>Magister Scientiae - MSc / Insect-derived baculoviruses have been used extensively as a safe and versatile research model for transgenic protein expression. Preclinical studies have revealed the promising potential of Baculoviruses as a delivery vector for a variety of therapeutic applications, including vaccination, tissue engineering and cancer treatments. Coronaviruses are enveloped viruses containing linear, non-segmented ribonucleic acid. Human coronavirus NL63 was first discovered in the Netherlands in January 2004, where a 7-month-old girl presented with an acute respiratory tract infection that was later established to predominantly infect infants, the elderly and immunocompromised individuals. In addition to the known non-structural and structural proteins of coronaviruses, an accessory protein known as open reading frame 3 which is conserved in the Coronaviridae family has not been extensively researched. Open reading frame 3 encodes a putative membrane-bound protein. This study cloned the open reading frame 3 viral gene of 741 base pairs into the baculovirus expression construct via competent bacterial cell lines. Open reading frame 3-Baculovirus particles were generated in Spodoptera frugiperda insect cells. Recombinant cells containing the viral protein gene were used to infect healthy Spodoptera frugiperda 9 cells at varying ratios of multiplicity of infection over a fixed time-course. The open reading frame 3 viral protein was not detected by quantification methods at a molecular weight of 26 kilo Dalton, due to polyclonal antibody degradation.

Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularmente conhecida como faveiro, fava d\'anta ou faveleiro, é uma espécie nativa do Cerrado brasileiro, que apresenta registros de ocorrência por todo o Brasil Central. Sua principal importância econômica está associada às elevadas concentrações de rutina, um flavonóide alvo de muitos estudos farmacológicos e de largo emprego na indústria farmacêutica, sendo esta a segunda espécie mais utilizada como fonte de rutina no mercado mundial. Apesar do amplo uso econômico, sua exploração não apresenta características agrícolas, sendo realizada por vias extrativistas. Além disso, há carência de informações sobre sua biologia, o que torna a exploração um fator de risco à conservação. Há poucos estudos relacionados à sua composição química de seus órgãos e tecidos, além disso, estudos de germinação in vitro para obtenção de calos, suspensões celulares e clones não apresentaram sucesso. Este trabalho teve por objetivo desenvolver uma detalhada investigação da composição flavonoídica de folhas, flores, frutos, madeira, cascas, plântulas, embriões, exsudados radiculares de plântulas, e calos originados da desdiferenciação de diversos explantes pelo emprego da técnica de cromatografia de alta eficiência com detector de arranjo de diodos acoplado ao espectrômetro de massas, com o intuito de contribuir para uma maior compreensão da composição química de seus órgãos e tecidos, e assim, subsidiar novos estudos sobre a biossíntese de flavonoides, assim como, contribuir para a própria exploração racional dos recursos econômicos inerentes a essa espécie. Os resultados obtidos levam à conclusão de que nos diversos órgãos e tecidos de D. mollis investigados, predominam estereoisômeros de astilbina, rutina e quercitrina. Os calos apresentaram perfil flavonoídico muito simples, contendo apenas pequenas quantidades de apigenina, não sendo viáveis à obtenção de flavonoides de interesse por meio de seu cultivo. Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularmente conhecida como faveiro, fava d\'anta ou faveleiro, é uma espécie nativa do Cerrado brasileiro, que apresenta registros de ocorrência por todo o Brasil Central. Sua principal importância econômica está associada às elevadas concentrações de rutina, um flavonóide alvo de muitos estudos farmacológicos e de largo emprego na indústria farmacêutica, sendo esta a segunda espécie mais utilizada como fonte de rutina no mercado mundial. Alguns artigos acadêmicos reportam a detecção de propriedades tóxicas de extratos metanólicos de D. mollis sobre operárias de Apis mellifera, e atribuem a toxicidade ao flavonóide astilbina (3-β-Ο/-rhamnosideo de 5,7,3’,4’-tetraidroxi-2,3-diidroflavonol) isolado dos pedúnculos e flores. Seus resultados indicam que a astilbina reduziu a sobrevivência média das abelhas tratadas. Também é atribuída a astilbina a atividade inibidora sobre o desenvolvimento de larvas de Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepdoptera: Noctuidae) e Spodoptera frugiperda Smith (Lepdoptara: Noctuidae), relatando redução do peso corporal durante a fase larval e, prolongamento, tanto da fase larval quanto da fase pupal, para as duas espécies de lepidópteros, consideram a possibilidade de uso deste flavonóide como um biopesticida. Neste estudo, foram testadas as interferências de extratos flavonoídicos de diversos órgãos de D. mollis sobre o forrageio e o ciclo de vida de lagartas de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) e de adultos de Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae). Nenhum resultado negativo estatisticamente significativo foi observado no forrageio das duas espécies em questão. Tal resultado pode ser devido a uma tolerância desses animais aos flavonoides majoritários encontrados nos extratos, astilbina, rutina e quercitrina, ou ainda a mecanismos de detoxificação. / Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularly known as faveiro, fava d\'anta or faveleiro, is a native species of the Brazilian Cerrado, which has records of occurrence throughout the Central Brazil. Its main economic importance is associated with high concentrations of rutin, a flavonoid target of many pharmacological studies and widespread use in the pharmaceutical industry. D. mollis is the second most commonly used plant species as a source of rutin in the global market. Despite their broad economic use, their exploitation occurs in a very primitive way. In addition, there is no subsidiary information about their biology, which makes exploring this species a risk factor for its conservation. There are few studies that deals with the chemical composition of D. mollis organs and tissues, in addition, in vitro germination studies to obtain calluses, cell suspensions and clones showed no success. This work aimed to develop a detailed research flavonoid composition of leaves, flowers, fruits, wood, bark, seedlings, embryos, seedlings root exudates, callus using high performance liquid chromatography with diode array detector coupled to a mass spectrometer in order to contribute to a greater understanding of the chemical composition of their organs and tissues, and thus support new studies on flavonoid biosynthesis, as well as contribute to the very rational exploitation the financial resources inherent in this species. The principal constituents found were stereoisomers of astilbin, rutin and quercitrin. The callus culture presented a very simple flavonoid profile containing only small amounts of apigenin. Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularly known as faveiro, fava d\'anta or faveleiro, is a native species of the Brazilian Cerrado, which has occurrence records throughout the Central Brazil. Its main economic importance is associated with high concentrations of rutin, a flavonoid target of many pharmacological studies and widespread use in the pharmaceutical industry, which is the second species most commonly used as a source of rutin in the world market. Some scientific papers report toxic activities of methanol extracts of D. mollis on Apis mellifera of workers, and attribute the toxicity astilbin flavonoid (3-β-Ο-rhamnoside of 5,7,3’,4’-tetraidroxi- 2,3-diidroflavonol) isolated from the stems and flowers of this species. These results suggest that astilbin reduced the mean survival of the treated bees. Also is attributed to astilbin the inhibitory activity against the development of Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepdoptera: Noctuidae) larvae and Spodoptera frugiperda Smith (Lepdoptara: Noctuidae), reporting body weight loss during the larval stage and extending both larval and pupal stage for the two Lepidopterans. These results suggests the use of astilbin as a biopesticide. In the present study, was tested the interference of the flavonoid extracts from several D. mollis parts on the foraging and life cycle of both Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) larvae and adults of Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae). No statistically significant negative result was observed in foraging of both species concerned. This result may be due to a tolerance of these species to flavonoids majorly found in D. mollis extracts, astilbin, rutin and quercitrin, or due detoxification mechanisms.

A velocidade específica de respiração (QO2) é um parâmetro fundamental para entender-se o metabolismo e o estado fisiológico celular, fornecendo informações úteis para o processo e controle em biorreatores. Neste trabalho, cultivou-se diferentes células de insetos em ambiente controlado medindo-se o QO2 e concentração crítica de oxigênio (Ccrít). Foram utilizadas nos ensaios células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) não infectadas e células de Drosophila melanogaster (S2) selvagem e recombinantes, utilizadas na expressão de diferentes proteínas. Todas as experiências foram realizadas em biorreator Inceltech com volume de trabalho de 1L, mantido a temperatura de 28ºC, agitação de 100 rpm e oxigênio dissolvido (OD) a 40% da saturação de ar, com difusão por membrana de silicone com mistura gasosa (O2 e N2) e vazão gasosa constante. Foi utilizado meio de cultura Sf900II sem soro fetal bovino. O QO2 foi medido pelo método dinâmico e pelo balanço de oxigênio na fase líquida. Neste trabalho foi implementado um novo processo durante o método dinâmico para interromper completamente a transferência gasosa durante a execução deste método. Implementou-se também uma metodologia para medição de Ccrít. Chegou-se a concentrações máximas celulares (Xm), velocidades máximas específicas de respiração (QO2) na fase exponencial e Ccrít, conforme segue: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfectadas para expressão de GPV): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfectadas para expressão de EGFP): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfectadas para expressão de HBsAg): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. Conclui-se que as linhagens selvagens e transfectadas de S2 possuem entre si uma atividade respiratória diferente e também que as novas metodologias implantadas verificaram-se satisfatoriamente. / Specific respiration rate (QO2) is a key parameter to understand cell metabolism and physiological state, providing useful information for process supervision and control. In this work, we cultivated different insect cells in a very controlled environment, being able to measure QO2 and critical oxygen concentration (Ccrit). Wild Spodoptera frugiperda (Sf9) and wild and transfected Drosophila melanogaster S2 cells (able to produce different proteins) were used. All experiments were performed in 1-liter working volume Inceltech bioreactor, maintaining temperature controlled at 28ºC, agitation rate at 100 rpm, and dissolved oxygen (DO) at 40% of air saturation, through membrane diffusion of mixed gases (O2 and N2) at constant total flow rate. SF900II serum free medium was used. QO2 was measured through dynamic method and oxygen mass balance in the liquid phase. In this work a new process was implemented during the dynamic method to interrupt completely the oxygen transfer during the execution of this method. It was also implemented a methodology for measurement of Ccrít (determined when DO reduces its decay rate, without oxygen transfer). Maximum cell concentration (Xm), maximum specific respiration rate (QO2) in the exponential phase and Ccrít were reached, as follows: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfected for GPV expression): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfected for EGFP expression): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfected for HbsAg expression): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. From these results, it can be concluded that the studied cell lines have different respiration activity and the new developed methodologies behave satisfactorily.

Submitted by JOSIANE SANTOS DE OLIVEIRA (josianeso) on 2017-12-13T15:30:36Z No. of bitstreams: 1 Silvia Martins de Salles_.pdf: 1554119 bytes, checksum: 531304cc1d1683afbc987722d8e71530 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T15:30:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silvia Martins de Salles_.pdf: 1554119 bytes, checksum: 531304cc1d1683afbc987722d8e71530 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O desenvolvimento da resistência representa uma ameaça ao controle de pragas com a utilização de plantas Bt. A conservação de inimigos naturais pode contribuir para reduzir a evolução da resistência à soja Bt, e entre os insetos de interesse para uso no controle de espécies do gênero Spodoptera, os parasitoides têm sido considerados os mais importantes devido à sua eficiência e à sua especificidade em relação ao hospedeiro. Nessa perspectiva, este estudo teve como objetivo avaliar as interações de Spodoptera eridania (Lepidoptera: Noctuidae) e o endoparasitoide Dolichozele sp. (Hymenoptera: Braconidae), quando tratados com a soja Bt que sintetiza a proteína Cry1Ac. Para tanto, lagartas de S. eridania foram expostas aos seguintes tratamentos: (T1) não parasitadas e alimentadas com soja convencional, (T2) não parasitadas e alimentadas com soja Bt, (T3) parasitadas e alimentadas com soja convencional, (T4) parasitadas e alimentadas com soja Bt, e (T5) parasitadas e alimentadas com soja transgênica BRR. A biologia dos parasitoides descendentes de lagartas alimentadas com soja Bt foi avaliada através da observação da data de formação do casulo do parasitoide, a data de emergência, o sexo, a longevidade do parasitoide adulto e a sobrevivência. Na avaliação de preferência do parasitoide por lagartas alimentadas com soja Bt e soja não Bt, as lagartas receberam tempos de exposição diferentes à fêmea do parasitoide – a saber, 2h, 4h e 6h. Nos tratamentos com Dolichozele sp. isolados ou em conjunto com soja Bt, a mortalidade foi significativamente maior que o tratamento-controle (F= 63,5; gl= 4,14; p=0,001), apresentando mortalidade média de lagartas de 17,0 (T3), 20,2 (T4) e 17,5 (T5). Através dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA), foi possível detectar a presença da proteína Cry1Ac em folhas de soja Bt, fezes de S. eridania e em larvas de Dolichozele sp. Os parasitoides emergidos de lagartas alimentadas com soja Bt e soja RR evidenciaram diferenças significativas na fase de pupa (F= 15,058; gl=2; P=0,001) nos tratamentos T4 (16,6 dias) e T5 (17,08 dias), quando comparados com o controle, T3 (18,2 dias). Parasitoides submetidos ao T4 (lagartas alimentadas com soja Bt) apresentaram menor sobrevivência em relação aos outros tratamentos (Kaplan–Meier, Log Rank, X2 =8,22, gl=2, p = 0,016; Breslow, X2 =9,58, gl=2, P = 0,008; Tarone-Ware, X2 =9,94, gl=2, p = 0,007). Observou-se correlação positiva entre o tempo de exposição e a taxa de parasitismo de Dolichozele sp. em S. eridania (Rho de Spearman = 0,758, p=0,001). Portanto, os resultados deste estudo indicam que o parasitoide tem efeito positivo no controle de S. eridania, entretanto seu desenvolvimento e sua sobrevivência podem se influenciar pela presença da toxina Bt. Dolichozele sp. revelou potencial para agir de forma eficiente em estratégias de manejo da evolução da resistência às proteínas Cry em soja Bt, pois podem ajudar a suprimir as populações de pragas alvo e não alvo. / The development of insect resistance poses a threat to pest control using Bt plants. The conservation of natural enemies may contribute to reduce the evolution of Bt soybean resistance. Among the insects of interest for use in the control of species of the genus Spodoptera, parasitoids have been considered the most important due to their efficiency and specificity in relation to the host. In this way, this study aimed to evaluate the interactions of Spodoptera eridania (Lepidoptera: Noctuidae) and the endoparasitoid Dolichozele sp. (Hymenoptera: Braconidae) when treated with Bt soybean that synthesizes Cry1Ac protein. For this purpose, S. eridania larvae were exposed to the following treatments: (T1) non-parasitized and fed with conventional soybean; (T2) non-parasitized and fed with Bt soybean; (T3) parasitized and fed with conventional soybean; (T4) parasitized and fed with Bt soybean; and (T5) parasitized and fed with transgenic BRR soybean. The biology of the parasitoids descendant from larvae fed with Bt soybean was evaluated by observing the date of formation of the parasitoid pupa, date of emergence, sex, adult parasitoid longevity and survival. In the evaluation of the parasitoid preference for larvae fed with Bt soybean and non-Bt soybean, larvae received different exposure times to the parasitoid female, of 2h, 4h and 6h. In the treatments using Dolichozele sp. isolated or in conjunction with Bt soybean, mortality was significantly higher than the control treatment (F = 63.5; gl = 4.14; P = 0.001), with a mean larval mortality of 17.0 (T3), 20.2 (T4) and 17.5 (T5). Through the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), it was possible to detect the transfer of the Cry1Ac protein in S. eridania and Dolichozele sp.). The parasitoids emerged from larvae fed Bt soybean showed significant difference in the pupal phase (F = 15.058, gl = 2, P = 0.001) in the treatments T4 (16.6 days) and T5 (17.08 days) when compared as control T3 (18.2 days). The survival of the parasitoids that emerged from larvae fed with Bt soybean (T4) was lower (Kaplan-Meier, Log Rank, X2 = 8.22, gl = 2, p = 0.016, Breslow, X2 = 9.58, gl = 2, p = 0.008; Tarone-Ware, X2 = 9.94, gl = 2, p = 0.007). There was a positive correlation between the exposure time and the parasitism rate of Dolichozele sp. in S. eridania (Spearman's Rho = 0.758, p = 0.001). The results of this study indicate that the parasitoid has a positive effect on the control of S. eridania, however its development and survival may be influenced by the presence of the Bt toxin. Dolichozele sp. presented the potential to act positively in strategies to manage the evolution of resistance to Cry proteins in Bt soybeans, as they may help suppress pest populations.

Dentre as substâncias químicas secretadas pelas plantas, contra os insetos herbívoros, os inibidores de peptidases são de grande interesse. A atenção dada a esses inibidores deve-se ao fato, de eles serem uma boa alternativa no controle de insetos praga, uma vez que não causam danos ao meio ambiente. Contudo, muitas espécies de insetos são capazes de escapar dos efeitos negativos dos inibidores de peptidases das plantas, via diferentes mecanismos adaptativos. Devido a esse fato, é importante compreender os mecanismos desenvolvidos pelos insetos para burlar os efeitos dos inibidores de peptidases das plantas. Diante desse panorama, este trabalho teve como objetivo estudar o mecanismo adaptativo das serina endopeptidases de Spodoptera frugiperda aos inibidores de endopeptidases de soja. Foram realizadas análises do transcriptoma dos intestinos das lagartas mantidas em exposição crônica ao inibidor. Para averiguar os efeitos causados devido à exposição crônica ao inibidor, foram realizadas comparações da expressão relativa, dos genes de tripsinas e quimotripsinas, de intestinos de lagartas de sexto instar. Contudo, para entender o efeito da exposição aguda ao inibidor, lagartas de S. frugiperda foram criadas em dieta artificial controle até o primeiro dia do sexto instar, após esse período elas foram transferidas para dieta artificial acrescida com 0,5 % dos inibidores de endopeptidases de soja, durante 48 horas. Para verificar a ocorrência de um possível controle epigenético na expressão dos genes, as lagartas foram conduzidas até a fase adulta e os adultos, de cada tratamento, foram acasalados entre si, constituindo uma segunda geração. Dados de expressão relativa foram obtidos, de indivíduos da primeira e segunda geração, e foram então comparados. Foram identificados 14 possíveis genes de quimotripsinas e nove possíveis genes de tripsinas. Os genes de tripsina foram divididos em dois grupos distintos em relação a sua sensibilidade aos inibidores de endopepetidases de soja e expressão relativa. Houve uma resposta diferenciada na ativação dos genes de serina endopeptidases de S. frugiperda, a qual dividiu os genes em dois grupos, os responsivos e os não responsivos ao inibidor. A exposição aguda ao inibidor ativou um pequeno grupo de genes, enquanto que a exposição crônica promoveu uma maior amplitude de expressão gênica, sugerindo mecanismos temporalmente regulados. Por último, evidências indicam, pela primeira vez, a possível ocorrência de um mecanismo epigenético, na resposta das enzimas digestivas aos inibidores de serina endopeptidases de soja. / Among the chemicals secreted by plants against insect herbivores, peptidase inhibitors (PIs) are of great interest. The attention given to PIs is due to the fact that they are a good alternative to control insect pests since they do not cause damage to human health and the environment. However, many species of insects are able to escape the negative effects of PIs plants via different adaptive mechanisms. Because of this, it is important to understand the mechanisms developed by insects to circumvent the effects of PIs plants. Against this background, this research aimed to study the adaptive mechanism of serine endopeptidases Spodoptera frugiperda to soybean endopeptidase inhibitors. For this purpose, larvae of S. frugiperda were reared on artificial diet and control artificial diet plus 0.5% of endopeptidase inhibitors of soybean. We conducted a transcriptome midgut of worms maintained in chronic ingestion of the inhibitor. The relative expression of the genes, trypsin and chymotrypsin, was also compared the midgut of sixth instar larvae kept in these diets. In another experiment, the larvae were conducted to moth, then the treatments were mated forming a second generation. Relative expression data were obtained for individuals of the first and second generation, and then compared. Identified 14 genes with potential of chymotrypsin and 9 trypsin like genes. The trypsin gene were divided into two groups for both their sensitivity to PI soybean endopeptidase, and for their relative expression pattern. There was a differentiated response on the genes activation of S. frugiperda serina endopeptidases. The genes were clustered in 2 groups, the responsive ones and the non responsive to the inhibitor. The acute exposition to the inhibitor activated a small group of genes and the chronic exposition affected several genes, indicating the existence of temporal regulated mechanism. Besides, there is a possible occurance of an epigenetic mechanism, which is related to the digestive serina endopeptidases inhibitors of soybean.

A região anterior do intestino médio de Lepidoptera apresenta uma secreção microapócrina de enzimas digestivas com vesículas migrando pelo interior das microvilosidades. Essas vesículas brotam das microvilosidades intestinais como vesículas de membrana dupla e são descarregadas dentro do lúmen. O objetivo desse trabalho foi identificar as proteínas secretadas e aquelas envolvidas na maquinaria secretória microapócrina em Spodoptera frugiperda. Para isso, vesículas microapócrinas foram preparadas e usadas para a produção de anticorpo policlonal. Esse anticorpo foi utilizado para varrer uma biblioteca de expressão de cDNA do intestino médio de S. frugiperda. Também obtivemos um transcriptoma por pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos transcritos do intestino médio do mesmo inseto. Os clones positivos da varredura foram sequenciados, montados e submetidos a um BLASTN contra as sequências obtidas pelo pirosequenciamento, o que resultou na extensão dessas sequências. Usamos ainda as sequências geradas pelo pirosequenciamento para reanalisar sequências de proteínas presentes nas membranas microvilares, que tinham sido obtidas anteriormente em nosso laboratório (Ferreira et al., 2007). A reanálise das sequências de proteínas microvilares gerou 66 proteínas preditas. Dessas, 18 foram consideradas contaminantes de outros compartimentos celulares e 48 associadas às membranas microvilares. A análise das sequências obtidas das vesículas microapócrinas gerou 50 proteínas preditas que podem ser secretadas por essa rota. As sequências encontradas tanto em membrana microvilar quanto em vesículas microapócrinas podem ser classificadas em 8 grupos, de acordo com sua função: (1) enzimas digestivas; (2) proteínas da membrana peritrófica; (3) envolvidas com proteção; (4) transportadores; (5) receptores; (6) proteínas da maquinaria secretória; (7) proteínas de citoesqueleto; (8) com função desconhecida nesse local. Em ambas as preparações existem uma predominância de sequências de enzimas digestivas. Nas membranas microvilares a maioria das sequências são aminopeptidases, enquanto nas vesículas microapócrinas a maioria são lipases. Os cDNAs correspondentes as proteínas que poderiam estar envolvidas na maquinaria secretória foram clonados e sequenciados. São elas: fimbrina, cofilina, gelsolina-1 e miosina I. RT-PCRs semi-quantitativas dessas proteínas em diferentes tecidos do inseto (intestino, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça) mostraram que somente gelsolina-1 está presente exclusivamente no intestino. Os domínios G1-G3 da gelsolina característica do intestino (gelsolina-1) foram expressos e usados para produzir anticorpos em coelhos. Esses anticorpos reconhecem a proteína recombinante e uma proteína presente no epitélio intestinal com massa molecular compatível com a massa predita para gelsolina-1. Foi possível diminuir a expressão de gelsolina-1 utilizando RNA interferente. / Lepidoptera anterior midgut presents a microapocrine secretion of digestive enzymes with secretory vesicles migrating inside the microvilli. These vesicles bud from the midgut microvilli as double membrane vesicles and are discharged into the lumen. The aim of this work was to identify the proteins secreted and those involved in the microapocrine secretory machinery in Spodoptera frugiperda larvae. For this, microapocrine vesicles were prepared and used for polyclonal antibody production. This antibody was used to screen a cDNA expression library of S. frugiperda midgut. We also obtained a transcriptome by pyrosequencing a cDNA library derived from transcripts of the midgut. Positive clones from the screening were sequenced, assembled and N-blasted against S. frugiperda sequences obtained by pyrosequencing. This procedure led to the extension of the sequences previously obtained. We also used the sequences generated by pyrosequencing to reanalyze the sequences of microvillar membrane proteins obtained previously by Ferreira et al. (2007). This reanalysis generated 66 predicted proteins that are present in the microvillar membranes. Eighteen were considered to be contaminants from other compartments and 48 associated with the microvillar membranes. Analysing the sequences from microapocrine vesicles we found 50 predicted proteins that should be secreted by microapocrine vesicles. The sequences found in both microvillar membrane and microapocrine vesicles may be classified into 8 groups, according to their function: (1) digestive enzymes; (2) peritrophic membrane proteins; (3) protection; (4) transporters; (5) receptors; (6) secretory machinery; (7) cytoskeleton; (8) with unknown function. In both preparations there is a predominance of sequences of digestive enzymes. In microvillar membranes, there is a remarkable amount of aminopeptidases, while in microapocrine vesicles this is true for lipases. cDNAs coding for proteins that could be involved in the microapocrine secretory machinery were cloned and sequenced. They are: fimbrin, cofilin, gelsolin-1 and myosin I. Using RT-PCR, we showed that mRNAs coding for gelsolin-1 and myosin I are present only in the intestinal tissue. The mRNAs coding for other proteins were found in all tissues. The domains G1-G3 from gelsolin specific from intestinal midgut (gelsolin 1) were expressed and used to raise antibodies in rabbit. These antibodies were able to recognize the recombinant protein and a protein from the midgut epithelium that has a molecular weight similar to the one predicted from gelsolin-1 sequence. We succeed in decreasing the expression of gelsolin-1 by using interfering RNA

No epitélio do intestino médio de S. frugiperda encontra-se 90% da atividade de trealase solúvel. A trealase solúvel foi purificada até a homogeneidade por uma série de passos cromatográficos. A enzima possui um sítio hidrofóbico adjacente ao sítio ativo. Mudanças conformacionais aparentemente ocorrem quando metil-a-glicosídeo liga-se ao sítio ativo. A trealase solúvel é inibida competitivamente por amigdalina (Ki=0,21 mM), prunasina (Ki=0,92 mM), mandelonitrila (Ki = 1,14 mM), metil-α-glicosídeo (Ki=89 mM), metil-α-manosídeo (Ki=6,2 mM )e salicina (Ki= 19 mM). Florizina é um inibidor acompetitivo hiperbólico da trealase solúvel (Ki=0,087 mM, α =β =0,35) e seu aglicone floretina é um inibidor não competitivo (Ki=0,029 mM). Tris e mandelonitrila ligam-se a regiões diferentes da enzima enquanto mandelonitrila e floretina não podem ligar-se concomitantemente à enzima. Os pKs da enzima livre (pKe) e do complexo enzima substrato (pKes) foram determinados a partir de valores de Km e Vmáx/Km obtidos em vários pHs. Os valores encontrados foram: pKe1=4,47; pKe2=8,0l ; pKes1=4,83; pKes2=7,59. A trealase solúvel não perde a atividade quando incubada com reagentes que modificam grupos sufidrila, thiol e fenol. Com modificador de grupo imidazol, a enzima perde 60% da atividade somente na presença de metil-α-glucosídeo (inibidor competitivo da trealase). Essa modificação é protegida por trealose, indicando a presença de uma Histidina não essencial para catálise. Modificadores de grupo carboxila e guanidino inativam a enzima, com pKs de, respectivamente, 4,87 e 7,84. a similaridade desses pKs com os determinados cineticamente sugere que os resíduos envolvidos em catálise são uma arginina e um asparto ou glutamato. β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e seus aglicones inibem trealoses presentes em diferentes órgãos de várias ordens de insetos. Essa inibição foi menor em insetos que se alimentam somente de vegetais, provavelmente devido a uma adaptação desses organismos. / The epithelium of S. frugiperda midgut has a trehalase activity that is mainly soluble (90%). The soluble trehalase was purified by several chromatographic steps. The enzyme has an hydrophobic site near the active site. Conformational changes apparently occur in the enzyme when methyl-α-glucoside binds to the active site. Trehalase has a Km=0.37 mM and is a competitively inhibited by methyl-α-glucoside (Ki=89 mM); methyl-α-mannosideo (Ki=6.2 mM); amygdalin (Ki=0.21); prunasin (Ki=0.92 mM); mandelonitrile (Ki=l.14 mM); Tris (Ki=0.55 mM) and salicin (Ki=l9 mM). Phlorizin is an hyperbolic acompetitive inhibitor (α=β=0.35; Ki=0.0087 mM), whereas its aglycon, phloretin, is a non-competitive inhibitor (Ki=0.029 mM). Tris and mandelonitrile bind at the same region in the active site. On the other hand, mandelonitrile and phloretin cannot be bound to the enzyme at the same time. Enzyme pKs (pKe) and enzyme substrate pKs (pKes) were determined from Km and Vmax/Km values obtained at different pHs. The values are: pKe1=4.47; pKe2=8.0l ; pKes1=4.83; pKes2=7.59. Trehalase is not inactivated when incubated with compounds that react with thiol, imidazole or phenol groups. Trealase lose 60% of its activity in the presence of methyl-α-glucoside (acompetitive inhibitor) plus a compound that reacts with imidazole groups. This inactivation is decreased by trehalose, indicating that there is a non-essential histidine in the active site substances that react with carboxyl guanidine groups inactivate the enzyme. The modified groups have pH of respectively, 4.87 and 7.84. The resemblance of these pKs with the one determined from Km and Vmax values suggest that the prototropic groups of the enzyme are in residues of arginine and aspartic acid or glutamic acid. Toxic β-glucosides from plants and their aglycons inhibit trealase from different organs of insects from several orders. This inhibition is lower in herbivorous insects, possibly due to their adaptation in ingesting vegetal tissues.

No epitélio do intestino médio de S. frugiperda encontra-se 90% da atividade de trealase solúvel. A trealase solúvel foi purificada até a homogeneidade por uma série de passos cromatográficos. A enzima possui um sítio hidrofóbico adjacente ao sítio ativo. Mudanças conformacionais aparentemente ocorrem quando metil-a-glicosídeo liga-se ao sítio ativo. A trealase solúvel é inibida competitivamente por amigdalina (Ki=0,21 mM), prunasina (Ki=0,92 mM), mandelonitrila (Ki = 1,14 mM), metil-α-glicosídeo (Ki=89 mM), metil-α-manosídeo (Ki=6,2 mM )e salicina (Ki= 19 mM). Florizina é um inibidor acompetitivo hiperbólico da trealase solúvel (Ki=0,087 mM, α =β =0,35) e seu aglicone floretina é um inibidor não competitivo (Ki=0,029 mM). Tris e mandelonitrila ligam-se a regiões diferentes da enzima enquanto mandelonitrila e floretina não podem ligar-se concomitantemente à enzima. Os pKs da enzima livre (pKe) e do complexo enzima substrato (pKes) foram determinados a partir de valores de Km e Vmáx/Km obtidos em vários pHs. Os valores encontrados foram: pKe1=4,47; pKe2=8,0l ; pKes1=4,83; pKes2=7,59. A trealase solúvel não perde a atividade quando incubada com reagentes que modificam grupos sufidrila, thiol e fenol. Com modificador de grupo imidazol, a enzima perde 60% da atividade somente na presença de metil-α-glucosídeo (inibidor competitivo da trealase). Essa modificação é protegida por trealose, indicando a presença de uma Histidina não essencial para catálise. Modificadores de grupo carboxila e guanidino inativam a enzima, com pKs de, respectivamente, 4,87 e 7,84. a similaridade desses pKs com os determinados cineticamente sugere que os resíduos envolvidos em catálise são uma arginina e um asparto ou glutamato. β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e seus aglicones inibem trealoses presentes em diferentes órgãos de várias ordens de insetos. Essa inibição foi menor em insetos que se alimentam somente de vegetais, provavelmente devido a uma adaptação desses organismos. / The epithelium of S. frugiperda midgut has a trehalase activity that is mainly soluble (90%). The soluble trehalase was purified by several chromatographic steps. The enzyme has an hydrophobic site near the active site. Conformational changes apparently occur in the enzyme when methyl-α-glucoside binds to the active site. Trehalase has a Km=0.37 mM and is a competitively inhibited by methyl-α-glucoside (Ki=89 mM); methyl-α-mannosideo (Ki=6.2 mM); amygdalin (Ki=0.21); prunasin (Ki=0.92 mM); mandelonitrile (Ki=l.14 mM); Tris (Ki=0.55 mM) and salicin (Ki=l9 mM). Phlorizin is an hyperbolic acompetitive inhibitor (α=β=0.35; Ki=0.0087 mM), whereas its aglycon, phloretin, is a non-competitive inhibitor (Ki=0.029 mM). Tris and mandelonitrile bind at the same region in the active site. On the other hand, mandelonitrile and phloretin cannot be bound to the enzyme at the same time. Enzyme pKs (pKe) and enzyme substrate pKs (pKes) were determined from Km and Vmax/Km values obtained at different pHs. The values are: pKe1=4.47; pKe2=8.0l ; pKes1=4.83; pKes2=7.59. Trehalase is not inactivated when incubated with compounds that react with thiol, imidazole or phenol groups. Trealase lose 60% of its activity in the presence of methyl-α-glucoside (acompetitive inhibitor) plus a compound that reacts with imidazole groups. This inactivation is decreased by trehalose, indicating that there is a non-essential histidine in the active site substances that react with carboxyl guanidine groups inactivate the enzyme. The modified groups have pH of respectively, 4.87 and 7.84. The resemblance of these pKs with the one determined from Km and Vmax values suggest that the prototropic groups of the enzyme are in residues of arginine and aspartic acid or glutamic acid. Toxic β-glucosides from plants and their aglycons inhibit trealase from different organs of insects from several orders. This inhibition is lower in herbivorous insects, possibly due to their adaptation in ingesting vegetal tissues.

A região anterior do intestino médio de Lepidoptera apresenta uma secreção microapócrina de enzimas digestivas com vesículas migrando pelo interior das microvilosidades. Essas vesículas brotam das microvilosidades intestinais como vesículas de membrana dupla e são descarregadas dentro do lúmen. O objetivo desse trabalho foi identificar as proteínas secretadas e aquelas envolvidas na maquinaria secretória microapócrina em Spodoptera frugiperda. Para isso, vesículas microapócrinas foram preparadas e usadas para a produção de anticorpo policlonal. Esse anticorpo foi utilizado para varrer uma biblioteca de expressão de cDNA do intestino médio de S. frugiperda. Também obtivemos um transcriptoma por pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos transcritos do intestino médio do mesmo inseto. Os clones positivos da varredura foram sequenciados, montados e submetidos a um BLASTN contra as sequências obtidas pelo pirosequenciamento, o que resultou na extensão dessas sequências. Usamos ainda as sequências geradas pelo pirosequenciamento para reanalisar sequências de proteínas presentes nas membranas microvilares, que tinham sido obtidas anteriormente em nosso laboratório (Ferreira et al., 2007). A reanálise das sequências de proteínas microvilares gerou 66 proteínas preditas. Dessas, 18 foram consideradas contaminantes de outros compartimentos celulares e 48 associadas às membranas microvilares. A análise das sequências obtidas das vesículas microapócrinas gerou 50 proteínas preditas que podem ser secretadas por essa rota. As sequências encontradas tanto em membrana microvilar quanto em vesículas microapócrinas podem ser classificadas em 8 grupos, de acordo com sua função: (1) enzimas digestivas; (2) proteínas da membrana peritrófica; (3) envolvidas com proteção; (4) transportadores; (5) receptores; (6) proteínas da maquinaria secretória; (7) proteínas de citoesqueleto; (8) com função desconhecida nesse local. Em ambas as preparações existem uma predominância de sequências de enzimas digestivas. Nas membranas microvilares a maioria das sequências são aminopeptidases, enquanto nas vesículas microapócrinas a maioria são lipases. Os cDNAs correspondentes as proteínas que poderiam estar envolvidas na maquinaria secretória foram clonados e sequenciados. São elas: fimbrina, cofilina, gelsolina-1 e miosina I. RT-PCRs semi-quantitativas dessas proteínas em diferentes tecidos do inseto (intestino, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça) mostraram que somente gelsolina-1 está presente exclusivamente no intestino. Os domínios G1-G3 da gelsolina característica do intestino (gelsolina-1) foram expressos e usados para produzir anticorpos em coelhos. Esses anticorpos reconhecem a proteína recombinante e uma proteína presente no epitélio intestinal com massa molecular compatível com a massa predita para gelsolina-1. Foi possível diminuir a expressão de gelsolina-1 utilizando RNA interferente. / Lepidoptera anterior midgut presents a microapocrine secretion of digestive enzymes with secretory vesicles migrating inside the microvilli. These vesicles bud from the midgut microvilli as double membrane vesicles and are discharged into the lumen. The aim of this work was to identify the proteins secreted and those involved in the microapocrine secretory machinery in Spodoptera frugiperda larvae. For this, microapocrine vesicles were prepared and used for polyclonal antibody production. This antibody was used to screen a cDNA expression library of S. frugiperda midgut. We also obtained a transcriptome by pyrosequencing a cDNA library derived from transcripts of the midgut. Positive clones from the screening were sequenced, assembled and N-blasted against S. frugiperda sequences obtained by pyrosequencing. This procedure led to the extension of the sequences previously obtained. We also used the sequences generated by pyrosequencing to reanalyze the sequences of microvillar membrane proteins obtained previously by Ferreira et al. (2007). This reanalysis generated 66 predicted proteins that are present in the microvillar membranes. Eighteen were considered to be contaminants from other compartments and 48 associated with the microvillar membranes. Analysing the sequences from microapocrine vesicles we found 50 predicted proteins that should be secreted by microapocrine vesicles. The sequences found in both microvillar membrane and microapocrine vesicles may be classified into 8 groups, according to their function: (1) digestive enzymes; (2) peritrophic membrane proteins; (3) protection; (4) transporters; (5) receptors; (6) secretory machinery; (7) cytoskeleton; (8) with unknown function. In both preparations there is a predominance of sequences of digestive enzymes. In microvillar membranes, there is a remarkable amount of aminopeptidases, while in microapocrine vesicles this is true for lipases. cDNAs coding for proteins that could be involved in the microapocrine secretory machinery were cloned and sequenced. They are: fimbrin, cofilin, gelsolin-1 and myosin I. Using RT-PCR, we showed that mRNAs coding for gelsolin-1 and myosin I are present only in the intestinal tissue. The mRNAs coding for other proteins were found in all tissues. The domains G1-G3 from gelsolin specific from intestinal midgut (gelsolin 1) were expressed and used to raise antibodies in rabbit. These antibodies were able to recognize the recombinant protein and a protein from the midgut epithelium that has a molecular weight similar to the one predicted from gelsolin-1 sequence. We succeed in decreasing the expression of gelsolin-1 by using interfering RNA

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 984419 bytes, checksum: 33605a6daae90efa42a31afbfa576ba6 (MD5) Previous issue date: 2013-07-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The use of Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) based biopesticide has the potential to control Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), but large scale production depends on maximizing virus production from infected larvae. The suitable temperature, time of exposure to the pathogen, the age at which the larvae are inoculated with the virus, the viral solution concentration and isolate used are important for viral replication. The experiments were performed in the Biological Control Laboratory of Insects at Embrapa Maize and Sorghum Research Center (CNPMS), located in Sete Lagoas, Minas Gerais, Brazil. The first study aimed to verify the effect of inoculation and incubation (multiplication) temperatures in viral production and the inoculation period. Cannibalism among the larvae of S. frugiperda was similar (around 4%) in different periods and temperatures baculovirus inoculation. The inoculation period did influence mortality and viral production. The higher mortalities of larvae were achieved at 28 °C, however, the production of polyhedral inclusion bodies (PIB) per larvae were higher at 25 °C, reducing the number of larvae needed for the production of a dose of baculovirus expressed larval equivalent (LE/ha). The total production of polyhedral inoculation at the different temperatures was similar, but the incubation at 25 °C produced a larger amount of virus (24.56 x 109 PIB at 25 °C and 20.81 x 109 PIB at 28 °C). In the second study, the lethal concentrations were determined for larvae SfMNPV six, seven and eight days and the best age to perform the inoculation of SfMNPV order to maximize viral production. The lethal concentration (LC50) ranged from 1.89 x 105 to 5.01 x 106 PIB/mL. The LC50 I6 was higher than the I19 to six days old larvae of similar for seven days and for those less than eight days. Total polyhedra production was higher with eight days old larvae for the isolate I6. The highest yields were obtained in viral concentrations above 1.00 x 107 PIB/mL. The production of PIB/larvae increased when I6 was used in eight days old larvae, which reduces the number of larvae needed to achieve dose of baculovirus (LE/ha). The third study aimed to verify the production parameter which is more correlated with viral production, mass, or the number of dead larvae by SfMNPV and also determine the parameters weight equivalent per hectare (estimated larval weight necessary to achieve a dose of baculovirus, based on the application of 2.00 x 1011 PIB/ha) and larvae dead weight due to SfMNPV infection caused by I6. All correlations were positive and significant for the total weight (r= 0.958, n= 60, P< 0.0001) even when considered in each age or concentration separately. For the number of tracks the correlation was also significant when considering the amount of treatment (r= 0.723, n= 60, P< 0.0001) within each age group and in each concentration was significant only at concentrations of 1.00 x 106 PIB/mL (r= 0.643, n= 12, P< 0.0242) and 1.00 x 108 (r= 0.657, n= 12, P< 0.0202), but the correlations are less strong. Larvae of S. frugiperda, killed by SfMNPV inoculated at eight days old had the highest average mass. The equivalent weight per hectare did differ among different viral concentrations of solutions used. The maximization of viral production baculovirus for control of S. frugiperda should be made with the isolated I6 in larvae eight days old maintained at a temperature of 25 °C and the weight of dead larvae by baculoviruses can be considered a more reliable parameter than the number of larvae to produce a commercial product based SfMNPV in view that shows strong and significant correlation with the total polyhedra production. / A utilização de bioinseticida a base de Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) tem potencial para o controle de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), porém seu uso em larga escala depende de se maximizar sua produção a partir de larvas infectadas. A temperatura adequada, o tempo de exposição ao patógeno, a idade na qual as lagartas são inoculadas com o vírus, a concentração da suspensão viral e o isolado são importantes para a replicação viral. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Controle Biológico de Insetos do Centro Nacional de Pesquisas com Milho e Sorgo (CNPMS) da Embrapa em Sete Lagoas, Minas Gerais, Brasil. O primeiro estudo objetivou verificar o efeito das temperaturas de inoculação e incubação (multiplicação) na produção viral e do tempo de inoculação. O canibalismo entre as lagartas de S. frugiperda foi semelhante (em torno de 4%) nos diferentes tempos e temperaturas de inoculação do baculovírus. O tempo de inoculação não influenciou a mortalidade e a produção viral. A mortalidade de lagartas foi maior a 28 °C, porém, a produção de corpos poliédricos de inclusão (PIB) por lagarta foi maior a 25 °C, o que reduz o número de lagartas para a produção de uma dose de baculovírus formulado (dose para um hectare). A produção total de poliedros, nas diferentes temperaturas de inoculação, foi semelhante, mas a incubação a 25 °C produziu uma maior quantidade de vírus (24,56 x 109 PIB a 25 °C e 20,81 x 109 PIB a 28 °C). No segundo estudo as concentrações letais de SfMNPV foram determinadas para lagartas de seis, sete e oito dias e a melhor idade para se realizar a inoculação de SfMNPV visando a maximização de sua produção. As concentrações letais médias (CL50) variaram de 1,89 x 105 a 5,01 x 106 PIB/mL. A CL50 do isolado 6 (I6) foi maior que a do isolado 19 (I19) para lagartas de seis dias de idade, semelhante para lagartas de sete dias e menor para aquelas de oito dias. A produção total de poliedros foi maior com lagartas inoculadas aos oito dias de idade com o I6. As maiores produções virais foram obtidas nas concentrações acima de 1,00 x 107 PIB/mL. A produção de PIB/lagarta foi maior com o I6 em lagartas de oito dias, o que reduz o número de lagartas para a produção de uma dose de baculovírus formulado (dose para um hectare). O terceiro estudo objetivou verificar o parâmetro de produção mais correlacionado com a produção viral, a massa, ou o número de lagartas mortas por SfMNPV e determinar os parâmetros peso equivalente por hectare (massa estimada de lagartas necessárias para obtenção de uma dose de baculovírus formulado, tendo como base a aplicação de 2,00 x 1011 PIB/ha) e peso por lagarta morta devido à infecção pelo I6 de SfMNPV. Todas as correlações foram positivas e altamente significativas para o peso total (r= 0,958, n= 60 e P< 0,0001), mesmo quando consideradas dentro de cada idade ou concentração, separadamente. A correlação para o número de lagartas foi, também, significativa considerando-se o total de tratamentos (r= 0,723, n= 60 e P< 0,0001) e por idade. Por concentração, foi significativa apenas nas concentrações de 1,00 x 106 PIB/mL (r= 0,643, n= 12, P< 0,0242) e 1,00 x 108 PIB/mL (r= 0,657, n= 12, P< 0,0202), porém, as correlações foram menos fortes. Lagartas de S. frugiperda, mortas por SfMNPV, inoculadas aos oito dias de idade apresentaram a maior massa média. O peso equivalente de SfMNPV a ser utilizado por hectare não diferiu entre as concentrações de suspensões virais. A produção viral de baculovírus, para o controle de S. frugiperda, deve ser feita com o isolado I6 em lagartas de oito dias na temperatura de 25 oC. O peso de lagartas mortas por baculovírus pode ser considerado um parâmetro mais confiável que o número de lagartas para a produção de um produto comercial a base de SfMNPV, devido a correlação mais forte e significativa com a produção total de poliedros.