligomeric state of the protein; circular dichroism to determine if protein has folded and stable secondary structure and SAXS (X-Ray Scattering at Small Angle) for the determination of protein structure in solution. Functional characterization was performed by analyzing the expression of proteins during different stages of biofilm formation (5, 10, 15, 20 and 30 days of growth) of X. fastidiosa by producing antibodies specific for each protein under study and performance of Western blot using total protein extract of the antibody produced against biofilm. With results obtained it was possible to estimate that the molecular weight of protein was 50 kDa XfLysRL in solution, indicating that the XfLysRL is in dimeric form, since the molecular weight of the monomer is 23.7 kDa. It also has a stable secondary structure folded and supporting a rise in temperature to 44° C. It was also verified that the protein is monodisperse in solution, is structurally globular and could be produced, with the data obtained, a first model for the structure of the protein. The protein XfCysB had its mass estimated at 45.3 kDa in solution and 195.1 kDa in the presence of its coinducer specific, besides presents a folded secondary structure. Regarding the protein XfycjZ was observed that when this solution has a molecular mass of 174.8 kDa demonstrating that it's oligomeric form is a tetramer. Functional studies indicate that the three proteins were expressed during the biofilm formation of X. fastidiosa, follows that they are present in 6 times analyzed. Thus, the detailed study of these proteins is important because their presence in biofilm formation of X. fastidiosa, one of the mechanisms of pathogenicity of the bacteria. Another important factor is the use of results in the structural elucidation of the role of proteins because the protein structure is directly involved in its function / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Iris Concepción Linares de Torriani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-15T22:30:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JulioCesarda_D.pdf: 7791031 bytes, checksum: 5711654f743b7d6fb045861e9239ad8c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As técnicas de caracterização estrutural de macromoléculas tradicionais se baseiam no fato de uma macromolécula possuir uma conformação compacta e estruturada. Partes flexíveis ou regiões desordenadas têm sido sempre consideradas como grandes obstáculos para técnicas como a cristalografia de raios-X e a ressonância magnética nuclear (RMN). A necessidade de entender a atividade funcional de proteínas nativamente desenoveladas e de proteínas flexíveis com múltiplos domínios tem adquirido grande importância recentemente, mesmo porque essas proteínas desafiam o paradigma de que uma proteína precisa de uma estrutura bem definida para ser funcional. É bem nesse ponto que a técnica de espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) surge oferecendo ferramentas únicas para realizar estudos de macromoléculas flexíveis ou parcialmente desestruturadas, com aplicações muito bem sucedidas em polímeros, matéria mole e macromoléculas em solução. Neste trabalho de tese decidimos enfrentar o desafio de caracterizar proteínas que não possuem uma estrutura bem definida. A teoria do espalhamento mereceu especial cuidado para se adequar tanto aos métodos experimentais da técnica quanto aos tratamentos matemáticos em cálculos usados para estudar esse tipo de proteínas. Apresentamos aqui o estudo de duas proteínas pertencentes à classe das proteínas nativamente desenoveladas: (1) a proteína FEZ1, que é necessária para o crescimento de axônios; (2) a proteína Ki-1/57, que é encontrada em diversas células com câncer principalmente em tumores do sistema linfático. Estudamos também algumas proteínas com múltiplos domínios conectados por regiões flexíveis e que são: (1) duas chaperonas da classe das HSP40 (proteínas Sis1 e Ydj1) juntamente com construções onde alguns domínios dessas proteínas foram cortados; (2) a proteína ribonucléica heterogênea hnRNP-Q que está envolvida em importantes funções do RNA. Experiências de SAXS foram realizadas, fornecendo parâmetros dimensionais e informações de forma dessas proteínas em solução. Modelos de baixa resolução das possíveis conformações foram calculados a partir das curvas de SAXS usando métodos de modelagem ab initio combinados com modelagem de corpos rígidos. Os resultados forneceram informações importantes para elucidar as funções biológicas dessas proteínas. É importante ressaltar que, para realizar os estudos com proteínas em solução, é necessário contar com uma instrumentação adequada e devidamente montada para a aplicação da técnica de SAXS. Para isso, durante o período de desenvolvimento deste doutorado houve um grande investimento na montagem, teste e caracterização de instrumentos, junto à equipe de profissionais do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), completando o comissionamento da estação experimental SAXS2 do LNLS / Abstract: The traditional techniques for structural characterization of macromolecules are based on a compact and structured conformation of the macromolecule. Flexible or disordered regions have usually been regarded as a great hindrance to techniques like X-ray protein crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR). The need to study functional activity of natively unfolded proteins and flexible multidomain proteins came to the light rather recently, defying the classical structure¿function paradigm where a protein must have a well-defined 3-D structure to be functional. In this type of situation, the small-angle X-ray scattering (SAXS) technique appears as a unique tool to deal with this problem. Indeed, the application of SAXS methods to the characterization of soft matter (e.g. polymers) and macromolecules in solution has already succeeded during the last years. In this work we decided to face the challenge of characterizing proteins that do not have a well defined structure. The SAXS experimental technique as well as the mathematical methods and calculations needed special attention in order to be correctly applied to study the specific problem of unstructured proteins in solution. Thus, it was possible to find evidence of the structural details of these proteins and obtain a low resolution 3-D average structure. Here we present the study of two proteins that belong to the group of natively unfolded proteins: (1) The FEZ1 protein, which is necessary for axon growth, and (2) the proteins indentified as Ki-1/57, which is found in diverse cancer cells mainly in lymphatic systems tumors. We also studied some flexible multidomain proteins: (1) two chaperones from the groups of HSP40 (the proteínas Sis1 e Ydj1), and two mutant constructions where some domains were deleted; (2) the heterogeneous ribonucleoprotein hnRNP-Q which is related to an array of important functions of RNA. Several SAXS experiments were performed providing overall parameters and important shape information about those proteins in solution. Low resolution models for the possible conformations of these proteins were restored from the SAXS curves using ab initio modeling methods combined with rigid body modeling. The SAXS results provided a unique structural background for the biologists to deal with the function of these proteins. SAXS experiments with proteins in solution demand the use of a specific instrumentation properly developed for those studies. So, it is important to mention that, throughout the duration of this doctorate, specific instrumentation development and testing was done together with the technical staff of the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS, Campinas, SP, Brazil), collaborating with the commissioning of the new SAXS2 workstation, completed in 2008 / Doutorado / Física / Doutor em Ciências

Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo. / In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.

Orientadores: Ricardo Aparicio, Marcelo Menossi Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Esstadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-12T12:36:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kiyota_Eduardo_M.pdf: 3864663 bytes, checksum: fb929727fccb0492142f162a1eca404e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os fatores de transcrição do tipo bZIP estão presentes em organismos eucariotos e estão envolvidos na regulação da expressão gênica e no controle de muitos processos intracelulares. Esses fatores se ligam a seqüências específicas no DNA e são capazes de reconhecer seqüências reguladoras no promotor de um gene. As bZIPs são caracterizadas por uma região conservada rica em resíduos de aminoácidos básicos, e um zíper de leucinas, que possui repetições de uma seqüência de aminoácidos hidrofóbicos onde há uma leucina que ocupa a mesma posição a cada 7 resíduos. Estudos estruturais com bZIPs mostraram que essas proteinas enovelam-se na forma de uma extensa hélice-a e são capazes de formar dímeros através de um arranjo do tipo coiled- coil. Neste trabalho, a parte correspondente à região básica e ao zíper de leucinas de duas bZIPs, SCF5 e SCF12 de cana-de-açúcar, pertencentes a sub-famílias diferentes, foram clonadas, expressas e purificadas para estudos estruturais. O DNA correspondente a SCF12 foi clonado em pET28a e a proteína recombinante foi produzida em E. coli BL21 (DE3) pRil. A SCF12 purificada por cromatografia de afinidade (IMAC) teve sua estrutura secundária caracterizada por dicroísmo circular. A SCF5, clonada em pET3C e expressa em E. coli BL21 (DE3) pLysS foi purificada por cromatografia de troca catiônica. Cristais de um complexo da proteína ligada a uma seqüência de DNA de 24 pares de bases foram obtidos mas não exibiram qualidade suficiente para permitir a determinação da estrutura cristalográfica. Entretanto, foi possível obter um modelo do complexo a partir de experimentos de espalhamento de Raios X a baixos ângulos (SAXS, do inglês Small Angle X-Ray Scattering) em solução, e interpreta-lo à luz de estruturas de homólogas já conhecidas. / Abstract: The bZIP transcription factors are present in eukaryotic organisms and are involved in the regulation of gene expression and many intracellular processes. These factors bind specific DNA sequences and are able to recognize regulatory sequences of a gene promoter. The bZIPs are characterized by a conserved region rich in basic amino acid residues as well as by having the leucine zipper region, which possess a sequence of hydrophobic residues where there are leucines every seventh amino acids. Structural studies have shown that bZIP-folding is alpha-helical and these proteins are capable of dimmer formation via coiled-coil arrangement. In this work, the basic region and the leucine zipper of two sugarcane bZIPs, SCF12 and SCF5, belonged to two different bZIP-families were cloned, expressed and purified for structural studies. The corresponding SCF12 DNA was cloned into pET28a expression vector and the protein was produced in E. coli BL21 (DE3) pRil cells. SCF12 protein was purified by affinity chromatography (IMAC) and had its secondary structure characterized by CD. SCF5, cloned into pET3c and expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS was purified by cation exchange chromatography. Crystals of a complex formed by SCF5 protein and a 24-base-pair DNA sequence were obtained but unfortunately with quality insufficient for crystallographic structure determination. However, it was possible to obtain a model of the analyzed complex applying Small Angle X-ray Scattering (SAXS) technique by protein homologous structure comparison. / Mestrado / Físico-Química / Mestre em Química

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T07:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fattori_Juliana_D.pdf: 11382370 bytes, checksum: c763644c24af47a0076a054c0186f7b1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente estudo teve por objetivo a caracterização estrutural de quatro possíveis chaperonas de secreção da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Esta caracterização é importante para entender as funções destas proteínas e consequentemente compreender os mecanismos de virulência da Xac que é a causadora do cancro cítrico. Das quatro proteínas estudadas, a XACb0033 é considerada uma possível chaperona de secreção do sistema de secreção do tipo IV; a XAC1346 são possíveis chaperonas de secreção do sistema de secreção do tipo III e a XAC1990, foi identificada em 2007 como uma proteína do sistema flagelar (FlgN). As quatro proteínas, clonadas em pET23a, foram expressas em E. coli, purificadas e obtidas enoveladas conforme as análises de dicroísmo circular (CD). Por CD também se observou um alto conteúdo helicoidal na estrutura secundária das proteínas. Elas foram caracterizadas por filtração em gel analítica, espectrometria de massas, técnicas de difusão de ressonância magnética nuclear (DOSY-NMR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Por SAXS obteve-se um modelo do envelope molecular de duas proteínas que foi condizente com a estrutura tridimensional obtida por bioinformática. Baseando-se nos resultados obtidos foi possível especular a classificação da XAC0419 como provável chaperona secretória da classe I e a FlgN (XAC1990) foi classificada como uma chaperona flagelar (classe III); e para a XACb0033 observou-se similaridade estrutural com a VirE1, que é a única chaperona secretória do sistema de secreção do tipo IV conhecida até o momento / Abstract: The aim of this study was the structural characterization of four possible secretion chaperones from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). This characterization is very important to better understand the function of such proteins and the virulence mechanisms from Xac, which is the bacterium responsible for provoking the citrus canker. Among the target proteins, XACb0033 is a possible secretion chaperone from type IV secretion system, XAC0419 and XAC1346 are possible secretion chaperones from type III secretion system and XAC1990 was earlier identified as a flagellar protein (FlgN). All four target proteins, cloned into pET23a, were expressed in E. coli, purified and found folded as observed in the circular dichroism analyses (CD). It was also verified (CD experiments) that these proteins have a high helical content. These proteins were further characterized by analytical gel filtration, mass spectrometry (MS), diffusion techniques in nuclear magnetic resonance (DOSY-NMR) and small angle X-ray scattering (SAXS). Molecular envelops were built for two target proteins applying the SAXS data. These envelops were in good agreement with the 3D structures predicted by bioinformatics. Finally, XAC0419 was considered a possible class I secretion chaperone based on the obteined results. XAC1990 (FlgN) was confirmed as a flagellar chaperone (class III), while obtained results for XACb0033 pointed structural similarity with VirE1, the unique type IV secretion system chaperone known so far / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Abstract Lipids are necessary for living organisms and have various roles as, energy sources, hormone precursors and as components of membrane structures. Fatty acid β-oxidation is a pathway of energy metabolism, in which the fatty acyl-CoAs are degraded in several steps. Peroxisomal β-oxidation systems are found in all eukaryotes studied thus far, but the existence of a mitochondrial system is established in mammals only. Multifunctional enzyme type 2 (MFE-2) has been characterized from various species and is responsible for catalyzing the second and third steps in the R-specific peroxisomal β-oxidation pathway. MFE-2 accepts a wide range of substrates and displays great variation in domain organization and overall molecular mass. The crystal structures of individual domains of MFE-2 from several species have been determined previously. In this study, the structural knowledge of MFE-2 is further extended from the domain level to the assembly of the full-length enzyme. The crystal structure of Drosophila melanogaster MFE-2 (DmMFE-2) was solved at 2.15 Å resolution. The enzyme is a homodimer with 3R-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and 2E-enoyl-CoA hydratase 2 activities residing on each of the polypeptide subunits. Kinetic data combined with information from the structure, suggest that the catalytic domains of DmMFE-2 work as separate entities. It also appears that the enzyme does not assemble into dimers in vitro when the catalytic subunits are introduced in a solution as stand-alone proteins. The data were confirmed by two different methods, static light scattering and small-angle X-ray scattering. However, the primary use of SAXS was not to monitor the formation of dimers in solution, but instead it was used for structure determination of the human MFE-2. During the process, the structural information from DmMFE-2 was used as a scaffold for the human homolog. After collecting a wide range of SAXS data and numerous calculations, a plausible low resolution solution structure of human MFE-2 was obtained. The model reveals the overall assembly of the enzyme and the locations of the C-terminal SCP-2L domains (an unspecific lipid carrier), thus enabling further hypotheses regarding the possible role of the SCP-2L domain in the enzymatic reaction. / Tiivistelmä Lipidit eli rasva-aineet ovat välttämättömiä eliöille ja niillä on lukemattomia rooleja mm. energianlähteinä, kalvojen rakenteina ja hormonien esiasteina. Rasvahappoja hajotetaan monivaiheisella metaboliareitillä, jota kutsutaan β-oksidaatioksi. Peroksisomaalinen rasvojen hajotusreitti on löydetty kaikista tähän asti tutkituista aitotumallisista, mutta mitokondrioissa tapahtuva rasvojen β-oksidaatio on löydetty vain nisäkkäiltä. Peroksisomaalinen monitoiminen entsyymi tyyppi 2 (MFE-2) katalysoi toisen ja kolmannen reaktion R-spesifisellä rasvahappojen hajotusreitillä ja se on karakterisoitu useilta eri lajeilta. MFE-2 muodostaa lajista riippuen hyvin erilaisia ja molekyylimassaltaan erikokoisia alayksikköyhdistelmiä, jotka pystyvät katalysoimaan erityyppisten substraattien hapetuksen. Eri lajien MFE-2:n yksittäisten alayksiköiden kiderakenteet ovat olleet tunnettuja jo vuosia. Tässä tutkimuksessa rakennetietämys laajenee MFE-2:n osalta alayksikkötasolta kokopitkän entsyymin tasolle, sillä banaanikärpäsen MFE-2:n (DmMFE-2) kiderakenne selvitettiin 2.15 ångströmin erotuskyvyllä. Tämä homodimeerinen entsyymi kantaa samassa polypeptidissä sekä 3R-hydroksiasyyli-KoA-dehydrogenaasi, että 2E-enoyyli-KoA-hydrataasi 2 -aktiivisuuksia. Kiderakenteen ja reaktiokinetiikan perusteella tehtiin johtopäätös, jonka mukaan DmMFE-2:n alayksiköt toimivat itsenäisinä kokonaisuuksinaan. Staattisen valonsironnan (SLS) ja röntgenpienkulmasirontamittauksien (SAXS) perusteella MFE-2:n erillisinä tuotetut alayksiköt eivät muodosta liuoksessa spontaanisti kokopitkän MFE-2:n kaltaisia oligomeerejä. Ihmisen MFE-2:n alhaisen erotuskyvyn malli määritettiin röntgenpienkulmasirontatekniikan avulla. Tässä prosessissa käytettiin hyväksi banaanikärpäsen entsyymin tarjoamaa rakennetietoa, jonka perusteella rakennettiin ensin runko ihmisen MFE-2:lle. Monivaiheisen prosessin jälkeen saatiin lopulta laskettua vakuuttava malli, joka paljastaa ensimmäistä kertaa ihmisen kokopitkän MFE-2:n rakenteen ja antaa mahdollisuuden tehdä alustavia johtopäätöksiä karboksiterminaalisen lipidejä epäspesifisesti sitovan alayksikön (SCP-2L) biologisesta roolista osana tätä monitoimista entsyymiä.