The phosphate and sulfate esters of carbohydrates are widespread in nature, where they partake in a variety of signalling roles. This thesis focuses on the involvement of trehalose-6-phosphate (Tre-6-P) in regulating plant growth, and the function of sulfated carbohydrates in the immune response. In plants, Tre-6-P is a critical messenger that conveys environmental information for the control of metabolic state. Beneficial natural conditions lead to an increase in the in vivo concentration of Tre-6-P, which in turn triggers biosynthetic processes facilitating plant growth. However, the mechanism by which this effect is exerted is largely unknown. A thorough understanding of this fundamental signalling pathway could allow considerable improvements in agriculture. Recent evidence has found an interaction between Tre 6 P and a protein kinase system (SnRK1), mediated via an intermediary protein whose identity is unknown. Our efforts to identify this elusive protein are presented. Methodology is developed to allow the synthesis of Tre-6-P analogues for defining structure-activity relationships, with particular attention focused towards the desymmetrization of trehalose and the control of phosphate migrations. Tre-6-P is tethered to a solid phase resin allowing affinity extraction of putative intermediary factors. The 14-3-3 class of regulatory proteins is identified as a potential binding partner of Tre-6-P. The mannose receptor (MR) is an essential element of the mammalian immune system. Expressed on macrophages, the protein can bind and internalize pathogens through their surface exposed carbohydrates. However, the receptor can also dimerize, upon which it is able to divalently bind to sulfated carbohydrates. The biological significance of this sulfate binding is poorly understood. Current hypotheses invoke a role for the sulfate mediated trafficking of MR dimers to areas of B-cell maturation for antigen presentation, thus linking the innate and adaptive defence mechanisms. In any case, the dimerization of the MR is an essential prerequisite for interaction with carbohydrate sulfates. Methodology is required to probe this dimerization on the surface of cells under their native conditions. In this thesis, we use fluorescence microscopy to study the binding of various probes to macrophage and endothelial liver derived cell lines. Results of our initial investigations are presented that show internalization of the probes. The use of FRET imaging to directly probe the presence of MR dimers is studied.

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La Sucrose non-fermenting Related Kinase (SnRK1), en interaction avec ses deux sous unités : b et g (SNF4), est un important régulateur du métabolisme et des réponses aux stress chez les plantes. Le but de cette thèse est d'étudier le rôle de MtSNF4b, une sous unité g spécifique des graines de Medicago truncatula, pendant l'imbibition en relation avec la germination. Une analyse physiologique de la germination des graines RNAi MtSNF4b au cours de la post maturation à sec montre que les graines n'exprimant pas MtSNF4b perdent leur dormance plus rapidement que les graines de type sauvage. Une analyse transcriptomique comparative entre des embryons RNAi MtSNF4b et types sauvages montre que la plupart des gènes sont réprimés dans les graines RNAi MtSNF4b et sont liés au stress biotiques. Ces gènes codent des pathogenesis related protéines de type PR-10, des chitinases ou des facteurs de transcription de type WRKY et des enzymes impliquées dans le métabolisme secondaire, notamment les voies métaboliques des phénylpropanoïdes et des isoflavonoïdes pour la biosynthèse de la médicarpine. Cependant, aucune différence dans la sensibilité des semences imbibées de type sauvage et RNAi MtSNF4b à deux souches de Xanthomonas par l'analyse de dynamiques de tailles des populations bactériennes n'a pu être mise en évidence. Des résultats préliminaires d'une étude de double hybride mettent en évidence plusieurs candidats potentiellement impliqués dans la régulation de ces gènes. La protéine MtSNF4b semble connecter la post maturation à sec avec les mécanismes de défenses dans les graines dormantes de Medicago truncatula.

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The sucrose-nonfermenting-1 related kinase 1 (SnRK1) protein complex is a heterotrimeric serine/threonine protein kinase complex conserved in eukaryotes that acts as a regulator of carbon metabolism and energy homeostasis. The objective of this study was to determine if the SnRK1 protein complex has a role in the nitrogen response and during dormancy acquisition in poplar. Gene expression profiling of the PtdSnRK1, PtdAKINbeta, and PtdAKINgamma gene family members was carried out using a robust qRT-PCR assay. A subset of these genes showed modified expression patterns under differential nitrogen availability and during dormancy acquisition, suggesting that SnRK1 complexes comprised of specific subunits may be involved in the regulation of the response to nitrogen and during dormancy acquisition. The regulatory subunits PtdAKINbeta1.1, PtdAKINgamma1.1 and PtdAKINgamma2.3 were often identified using principal component analysis as significantly responsible for distinguishing treatments from one another and therefore merit further study. / Plant Biology

Photosynthetic plants have a remarkable ability to modify their metabolism and development according to ever changing environmental conditions. The root system displays continuous growth of the primary root and formation of lateral roots enabling efficient water and nutrient uptake and anchorage of the plant in soil. With regard to lateral roots, development is post-embryonic, originating from the pericycle of the primary root. Coordinated activity of several molecular signalling pathways controlled by the hormone auxin is important throughout all stages of lateral root development.At first, two adjacent Xylem Pole Pericycle (XPP) cells are activated and the nuclei of these cells migrate towards a common cell wall.This is followed by XPP cells acquiring volume thus swelling up.The XPP cells then undergo anticlinal cell division, followed by a series of periclinal and anticlinal divisions,leading to lateral root primordia.These break through the radial cell layers and emerge out the primary root. Although root system plasticity is well-described in response to environmental cues such as ion nutrition in the soil, little is known on how root development is shaped according to the endogenous energy status of the plant.In this study, we were able to connect limited perturbations in photosynthetic energy supply to lateral root development.We established two experimental systems – treatment with low light and unexpected darkness which led to short-term energy imbalance in the plant.These short perturbations administered, showed an increase in the emerged lateral root density and decrease in root hexose availability and activation of the low energy marker gene ASN1 (ASPARAGINE SYNTHETASE 1).Although not demonstrated, presumably, these disturbances in the plant energy homeo-stasis activates SnRK1 (SNF1 RELATED KINASE 1),an evolutionary conserved kinase mediat-ing metabolic and transcriptional responses towards low energy conditions. In A. thaliana, two catalytic α-subunits of this kinase (SnRK1.α1 and SnRK1.α2) are functionally active and form ternary complexes with the regulatory β- and γ- subunits. Whereas unexpected darkness results in an increase in emerged lateral root density, the snrk1.α1 loss-of-function mutant displayed decrease in emerged lateral root density. As this effect is not that pronounced in the snrk1.α2 loss-of-function mutant, the α1 catalytic subunit is important for the observed lateral root phenotype under short-term energy perturbations. Moreover, root expression patterns of SnRK1.α1:GFP supports a role of this catalytic subunit in lateral root development. Furthermore, the lateral root response during short-term perturbations requires the SnRK1 downstream transcriptional regulator bZIP63 (BASIC LEU-CINE ZIPPER 63), as demonstrated here by a loss-of-function approach. Phenotypic studies showed that in comparison to wild-type, bzip63 mutants displayed decreased lateral root density upon low-light and unexpected darkness conditions. Previous work has demonstrat-ed that SnRK1 directly phosphorylates bZIP63 at three serine residues. Alanine-exchange mutants of the SnRK1 dependent bZIP63 phosphorylation sites behave similarly to bzip63 loss-of-function mutants and do not display increased lateral root density upon short-term unexpected darkness. This data strongly supports an impact of SnRK1-bZIP63 signalling in mediating the observed lateral root density phenotype. Plants expressing a bZIP63:YFP fu-sion protein showed specific localization patterns in primary root and in all developmental stages of the lateral root. bzip63 loss-of-function mutant lines displayed reduced early stage lateral root initiation events under unexpected darkness as demonstrated by Differen-tial Interference Contrast microscopy (DIC) and the use of a GATA23 reporter line. This data supports a role of bZIP63 in early lateral root initiation. Next, by employing Chromatin Immunoprecitation (ChIP) sequencing, we were able to iden-tify global binding targets of bZIP63, including the auxin-regulated transcription factor (TF) ARF19 (AUXIN RESPONSE FACTOR 19), a well-described central regulator of lateral root development. Additional ChIP experiments confirmed direct binding of bZIP63 to an ARF19 promoter region harboring a G-Box cis-element, a well-established bZIP63 binding site. We also observed that short-term energy perturbation upon unexpected darkness induced tran-scription of ARF19, which was impaired in the bzip63 loss-of-function mutant. These results propose that bZIP63 mediates lateral root development under short-term energy perturba-tion via ARF19. In conclusion, this study provides a novel mechanistic link between energy homeostasis and plant development. By employing reverse genetics, confocal imaging and high-throughput sequencing strategies, we were able to propose a SnRK1-bZIP63-ARF19 signalling module in integrating energy signalling into lateral root developmental programs. / Photosynthestisch aktive Pflanzen haben die bemerkenswerte Fähigkeit, ihren Stoffwechsel und ihre Entwicklung an sich ständig ändernde Umweltbedingungen anzupassen. Das pflanz- liche Wurzelsystem weist ein kontinuierliches Primärwurzelwachstum und eine Ausbildung von Seitenwurzeln auf, wodurch eine effiziente Wasser- und Nährstoffaufnahme sowie die Verankerung der Pflanze im Boden ermöglicht werden. Die Entwicklung der Seitenwurzeln verläuft post-embryonal, ausgehend vom Perizykel der Primärwurzel. Die koordinierte Aktivi- tät mehrerer molekularer Signalwege, die durch das Hormon Auxin gesteuert werden, ist in allen Stadien der Seitenwurzelentwicklung wichtig. Bei diesem Prozess werden zunächst zwei benachbarte Xylem-Pol-Perizykel-Zellen (XPP) aktiviert, deren Zellkerne zu einer gemeinsa- men Zellwand migrieren. Daraufhin schwillt das Volumen der XPP-Zellen an, bevor sich diese zunächst antiklinal teilen. Durch sukzessive periklinale und antiklinale Teilungen entstehen so Seitenwurzel-Primordien. Diese durchbrechen die radialen Zellschichten und treten aus der Primärwurzel aus. Während die Plastizität des Wurzelsystems als Reaktion auf Umwelteinflüsse, wie z.B. die Ver- sorgung mit Ionen aus dem Boden, bereits umfassend erforscht wurde, so ist die Abhängigkeit der Wurzelentwicklung vom endogenen Energiezustand der Pflanze weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnten wir geringfügige Störungen der photosynthetischen Energieversor- gung mit der Seitenwurzelentwicklung in Verbindung bringen. Pflanzen wurden Schwachlicht oder unerwarteter Dunkelheit ausgesetzt und damit ein kurzzeitiges Energieungleichgewicht erzeugt. Hierdurch zeigte sich eine Zunahme der Seitenwurzeldichte bei gleichzeitiger Ab- nahme der Verfügbarkeit von Hexosen in der Wurzel und Aktivierung des Energieverarmungs- Markergens ASN1 (ASPARAGIN-SYNTHETASE 1). Obwohl dieser Mechanismus noch nicht ge- klärt ist, aktiviert die Störung der pflanzlichen Energie-Homöostase vermutlich SnRK1 (SNF1 RELATED KINASE 1), eine evolutionär konservierte Kinase, die metabolische und transkriptio- nelle Reaktionen auf niederenergetische Bedingungen vermittelt. In Arabidopsis sind zwei ka- talytische α-Untereinheiten dieser Kinase (SnRK1.α1 und SnRK1.α2) funktionell aktiv und bil- den ternäre Komplexe mit den regulatorischen β- und γ-Untereinheiten. Während eine uner- wartete Dunkelheit zu einer Zunahme der Dichte der auswachsenden Seitenwurzeln führt, zeigte die Snrk1.α1 Funktionsverlustmutante den gegenteiligen Effekt. Da dieser Effekt in der Funktionsverlustmutante von snrk1.α2 weniger stark ausgeprägt ist, scheint die katalytische Untereinheit α1 für den beobachteten Seitenwurzel-Phänotyp unter kurzfristigen Energiestö- rungen eine wichtige Rolle zu spielen. Das Expressionsmuster von SnRK1.α1:GFP in der Wur- zel unterstützt die mögliche Rolle dieser katalytischen Untereinheit bei der Seitenwurzelent- wicklung weiter. Darüber hinaus erfordert die Seitenwurzelbildung während kurzfristiger Störung des pflanzli- chen Energiehaushalts den SnRK1-nachgeschalteten Transkriptionsregulator bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63). Phänotypische Studien zeigten, dass bzip63-Funktionsverlust-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp nach der Kultivierung unter Schwachlicht oder nach unerwarteter Dunkelheit eine geringere Seitenwurzeldichte aufwiesen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass SnRK1 bZIP63 direkt an drei Serinresten phosphoryliert. Alanin-Austauschmutanten der SnRK1-abhängigen bZIP63-Phosphorylierungsstellen verhielten sich ähnlich wie bzip63-Funk- tionsverlustmutanten und zeigten bei kurzzeitiger unerwarteter Dunkelheit keine erhöhte Seitenwurzeldichte. Diese Daten weisen deutlich auf einen Einfluss des SnRK1-bZIP63-Signal- wegs auf den beobachteten Seitenwurzeldichte Phänotyp hin. Pflanzen, die ein bZIP63:YFP- Fusionsprotein exprimieren, zeigten ein spezifisches bZIP63 Lokalisierungsmuster in der Pri- märwurzel, sowie in allen Entwicklungsstadien der Seitenwurzel. bzip63-Funktionsverlustmu- tantenlinien zeigten reduzierte Seitenwurzel- Initiationsereignisse bei unerwarteter Dunkel- heit, wie durch Differentialinterferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) und der Verwendung einer GATA23-Reporterlinie nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von bZIP63 bei der frühen Seitenwurzel-Initiierung hin. Durch die Anwendung der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Sequenzierungsmethode konnten wir daraufhin globale Bindungsziele von bZIP63 identifizieren, einschließlich des au- xinregulierten Transkriptionsfaktors ARF19 (AUXIN RESPONSE FACTOR 19), einem gut be- schriebenen zentralen Regulator der Seitenwurzelentwicklung. Zusätzliche ChIP-Experimente bestätigten die direkte Bindung von bZIP63 an eine ARF19-Promotorregion, die ein G-Box cis- Element, eine bekannte bZIP63-Bindungsstelle, beherbergt. Wir beobachteten auch, dass kurzfristige Energiestörungen bei unerwarteter Dunkelheit die Transkription von ARF19 indu- zierte, die in der bzip63-Funktionsverlustmutante beeinträchtigt war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bZIP63 die Seitenwurzelentwicklung unter kurzfristiger Energiestörung über ARF19 vermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine neuartige mechanistische Verbin- dung zwischen Energiehomöostase und Pflanzenentwicklung herstellt. Durch den Einsatz von reverser Genetik, konfokaler Mikroskopie und Hochdurchsatz-Sequenzierungsstrategien konnten wir einen SnRK1-bZIP63-ARF19-Signalweg zur Integration von Energiesignalen in Sei- tenwurzelentwicklungsprogramme aufdecken.

Pflanzen müssen sich während der Samenkeimung und Keimlingsentwicklung über eingelagerte Speicherstoffe heterotroph versorgen, bis sie, nach Etablierung ihres Photosyntheseapparats, einen autotrophen Lebensstil führen können. Diese Arbeit geht von der Hypothese aus, dass der evolutionär konservierten zentral-metabolischen Kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) eine besondere Rolle bei der Mobilisierung von Speicherstoffen während der Keimlingsentwicklung zukommt. Während die Bedeutung von SnRK1 als zentraler Regulator katabolischer Prozesse unter Energiemangel- und Stresssituationen bereits gezeigt wurde, war die Funktion von SnRK1 im Zusammenhang mit der Samenkeimung weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass SnRK1 in Arabidopsis die Mobilisierung und Degradation von Speicherstoffen, insbesondere von Triacylglyceride (TAGs), Samenspeicherproteinen und Aminosäuren, steuert. Sowohl Studien zur Lokalisation von SnRK1:GFP-Fusionsproteinen als auch Kinaseaktivitätsassays unterstützen eine mögliche Funktion von SnRK1 während der Keimlingsentwicklung. Eine induzierbare snrk1-knockdown Mutante zeigt neben einem eingeschränkten Wurzel- und Hypokotylwachstum auch keine Ausbildung eines Photosyntheseapparats, was die zentrale Rolle der SnRK1 in diesem frühen Entwicklungsstadium untermauert. Durch Fütterungsexperimente mit Glukose konnte der Phänotyp einer snrk1 -Mutante in Keimlingen gerettet werden. Dies zeigt, dass der metabolische Block durch externe Gabe von Kohlenhydraten umgangen werden kann. Die zentrale Funktion von SnRK1 ist folgich der Abbau von Speicherstoffen und keine allgemeine Deregulation des pflanzlichen Stoffwechsels. Durch massenspektrometrische Untersuchungen von Keimlingen des Wildtyps und der snrk1-Mutante konnte gezeigt werden, dass TAGs in der Mutante in der spä- ten Keimlingsentwicklung ab Tag 4 langsamer abgebaut werden als im Wildtyp. Ebenso werden Samenspeicherproteine in der Mutante langsamer degradiert, wodurch die Verfügbarkeit von freien Aminosäuren in geringer ist. Entgegen der allgemeinen Annahme konnte gezeigt werden, dass während der Keimlingsentwicklung zumindest in Arabidopsis, einer ölhaltigen Pflanze, zunächst Kohlenhydrate in Form von Saccharose abgebaut werden, bevor die Degradation von TAGs und Aminosäuren beginnt. Diese Abbauprodukte können dann der Glukoneogenese zugeführt werden um daraus Glukose herzustellen. Mittels Transkriptom-Analysen konnten zentrale SnRK1-abhängige Gene in der Speicherstoffmobilisierung von TAG, beispielsweise PEROXISOMAL NAD-MALATE DEHYDROGENASE 2 (PMDH2) und ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4), und Aminosäuren identifiziert werden. Somit wurde ein Mechanismus der SnRK1-abhängigen Genregulation während der Samenkeimung in Arabidopsis gefunden. Bei der Degradation von Aminosäuren wird die cytosolische PYRUVATE ORTHOPHOSPHATE DIKINASE (cyPPDK), ein Schlüsselenzym beim Abbau bestimmter Aminosäuren und bei der Glukoneogenese, SnRK1-abhängig transkriptionell reguliert. Durch Koregulation konnte der Transkriptionsfaktor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) gefunden werden, dessen Transkription ebenfalls SnRK1-abhängig reguliert wird. Außerdem konnte die Transkription von cyPPDK in bzip63-Mutanten nur noch sehr schwach induziert werden. In Protoplasten konnte der cyPPDK-Promotor durch Aktivierungsexperimente mit bZIP63 und SnRK1α1 induziert werden. Durch Mutationskartierung und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)PCR konnte mehrfach eine direkte Bindung von bZIP63 an den cyPPDK-Promotor nachgewiesen werden. Zusammenfassend ergibt sich ein mechanistisches Arbeitsmodell, in dem bZIP63 durch SnRK1 phosphoryliert wird und durch Bindung an regulatorische G-Box cis-Elemente im cyPPDK- Promotor dessen Transkription anschaltet. Infolgedessen werden Aminosäuren abgebaut und wird über die Glukoneogenese Glukose aufgebaut. Dieser Mechanismus ist essentiell für die Übergangsphase zwischen heterotropher und autotropher Lebensweise, und trägt dazu bei, die im Samen vorhandenen Ressourcen dem Keimling zum idealen Zeitpunkt zugänglich zu machen. Darüber hinaus werden Gene im Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren ebenfalls durch bZIP63 reguliert. Dabei wird dem Keimling Energie in Form von Adenosin-Triphosphat (ATP) zur Verfügung gestellt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Mobilisierung von Speicherstoffen auch während der Keimlingsentwicklung direkt von SnRK1 abhängig ist. Die umfangreichen Datensätze der RNA-Seq-Analysen bieten zudem die Möglichkeit, weitere SnRK1-abhängige Gene der Speichermobilisierung zu identifizieren und somit einem besseren Verständnis der Keimlingsentwicklung beizutragen. Aufgrund der zentralen Bedeutung der SnRK1-Kinase in diesem entscheidenden Entwicklungsschritt ist davon auszugehen, dass diese Erkenntnisse mittelfristig auch für bessere Keimungsraten und somit bessere Erträge in der Landwirtschaft genutzt werden können. / During seed germination and seedling establishment, seedlings must live heterotrophically on the resources stored in the seed. Only after establishing a fully functional photosynthetic apparatus, the young plant can change to an autotrophic lifestyle - one of the key features of plant life and metabolism. This work is based on the hypothesis that the evolutionarily conserved central metabolic kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) plays a crucial role in the mobilization of storage compounds during seedling establishment. Whereas the importance of SnRK1 as a central regulator of catabolic processes during energy deprication and stress situations has already been demonstrated, so far, the function of SnRK1 in connection with seed germination had remained largely unresolved. Here, we shown for the first time that SnRK1 in Arabidopsis controls the degradation of storage resources, especially triacylglycerides (TAG), seed storage proteins and amino acids. Studies on the localization of SnRK1:GFP fusion proteins and as well as kinase activity assays support a possible function of SnRK1 during seedling establishment. An inducible snrk1-knockdown mutant is strongly impaired in root and hypocotyl growth and the plant do not develop a photosynthetic apparatus. Feeding experiments with glucose rescued the snrk1-mutant phenotype, showing that the metabolic block can be bypassed by external administration of carbohydrates. Thus, the central function of SnRK1 is concluded to be the degradation of the storage resources and rather than a general deregulation of the plant metabolism. Mass spectrometric investigations have shown that TAG degradation and seed storage proteins breakdown are partially impaired in the mutant. Thus, the availability of free amino acids in snrk1 mutant seedlings is lower in comparison to wildtype. It could be shown that - despite the fact that Arabidopsis is an oil-seed plant - carbohydrates, especially sucrose, are the primary resource compound for the seedling before the degradation of TAGs and amino acids is initiated. These degradation products can then be used in gluconeogenesis to produce glucose. Transcriptome analyses have identified key SnRK1-dependent genes, that play a key role in the storage resource catabolism, for example ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4) and PMDH2 in TAG breakdown. As an example of an enzyme involved in amino acid catabolism, cyPPDK was further investigated in the course of this study. During the degradation of amino acids, cyPPDK, a key enzyme in the degradation of certain amino acids and gluconeogenesis, is transcriptionally regulated in a SnRK1-dependent manner. Furthermore, it was discoverd that the SnRK1-dependent transcription factor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) is involved in the regulation of amino acid breakdown: In qRT-PCR experiments, bzip63-mutants showed no induction of cyPPDK, and co-regulation studies showed that cyPPDK and bZIP63 are subject to the same SnRK1-dependet regulation pattern during early seedling development. Finally, by mutation mapping and chromatin immunoprecipitation (ChIP)PCR, a direct binding of bZIP63 to the promoter could be demonstrated. Based on these results, a mechanistic working model was established, proposing bZIP63 to be phosphorylated by SnRK1 to then activate transcription of the cyPPDK promoter via binding to regulatory G-box cis elements. As a consequence, amino acids are degraded and the metabolites are used to produce glucose via gluconeogenesis. This additional source of energy enables the seedling to make the transition from heterotrophy to autotrophy. Additionally, the degradation of branched-chain amino acids is also regulated by bZIP63. Thereby, ATP is generated to fuel the seedlings energy demands. In summary, this study shows that SnRK1 plays an essential role in the mobilization of storage compounds in seedlings during the transition from heterotrophic to autotrophic life by supplying the seedling with the much-needed additional energy gained from the breakdown of TAGs and amino acids. Mining the extensive RNA-Seq data sets provided by this study will allow the identification of further SnRK1-dependent genes to further unravel this crucial signaling network. Due to the crucial role that these proteins play in early seedling development, these findings will enable future research to increase seedling vigor and finally crop yield.

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The myo-inositol signaling pathway in plants allows them to sense external environmental stimuli and respond to them. This signaling pathway depends on the dynamic levels of the second messenger, inositol(1,4,5)trisphosphate, which in turn is regulated by inositol polyphosphate 5-phosphatases (5PTases). Previous studies have shown that 5PTase 13 binds an important energy sensor, Sucrose non-fermenting (Snf) 1-related kinase (SnRK1.1) and also a novel protein P80. Studies from the lab have also shown that P80 is a part of a deubiquitinating enzyme complex along with WDR20 and Ubiquitin-specific protease called UBP3. Our p80 mutants have a root deficient phenotype under low energy conditions which is normalized by addition of sucrose. p80 mutants show reduced growth and early senescence under specific environmental conditions. This is opposite in nature to SnRK1.1 overexpressors. In this study, I have examined the possible interaction of P80 with SnRK1. I have studied the effects of expression of the exogenous SnRK1.1:GFP transgene under the control of the 35S CaMV promoter in the p80 mutant. This will facilitate the delineation of mechanisms that plants use for the control of energy sensing. I also examined the effects of the overexpression of SnRK1.2:GFP in the p80 mutant. Further, I have explored the presence of a new class of molecules, inositol phosphate molecules (InsPs) containing pyrophosphate bonds (PPx) in p80 mutants. Recent evidence has shown that this class of molecules has roles in sensing and signaling. I have demonstrated that InsP7 is present in developing seeds and vegetative tissue of higher plants. I have also demonstrated that p80 mutants have an alteration in the levels of PPx-InsPs. In addition, I have established spatial expression patterns of two enzymes involved in the synthesis of PPx-InsPx, known as VIP kinases. These studies will help resolve how PPx-InsPs are regulated in plants and thus help in their functional characterization. / Master of Science

Plants have molecular mechanisms for nutrient-related stress responses; however, their exact regulation remains unclear. For example, the integral myo-inositol (inositol) signal transduction pathway allows Arabidopsis thaliana to sense and respond to changes in environmental stimuli, such as water, light availability, and nutrient stress. The inositol signaling pathway relies on dynamic changes in second messenger levels of inositol(1,4,5)P3 (InsP3) and is regulated by myo-inositol polyphosphate 5-phosphatases (5PTases). The 5PTses keep balance between InsP3 signal transduction and termination. Previous work has identified the Sucrose non-fermenting (Snf) 1-related kinase (SnRK1.1) as a binding partner to 5PTase13, a potential InsP3 regulator, and a novel protein called P80, a predicted component of the Cullin4 (CUL4) E3 Ubiquitin ligase complex. In plants, SnRK1.1 is a central integrator of metabolism, stress responses, and developmental signals. Moreover, SnRK1.1 is conserved with the eukaryotic AMP-activated protein (AMPK) and Snf1 kinases—enzymes fundamental to transcriptional regulation and metabolic balance. Studying SnRK1.1 regulation may reveal mechanisms for agricultural sustainability and may offer valuable links to understanding metabolic diseases and lifespan in humans. Therefore, the research presented here centered on characterizing the regulation of SnRK1 gene expression and steady-state protein levels in plants. I show developmental and nutrient-related regulation of spatial expression patterns of SnRK1 genes and SnRK1.1 protein. Further, I present a model for regulation of SnRK1.1 protein stability in vivo based on SnRK1.1 steady-state protein levels in p80 and cul4 co-suppressed (cs) mutants. My results indicate SnRK1.1 regulation is dynamic, and dependent on the timing of particular cues from development and the environment. / Master of Science