Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique. / In the cell, the expression of each mRNA is finely tuned transcriptionally, but also, at the level of translation, degradation and intracellular localisation. These mechanisms of regulation are important in order to control the expression of each translational product at the right time and place. When a physiological phenomenon is activated, the expression of multiple functionally-related mRNAs must be simultaneously regulated. To orchestrate the coordinated expression of all the transcripts that respond to specific cell needs, it is advantageous to regulate the function of a common trans-acting factor that associates with them. Such a mechanism permits to control the fate of a sub-population of mRNAs according to the factors to which they are bound. As a means to learn more about the regulation of mRNAs in ribonucleoprotein complexes (mRNP), we decided to focus our study on the characterisation of Staufen-associated mRNPs. In mammalian cells, two Staufen paralogs, Stau1 and Stau2, are expressed and each gene generates different isoforms through differential splicing. Staufen proteins are double-stranded RNA binding proteins implicated in numerous aspects of the post-transcriptional regulation of mRNAs such as degradation, translation and localisation. Stau1 and Stau2 are similar proteins with an overall percentage identity of around 50%. This percentage increases to near 75% when only the functional double-stranded RNA-binding domains (dsRBD3) are compared. Similarly, Stau2 isoforms, Stau259 and Stau262, are perfectly identical except at the N-terminal extremity where the sequence of Stau262 is extended as compared to that of Stau259. Therefore, their RNA-binding domain 3 are perfectly identical. These observations bring in an interesting problematic. Are those almost identical proteins part of the same mRNP, acting in conjunction or, despite their high similarities, are they part of distinct mRNP participating in specific function? In order to address this question, we decided to immunoprecipitated from HEK293 cells, Stau155, Stau259 and Stau262-associated mRNPs and identify bound mRNAs. Resulting mRNAs isolated from each complex were identified by microarray analysis. There is a predominance of mRNAs involved in cell metabolism, transport, transcription and regulation of cell processes. The presence of at least some of these transcripts in specific mRNP was confirmed by RT-PCR. Despite the presence of a common population of mRNA associated with both Stau1 and Stau2, the majority of the transcripts were specific to each paralog. Interestingly, we observed that transcripts associated with either Stau1 or Stau2 were nevertheless involved in the same pathways of cell regulation, suggesting that both proteins have complementary roles in the same cellular processes. On the other hand, mRNAs associated with Stau259 and Stau262 were more similar. This suggests that these two isoforms might have more overlapping functions. Consistent with a model of post-transcriptional gene regulation, our results show that Stau1- and Stau2-mRNPs associate with distinct but overlapping sets of cellular mRNAs and that these mRNAs are nevertheless involved in common pathways. It is consistent with the high degree of sequence similarity between Stau1 and Stau2 that predicts that they may have conserved convergent functions and with the observation that they are distributed in distinct mRNP complexes in neurites. Knowing the importance of Stau2 in the transport of dendritic mRNA and to further understand the molecular mechanisms by which it modulates synaptic function, we decided to characterise Stau2-containing mRNPs in neurons. Using anti-Stau2 antibody to immunoprecipitate the mRNPs, we have identified a population of more than 1700 transcripts associated with Stau2 in embryonic rat brain. These mRNAs code for proteins involved in cellular processes such as post-translational modification, translation, intracellular transport and RNA metabolism. Interestingly, Stau2-associated mRNAs isolated form rat brains are relatively different from those isolated from HEK293 cells. This result suggests that the specificity of Stau2-mRNA association can differ from one tissue to the other. Similarly, we have identified the proteins presents in Stau2-containing complexes isolated from embryonic rat brains by a proteomic approach. We were able to determine the presence of mRNA-binding proteins (PABPC1, hnRNP H1, YB1 and hsc70), proteins of the cytoskeleton (α- and β -tubulin) and RUFY3 a poorly characterized protein. While PABPC1 and YB1 associate with Stau2-containing mRNPs through RNAs, hsc70 is directly bound to Stau2 and this interaction is regulated by ATP. The presence of the RNA-binding proteins YB1 and PABPC1, both involved in translation regulation, suggests that the expression of Stau2-bound mRNAs may be regulated at the level of translation initiation. Finally, it is well known that synaptic plasticity requires mRNA transport in dendrites and their local translation. Since the study of the neurophysiological role of Stau2 was already in progress we decided to concentrate our energy on the function of Stau1. Therefore, we studied the importance of Stau1 protein at the neurophysiological level, especially looking for a role in synaptic plasticity. We were able to demonstrate that Stau1 is required for the late form of long term synaptic potentiation, L-LTP, a plasticity dependent not only on local translation of mRNAs, but also on newly transcribed and transported mRNAs. Using hippocampal slices, we showed that Stau1 down-regulation by RNA interference prevents the development and/or maintenance of L-LTP. However, neurons displayed normal early-LTP, mGluR1/5-mediated long-term depression, or basal evoked synaptic transmission. In addition, at the cellular level, Stau1 down-regulation shifted spine shape from regular to elongated spines, without changes in spine density. The change in spine shape could be rescued by an RNA interference-resistant Stau1 isoform. Therefore, Stau1 is important for processing and/or transporting in dendrites mRNAs that are critical in regulation of synaptic strength and maintenance of functional connectivity changes underlying hippocampus dependent learning and memory. In conclusion we were able to further reveal the composition and the importance of the Stau1 and Stau2 mRNP. First, we have identified distinct and overlapping population of mRNAs associated to the diverse isoform of Stau, form HEK293 cells. Second, we were able to identify a population of neuronal transcript as well as some proteins factors present in the Stau2 particles. One of which, hsc70, is directly bound to Stau2 and its interaction is regulated by the presence of ATP. Finally, we have demonstrated the importance of Stau1 in the morphology of the dendritic spine as well as its fundamental implication in synaptic plasticity.

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) affectent un individu sur 100 en France et sont caractérisés par des déficits de la communication et des interactions sociales ainsi que par la présence d’intérêts restreints et de comportements répétitifs. Le laboratoire a démontré l’implication de protéines synaptiques dans le développement des TSA et en particulier celle des protéines SHANK. Ces protéines sont des protéines d’échafaudage présentes au niveau de la densité post-synaptique (PSD) des neurones glutamatergiques et interagissant avec différents partenaires. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine SHANK3. Des mutations au sein du gène SHANK3 ont été détectées chez environ 1 à 2% des patients, selon le degré de sévérité du retard mental. Un déficit de SHANK3 altère le fonctionnement synaptique. En effet, des analyses sur modèles de souris invalidées pour le gène SHANK3 ont montré une diminution de la densité des épines dendritiques, de la taille de la densité post-synaptique et de l’expression des partenaires protéiques de SHANK3. Mon modèle principal d’analyse a consisté en la reprogrammation de fibroblastes en cellules pluripotentes induites (iPSC « induced pluripotent stem cells »). Les iPSCs ont ensuite été sélectivement dérivées en neurones corticaux. Nos études se sont focalisées sur l’analyse des conséquences fonctionnelles de mutations de novo du gène SHANK3 retrouvées chez 4 patients à l’état hétérozygote et présentes au sein de l’exon 21. Ces mutations conduisent à un codon stop prématuré. En parallèle, nous avons obtenu des cellules de 4 individus témoins ne présentant aucun trouble psychiatrique identifié. L’analyse a porté d’une part sur des aspects morphologiques et d’autre part sur des aspects fonctionnels. Nous avons étudié l’effet des mutations sur la maturation et les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques. Nous avons établi un protocole permettant une analyse détaillée de la morphologie en 3D des épines dendritiques et suivi leur maturation. Un résultat majeur est l’observation d’une diminution de la densité des épines sur les dendrites des neurones pyramidaux issus des patients par rapport aux témoins. Comme attendu, la maturation des épines n’est pas complètement achevée mais varie peu dans son évolution d’un individu à l’autre (témoins vs. patients). Nous avons poursuivi ces études par deux approches fonctionnelles : l’imagerie calcique et des études d’électrophysiologie. Les données électrophysiologiques sont en cours d’analyse. En conclusion, nous avons pu obtenir des cultures de neurones corticaux glutamatergiques et les maintenir en culture durant 40 jours pour effectuer différentes analyses à un stade de maturation suffisant pour la mise en évidence de phénotypes morphologiques et fonctionnels. Nous avons principalement observé une diminution de des densités synaptiques et de maturation des épines dendritiques au sein des neurones issus de patients liée à des altérations d’oscillations calciques spontanées. / Autism Spectrum Disorders (ASD) is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of population ; characterised by impairments in social interaction and reciprocal communication as well as repetitive and stereotyped behaviors. The work of the laboratory lead to the identification of several genes associated with ASD, among which genes of the synaptic pathway such as SHANK. The SHANK proteins are scaffolding proteins of the post-synaptic density (PSD) of glutamatergic neurons and interact with several partners. In my thesis project, we were particularly interested in SHANK3 mutations. First, Shank3 mutations represent up to 2.12% of ASD cases with moderate to high ID. A SHANK3 deficit leads to the alteration of the synaptic functioning. Indeed, studies of mice KO for SHANK3 gene showed a decrease of the dendritic spines density, of the PSD size and of the expression of SHANK3 partners. My principal model of analysis consisted in the reprogrammation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Then, the iPSCs were selectively derived into cortical neurons. Our studies were focus on the analysis of functional consequences of SHANK3 de novo mutations found within 4 patients. These mutations are heterozygous and within the exon 21. They result in a premature stop codon. In parallel, we obtained cells from 4 healthy individuals. The work was about the morphological and functional aspects. We analysed the mutations effects on the maturation and morphological caracteristics of the dendritic spines. We finalized a protocol that enabled a detailed analysis of the spine dendritic 3D morphology and their maturation follow-up. A important result was the observation of a decrease of the spine density on pyramidal neurons dendrites from patients compared to those from controls. Moreover, spines maturation was not fully accomplished but was not much different in its evolution between individuals (controls vs patients). Then, we used two functional skills : calcium imaging and electrophysiological experiments. The electrophysiological data are in progress. To conclude, we succeeded in the obtention of glutamatergic cortical neurons and to maintain them in culture during 40 days in order to realize some analysis at a sufficient maturation stage to observe morphological and functional phenotypes. We mainly observed a decrease of the dendritic spines density and maturation for the neurons from patients, with alterations of the spontaneous calcium oscillations.

Rho GTPases and their regulators such as guanosine exchange factors (GEFs) and GTPase activating proteins (GAPs) represent an important class of molecules controlling dendritic spine plasticity. Although they are typically described as cytoskeletal modulators, roles for the GTPases in endocytosis and cell polarity establishment have also been defined. The neuronal proteins a1- and a2-chimaerins belong to a group of Rac and Cdc42 GAPs that inactivate these GTPases; in addition to a GAP domain, the a-chimaerins share a phosphokinase C (PKC)-like C1 domain but have distinct N-terminal domains (NTDs). My project has explored the importance of specific domains of a1-chimaerin both in induction of a morphological cellular protrusion collapse phenotype ('circularisation') and in interactions with partner proteins that may help to explain the phenotype. The results described in my thesis show that a1-chimaerin possesses a previously undescribed C-terminal domain (CTD) that is indispensable for the ability of the protein to induce collapse of protrusions, and consequent circularisation, in various cell types; moreover, an intact CTD is also important for association of a1-chimaerin with its known effector EphA4, and potentially with other undefined membrane proteins, in a C1-domain- dependent manner. In addition, my results show that a1-chimaerin associates via its NTD with the Src kinase Fyn, and via its C1 domain with the NR2A subunit of the NMDA receptor. Further experiments explored a1-chimaerin effects on EphA4 and NMDA receptor cell surface expression, as well as binding to other putative partners - including the adaptor protein p35 and the polarity protein PAR6. Finally, I have shown that inhibition of a pathway involving the Rho-associated coiled-coil containing protein kinase (ROCK) reverts circularisation induced by a1- chimaerin, and that a blocking peptide based on the CTD may be employed to partially counteract the phenotype. These results uncover a novel domain in a1-chimaerin that may have a crucial importance for the induction of cellular process collapse by a1-chimaerin with a potential relevance to the EphA4-induced dendritic spine retraction, EphA4 receptor endocytosis, and cell surface expression of NR2A-containing NMDA receptors. This suggests a model of a multi-protein signalling complex involving a1-chimaerin that coordinates cellular process remodelling, and that is likely to be important both for adult neuronal circuit plasticity and for neurodegenerative diseases.

Formins, also known as formin homology (FH) proteins, are involved in a wide range of actin-mediated processes. The Diaphanous-related formin Daam1 (Dishevelled-associated activator of morphogenesis) interacts with the PDZ domain protein Dishevelled, and is required to establish planar cell polarity in Xenopus. Through a yeast two-hybrid screen, I characterized a PDZ-mediated interaction between the C-terminus of Daam1 and the PDZ domains 456 of GRIP1. In dissociated rat hippocampal cultures, Daam1 expression was seen throughout the soma and dendrites in a punctate pattern. Furthermore, co-staining with a synaptic marker suggests that Daam1 could be associated with post-synaptic specializations. Dendritic spines are enriched with actin filaments, and based on the subcellular localization of Daam1 and the evidence that formins are involved in regulating actin polymerization, I hypothesized that Daam1 might play a role in dendritic spine morphology. In order to investigate the functional roles for Daam1, viral vectors were developed using the Semliki-Forest defective viral vector to over-express the full-length Daam1 protein and a Daam1 lacking the PDZ-binding motif. The over-expression of the full-length Daam1 in organotypic hippocampal slices showed a punctate distribution throughout the dendritic shaft, with the occasional appearance in spines, resulting in an overall increase in dendritic spine length. This suggests that formins, such as Daam1, could potentially regulate spine morphology.

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique. / In the cell, the expression of each mRNA is finely tuned transcriptionally, but also, at the level of translation, degradation and intracellular localisation. These mechanisms of regulation are important in order to control the expression of each translational product at the right time and place. When a physiological phenomenon is activated, the expression of multiple functionally-related mRNAs must be simultaneously regulated. To orchestrate the coordinated expression of all the transcripts that respond to specific cell needs, it is advantageous to regulate the function of a common trans-acting factor that associates with them. Such a mechanism permits to control the fate of a sub-population of mRNAs according to the factors to which they are bound. As a means to learn more about the regulation of mRNAs in ribonucleoprotein complexes (mRNP), we decided to focus our study on the characterisation of Staufen-associated mRNPs. In mammalian cells, two Staufen paralogs, Stau1 and Stau2, are expressed and each gene generates different isoforms through differential splicing. Staufen proteins are double-stranded RNA binding proteins implicated in numerous aspects of the post-transcriptional regulation of mRNAs such as degradation, translation and localisation. Stau1 and Stau2 are similar proteins with an overall percentage identity of around 50%. This percentage increases to near 75% when only the functional double-stranded RNA-binding domains (dsRBD3) are compared. Similarly, Stau2 isoforms, Stau259 and Stau262, are perfectly identical except at the N-terminal extremity where the sequence of Stau262 is extended as compared to that of Stau259. Therefore, their RNA-binding domain 3 are perfectly identical. These observations bring in an interesting problematic. Are those almost identical proteins part of the same mRNP, acting in conjunction or, despite their high similarities, are they part of distinct mRNP participating in specific function? In order to address this question, we decided to immunoprecipitated from HEK293 cells, Stau155, Stau259 and Stau262-associated mRNPs and identify bound mRNAs. Resulting mRNAs isolated from each complex were identified by microarray analysis. There is a predominance of mRNAs involved in cell metabolism, transport, transcription and regulation of cell processes. The presence of at least some of these transcripts in specific mRNP was confirmed by RT-PCR. Despite the presence of a common population of mRNA associated with both Stau1 and Stau2, the majority of the transcripts were specific to each paralog. Interestingly, we observed that transcripts associated with either Stau1 or Stau2 were nevertheless involved in the same pathways of cell regulation, suggesting that both proteins have complementary roles in the same cellular processes. On the other hand, mRNAs associated with Stau259 and Stau262 were more similar. This suggests that these two isoforms might have more overlapping functions. Consistent with a model of post-transcriptional gene regulation, our results show that Stau1- and Stau2-mRNPs associate with distinct but overlapping sets of cellular mRNAs and that these mRNAs are nevertheless involved in common pathways. It is consistent with the high degree of sequence similarity between Stau1 and Stau2 that predicts that they may have conserved convergent functions and with the observation that they are distributed in distinct mRNP complexes in neurites. Knowing the importance of Stau2 in the transport of dendritic mRNA and to further understand the molecular mechanisms by which it modulates synaptic function, we decided to characterise Stau2-containing mRNPs in neurons. Using anti-Stau2 antibody to immunoprecipitate the mRNPs, we have identified a population of more than 1700 transcripts associated with Stau2 in embryonic rat brain. These mRNAs code for proteins involved in cellular processes such as post-translational modification, translation, intracellular transport and RNA metabolism. Interestingly, Stau2-associated mRNAs isolated form rat brains are relatively different from those isolated from HEK293 cells. This result suggests that the specificity of Stau2-mRNA association can differ from one tissue to the other. Similarly, we have identified the proteins presents in Stau2-containing complexes isolated from embryonic rat brains by a proteomic approach. We were able to determine the presence of mRNA-binding proteins (PABPC1, hnRNP H1, YB1 and hsc70), proteins of the cytoskeleton (α- and β -tubulin) and RUFY3 a poorly characterized protein. While PABPC1 and YB1 associate with Stau2-containing mRNPs through RNAs, hsc70 is directly bound to Stau2 and this interaction is regulated by ATP. The presence of the RNA-binding proteins YB1 and PABPC1, both involved in translation regulation, suggests that the expression of Stau2-bound mRNAs may be regulated at the level of translation initiation. Finally, it is well known that synaptic plasticity requires mRNA transport in dendrites and their local translation. Since the study of the neurophysiological role of Stau2 was already in progress we decided to concentrate our energy on the function of Stau1. Therefore, we studied the importance of Stau1 protein at the neurophysiological level, especially looking for a role in synaptic plasticity. We were able to demonstrate that Stau1 is required for the late form of long term synaptic potentiation, L-LTP, a plasticity dependent not only on local translation of mRNAs, but also on newly transcribed and transported mRNAs. Using hippocampal slices, we showed that Stau1 down-regulation by RNA interference prevents the development and/or maintenance of L-LTP. However, neurons displayed normal early-LTP, mGluR1/5-mediated long-term depression, or basal evoked synaptic transmission. In addition, at the cellular level, Stau1 down-regulation shifted spine shape from regular to elongated spines, without changes in spine density. The change in spine shape could be rescued by an RNA interference-resistant Stau1 isoform. Therefore, Stau1 is important for processing and/or transporting in dendrites mRNAs that are critical in regulation of synaptic strength and maintenance of functional connectivity changes underlying hippocampus dependent learning and memory. In conclusion we were able to further reveal the composition and the importance of the Stau1 and Stau2 mRNP. First, we have identified distinct and overlapping population of mRNAs associated to the diverse isoform of Stau, form HEK293 cells. Second, we were able to identify a population of neuronal transcript as well as some proteins factors present in the Stau2 particles. One of which, hsc70, is directly bound to Stau2 and its interaction is regulated by the presence of ATP. Finally, we have demonstrated the importance of Stau1 in the morphology of the dendritic spine as well as its fundamental implication in synaptic plasticity.

L’encéphalite limbique à auto-anticorps anti-CASPR2 est une atteinte du système nerveux central, caractérisée par la présence des auto-anticorps (autoAcs) dirigé contre CASPR2 dans le sérum et fluide céphalorachidien. La pathologie affecte majoritairement des hommes âgés présentant l’épilepsie comme symptôme prédominant. CASPR2 est une molécule d’adhésion neuronale, connue pour son rôle d’assemblage des canaux Kv1, régulateurs de l’excitabilité neuronale, à la région juxtaparanodale du nœud de Ranvier, une organisation essentielle pour la conduction saltatoire des flux nerveux. Un nombre croissant de données dans la littérature suggère un rôle pour CASPR2 dans des fonctions synaptiques et l’activité neuronale. Ceci pourrait expliquer l’épilepsie, un symptôme neurologique qui trouve son origine dans la perturbation de l’activité neuronale, observée chez les patients avec de l’encéphalite limbique anti-CASPR2. Dans ce travail de thèse, j’ai utilisé des autoAcs de patients comme outil pour investiguer le rôle de CASPR2 dans des neurones normalement développés en culture, permettant aussi d’évaluer l’effet des autoAcs des patients sur les fonctions synaptiques et de révéler des mécanismes physiopathologiques possibles sous-jacents à la maladie. Je me suis d’abord intéressée aux effets des autoAcs des patients sur l’expression et la distribution en surface de CASPR2 et sur l’expression des canaux Kv1.2 dans des neurones hippocampiques matures in vitro. J’ai montré que les neurones inhibiteurs sont positifs pour les canaux Kv1.2 et CASPR2 en surface, et que les autoAcs de patients augmentent l’expression de Kv1.2 et n’induisent pas l’internalisation de CASPR2. Dans un second temps, j’ai analysé les effets des autoAcs de patients sur les synapses excitatrices et inhibitrices dans des neurones hippocampiques immatures et matures in vitro. Dans les neurones immatures, la densité des épines dendritiques et le contenu des récepteurs AMPA sont augmentés, tandis que dans les neurones matures l’altération de la géphyrin suggère une perturbation de la transmission neuronale après traitement avec des autoAcs de patients. Mes résultats permettent de mieux comprendre les fonctions de CASPR2 dans les processus synaptiques et révèlent des mécanismes pathologiques possibles des autoAcs anti-CASPR2 menant à la présentation clinique des patients atteints d’encéphalite limbique anti-CASPR2 / Anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis is a central nervous system disorder, characterized by the presence of autoantibodies (autoAbs) directed against CASPR2 in the serum and cerebrospinal fluid. Elderly men are mostly affected, with epilepsy being the predominant symptom. CASPR2 is a neuronal cell adhesion molecule, known for its role in gathering Kv1 channels, regulators of neuronal excitability, at the juxtaparanodal region of the node of Ranvier, an essential organization for saltatory conduction of nervous influxes. Increasing sets of data in literature point out a role for CASPR2 in synaptic functions and neuronal activity. This could explain the observed epilepsy, a neurological symptom that finds its origin in disturbed neuronal activity, in patients with anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis. In this work, I used patients’ autoAbs as a tool to investigate the role of CASPR2 in normally developed cultured neurons which also allowed me to assess the effects of patients’ autoAbs on synaptic functions and reveal possible physiopathological mechanisms underlying the disease. I first assessed the effects of patients’ autoAbs on CASPR2 surface expression and distribution and on Kv1.2 channel expression in mature in vitro hippocampal neurons. I provided evidence that inhibitory neurons are positive for both Kv1.2 channels and surface CASPR2, and that patients’ autoAbs increase Kv1.2 expression and do not induce CASPR2 internalization. Secondly, I analyzed effects of patients’ autoAbs on excitatory and inhibitory synapses in vitro, in immature and mature hippocampal neurons. In immature neurons, dendritic spine densities and AMPA receptor content are increased, while in mature neurons alteration of gephyrin suggests disturbed neuronal transmission after treatment with patients’ autoAbs. My results allow for a better understanding of CASPR2 functions in synaptic processes and unravel possible pathological mechanisms regarding how anti-CASPR2 autoAbs lead to the clinical presentation of patients with anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis

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Une des principales caractéristiques de la maladie d'Alzheimer (MA) est l'accumulation intracérébrale du peptide neurotoxique Amyloïde β (Aβ) sous forme oligomérique et sous forme agrégée en plaques amyloïdes. Ce peptide est le produit du clivage de l'Amyloid Precursor Protein (APP) selon la voie amyloïdogène, voie pathologique suractivée dans la MA. La majorité des recherches, au cours des 25 dernières années, se sont concentrées sur les conséquences pathologiques de cette dérégulation, mettant au second plan la compréhension des fonctions physiologiques de l’APP. Cependant, de nombreuses études montrent que ses fonctions physiologiques pourraient être médiées par ses formes solubles (APPs). Dans la voie de clivage physiologique, la voie non-amyloïdogène, l’APP est clivé par l’α secrétase pour libérer l’APPsα, peptide disposant de propriétés neuroprotectrices et synaptotrophiques, essentielles au bon fonctionnement cérébral. Dans le contexte de la MA, la suractivation de la voie amyloïdogène va aboutir à la production de l’APPsβ au détriment de celle d’APPsα. Les conséquences fonctionnelles associées à la maladie d’Alzheimer pourraient ainsi être dues à la diminution de la production d’APPsα associée à une augmentation de la production d’APPsβ. Mon projet de thèse porta sur les conséquences mnésiques et fonctionnelles de la surexpression de ces deux formes et à leur potentiel thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer. Nous avons tout d’abord surexprimé l’APPsα dans les neurones de l’hippocampe de souris transgéniques APP/PS1ΔE9, modèle de la MA, qui présentent des déficits cognitifs et synaptiques. L’expression continue d’APPsα, à l’aide de vecteurs AAV, permet la restauration des performances mnésiques des souris, de la potentialisation à long terme (LTP) ainsi que du nombre d’épines dendritiques dans l’hippocampe. Ce sauvetage phénotypique s’accompagne de la diminution conjointe des niveaux d’Aβ et des plaques amyloïdes. Ceci serait en partie la conséquence de l’activation de la microglie, type cellulaire ayant la capacité d’internaliser et de dégrader l’Aβ. Mon second axe de recherche a consisté à étudier l’APPsβ dont l’implication dans la MA reste méconnue. Sa surexpression dans le modèle murin APP/PS1ΔE9 n’induit pas de restauration de la LTP ni de la mémoire spatiale. Néanmoins, l’injection d’APPsβ aboutit à la diminution de la concentration en Aβ solubles sans cependant réduire le nombre de plaques amyloïdes. Ce défaut pourrait-être la conséquence de l’absence d’activation microgliale. En résumé, mon travail de thèse montre que, contrairement à l’APPsβ, la surexpression d’APPsα pourrait contrecarrer l’évolution inéluctable de la maladie et en particulier en réduisant l’atteinte synaptique et mnésique caractéristique de la MA. Ces résultats renforcent une nouvelle voie d’action pour lutter contre la progression de la MA. L’utilisation de l’APPsα en tant qu’agent thérapeutique pourrait ainsi s’avérer être un élément important dans l’arsenal clinique de ces prochaines années. / One of the main characteristic of Alzheimer’s Disease (AD) is the intracerebral accumulation of the neurotoxic Amyloid β peptide (Aβ) either as oligomeric or aggregated forms known as the amyloid plaques. This peptide is produced via the Amyloid Precursor Protein (APP) processing following the amyloidogenic pathway, pathological pathway overactivated in AD. Most of the research performed during the last 25 years focused on pathogenic consequences of this dysregulation, deprioritizing the understanding of the APP physiological functions. Nonetheless, numerous studies show that these physiological functions might be mediated via APP soluble forms (APPs). In the physiological APP processing pathway, the non-amyloidogenic pathway, APP is cleaved by the α secretase, releasing the APPsα which display neuroprotective and synaptotrophic properties, essential for brain normal functions. In the context of AD, the amyloidogenic pathway overactivation leads to APPsβ overproduction at the expense of APPsα. Therefore, AD harmful consequences could be due to the decrease of APPsα concentration associated with an increase of APPsβ. My thesis project aimed to characterize mnemonic and functional properties following the overexpression of these two soluble forms of APP and their therapeutic potential in AD. We firstly overexpressed APPsα in hippocampal neurons of APP/PS1ΔE9 mice, animal model of AD, which display cognitive and synaptic deficits. The continual expression of APPsα, mediated via AAV viruses, enabled restoration of spatial memory, long-term potentiation and dendritic spines density in the hippocampus. This phenotypic rescue was accompanied with the decrease of both Aβ levels and amyloid plaques. This might be due to the activation of microglia, cell type able to internalize and degrade Aβ. In a second hand, I studied the involvement of APPsβ in AD, which remains poorly known. Its overexpression in APP/PS1ΔE9 did not induce neither LTP nor spatial memory restoration. However, APPsβ injection lead to the decrease of Aβ levels without reducing amyloid plaques. This default might be due to the lack of microglial activation. In conclusion, my thesis work show that, unlike APPsβ, APPsα overexpression might overcome the AD inevitable evolution by reducing synaptic and memory alterations, typical of AD. These results reinforce a new way of treatment to cope with AD progression. The use of APPsα as therapeutic agent might be an important tool for future AD therapies.