Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.

Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.

Células eucariotas usadas como plataforma de expressão de proteínas recombinantes são geralmente cultivadas com soro fetal bovino (SFB), porém, abordagens biotecnológicas atuais sobre cultura de células devem evitar o uso deste suplemento, devido a problemas de custo, variações entre os lotes e risco de contaminação. Assim, nosso objetivo foi expressar as proteínas recombinantes: GFP (proteína verde fluorescente), NS3 (proteína não estrutural 3 do vírus da hepatite C) e RVGP (glicoproteína do vírus da raiva) em células BHK-21 adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM) usando o sistema de expressão baseado no Semliki Forest Virus (SFV). Os resultados do presente trabalho mostraram que células adaptadas em SFM cresceram de forma eficiente, produziram mais partículas virais recombinantes de SFV do que células suplementadas com soro, sendo que estas partículas virais podem ser usadas diretamente para imunização, pois garantiram uma amplificação e expressão eficiente das diferentes proteínas dentro da célula hospedeira. / Eukaryotic cells are cultured with serum, however current biotechnological approaches of cell culture need to avoid using of this supplement, due to the high costs, lot-to-lot variation and risk of contamination. Thus, our aim was to express the recombinant protein: GFP (green fluorescent protein); NS3 (Hepatitis C virus non-structural protein 3) and RVGP (rabies virus glycoprotein) in BHK-21 cells cultured in serum free culture based on Semliki Forest Virus system. The results of this work showed that cells cultured in serum-free media (SFM) were grown efficiently, they were produce more recombinant viral particles when compared with cells supplemented with SFB. These viral particles can be used directly for immunization, since generated amplification and expression efficient of different proteins within the host cell.