The purpose of this study was to investigate the ultrastructure of Tilletia caries teliospores. Specimens were prepared for viewing in the electron microscope by freeze-etching and thin-sectioning techniques. Thin-sectioning techniques gave excellent results with the teliospore walls and the lipid bodies within the teliospore but failed to adequately fix the membranes and internal organelle systems. Micrographs of Tilletia caries teliospores prepared using thin-sectioning show three major wall layers and two partition wall layers and abundant lipid bodies. The freeze-etch method of spore preparation proved superior to the thin-sectioning used in this study to reveal the internal organelle systems of the T. caries teliospore. The following anatomical details of teliospores were revealed using this technique: a multilayered spore wall, structural details of the plasma membrane, surface and cross-fractured views of the nucleus, details of the nuclear envelope, and surface and cross-fractured views of spherical bodies of unknown function.

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The Food and Drug Administration has recently expressed concern for the safety of seafood and seafood products. One of the concerns is the presence of Bacillus cereus in fresh blue crab meat. Bacillus cereus is a spore-forming pathogen whose spores survive the customary thermal treatments applied during cooking and pasteurization; therefore it could potentially present a health concern to consumers as the microorganism could increase to pathogenic levels. The objectives of this study were to evaluate the effects of a post-processing method i.e. high hydrostatic pressure treatment on the quality of fresh crab meat and to evaluate the effectiveness of high pressures on the inactivation of B. cereus spores. Fresh blue crab meat was pressurized at 300 and 550 MPa at 25° C for 5 min and stored at 4° C for 31 days to determine the pressurization effects on the microbiological, physical, and sensory quality of the meat. A pressure of 300 MPa caused a 1 log reduction in total aerobic plate count and a 3 day lag period, whereas 550 MPa inactivated 2 logs in total aerobic plate count with no evident lag phase. Physical and sensory qualities of pressurized crab meat were not statistically different from the untreated crab meat (P>0.05). A pressure of 300 MPa extended the shelf-life from 17 to over 24 days with the prevalence of Carnobacterium piscicola at the time of spoilage. Crab meat treated with 550 MPa was not rejected by sensory panels at day 31 and Enterococcus spp. was identified as the predominant microorganism. High hydrostatic pressure (550 MPa at 40° C for 15 min) inactivated less than 1 log (0.66 log) of B. cereus spores inoculated in fresh crab meat. The meat essentially had a protective effect on pressure inactivation of the spores. During storage (31 days), surviving B. cereus was suppressed and outgrown by the other pressure resistant microflora at a storage temperature of 12° C. At 4° C, B. cereus could compete with the other pressure-resistant microflora and was isolated even at the end of the storage period (day 31); however, diarrheal toxin was not detected in any stored samples. / Ph. D.

Les inconvénients associés à l’application des traitements thermiques élevés lors de la conservation des aliments sont nombreux, allant des coûts énergétiques élevés jusqu’à la détérioration de la valeur nutritive et organoleptique des aliments transformés. La tendance des consommateurs se dirige de plus en plus vers la consommation des aliments peu transformés, salubres et de haute valeur nutritive et sensorielle. Ainsi, afin de répondre à leurs besoins et pour minimiser les effets néfastes dus aux traitements thermiques élevés, le recours à de nouvelles techniques de conservation des aliments est devenu nécessaire. Ainsi, l’objectif principal de ce projet de doctorat était de trouver une nouvelle alternative aux traitements thermiques élevés afin de produire des aliments peu transformés ayant deux caractéristiques : une haute valeur nutritionnelle et organoleptique tout en étant salubre. Pour atteindre cet objectif, la technologie de l’électro-activation en solution, en combinaison avec des traitements thermiques modérés et de la nisine, a été mise à l’étude dans ce projet. Pour cela, huit solutions aqueuses (acétate et citrate de potassium avec et sans KCl) ont été électro-activées dans un réacteur d’électro-activation modulé avec des membranes échangeuses d’anions et de cations. Une fois électro-activées, ces solutions ont été combinées avec des températures modérées, entre 25 et 95 C, et d’une bactériocine de source naturelle, la nisine. Ainsi, l’activité synergique de différentes combinaisons impliquant ces trois facteurs a été testée dans des conditions modèles, ainsi qu’avec une matrice alimentaire végétale, sur l’inactivation des spores de Clostridium sporogenes PA 3679 utilisé comme un substitut non pathogène de Clostridium botulinum. Dans un premier temps, des solutions aqueuses d’acétate de potassium et de citrate de potassium, avec ou sans ajout de chlorure de potassium dans les deux cas, ont été électro-activées sous différentes intensités de courant électrique (100, 200, 300 et 400 mA) pendant une heure. Pour chaque type de solution, seules celles qui avaient le plus bas pH et le plus haut potentiel d’oxydoréduction (POR) ont été retenues pour la suite du projet. Par la suite, les solutions électro-activées retenues ont été testées, seules et combinées avec différents traitements thermiques modérés, pour leur effet d’inactivation des spores de C. sporogenes PA 3679 dans des conditions modèles. L’effet sporicide détecté a été validé par observation sous microscope électronique à transmission. Également, l’efficacité des traitements avec des solutions électro-activées, combinées avec la nisine à différentes concentrations, a été testée contre les spores de C. sporogenes PA 3679 dans une purée des haricots verts. Il a été démontré que ces solutions électro-activées induisaient une réduction significative des populations de spores de C. sporogenes PA 3679, mais le pouvoir tampon du milieu, induit par les matières organiques des haricots verts, a provoqué une baisse significative du degré d’inactivation des spores de C. sporogenes PA 3679 par rapport à celui détecté dans des conditions modèles. La combinaison de la nisine avec les solutions électro-activées et les traitements thermiques modérés était capable de récupérer une partie de l’activité sporicide initiale (obtenues dans des conditions modèles). L’activité sporicide finale obtenue a été validée par observation sous microscope électronique à transmission. Finalement, testée dans un milieu contenant des tiges intactes (entières) des haricots verts, une augmentation significative de l’activité sporicide a été détectée en combinant les solutions électro-activées d’acétate de potassium et de citrate de potassium avec la nisine et un traitement thermique modéré représentant le barème thermique utilisé pour le blanchiment des légumes (95 C). Ainsi, le pouvoir protecteur de la purée des haricots pour les spores de C. sporogenes PA 3679 a été mis en évidence. En conclusion, deux combinaisons permettant un traitement efficace contre les spores de C. sporogenes PA 3679 ont été suggérées. La première est une combinaison d’une solution d'acétate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 minutes combinée avec de la nisine à une concentration de 1000 UI/mL et un traitement thermique modéré de 95 °C pendant 15 minutes. La seconde consiste à combiner une solution de citrate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 minutes avec la nisine à une concentration de 1000 UI/ml et un traitement thermique de 115 °C pendant 15 minutes. / The severe heat treatments used for the preservation of foods, especially the canned, is associated with different disadvantages ranging from high energy costs of the process to the deterioration of the nutritional and organoleptic value of the processed foods. Currently, consumers are increasingly turning their attention to the consumption of safe, low-processed foods with high nutritional value and organoleptic value. Thus, in order to meet their needs (requirements) and to minimize the negative effects of the processing technologies, due to the high heat treatments, the search of new food preservation techniques is necessary. Thus, the main aim of this work was to find an alternative method of food preservation in order to produce low-processed foods with respect to two main characteristics: high nutritional value and microbial safety. To reach this objective, four aqueous solutions; namely potassium acetate and potassium citrate with or without KCl added, were electro-activated in an electro-activation reactor composed of three section separated by anion and cation exchange membranes. Once electro-activated, these solutions were combined with moderate heat treatments and nisin at different concentrations. The synergistic activity of all these factors (hurdles) was tested under model conditions and in a food matrix on the inactivation of Clostridium sporogenes PA 3679 spores, used as a non-pathogenic surrogate of Clostridium botulinum. First, the selected aqueous solutions were electro-activated at different current intensities (100, 200, 300 and 400 mA) during one hour. For each type of solution, only solutions with the lowest pH and highest oxido-reduction potential (ORP) were selected to be used in the present study. After that, the selected electro-activated solutions were tested, alone and in combination with moderate heat treatments, for their inactivation effect towards C. sporogenes PA 3679 spores under model conditions (direct contact between the electro-activated solutions and the spores). The obtained results showed high effectiveness of these solutions and the detected sporicidal effect was validated by observation under transmission electron microscope. Finally, the efficacy of the combined treatments was tested against C. sporogenes PA 3679 spores in a green bean puree. The obtained results showed some buffering capacity induced by the organic matter of the puree which was able to significantly decrease the degree of inactivation of C. sporogenes PA 3679 spores compared to the effect we detected in the model conditions. The combination of nisin with the electro-activated solutions and moderate heat treatments was able to recover the initial sporicidal activity which was obtained under the model conditions. The final sporicidal activity detected was validated under transmission electron microscopy. Moreover, this study showed that when tested in intact stems of green beans, the sporicidal activity was very high. These results permitted to validate the protective effect induced by the bean puree to the C. sporogenes PA 3679 spores. In conclusion, two combinations that can be successfully used as effective hurdle were selected. The first one is a combination of an electro-activated potassium acetate solution under 400 mA during 60 min, nisin at a concentration of 1000 IU/mL and a moderate heat treatment of 95 °C applied during 15 minutes. The second hurdle consists of combining an electro-activated solution of potassium citrate under 400 mA during 60 min with 1000 IU/ ml of nisin and a heat treatment of 115 °C applied during 15 minutes. Thus, according to the obtained results, it can be suggested that under appropriate canning conditions, the process can be limited to the blanching step which be conducted at 95 °C.

No / A novel ion trap time-of-flight hybrid mass spectrometer (qIT-TOF MS) has been applied for peptide sequencing in proteolytic digests generated from spore mixtures of Bacilli. The method of on-probe solubilization and in situ proteolytic digestion of small, acid-soluble spore proteins has been recently developed in our laboratory, and microorganism identification in less than 20 min was accomplished.1 In this study, tryptic peptides were generated in situ from complex spore mixtures of B. subtilis 168, B. globigii, B. thuringiensis subs. Kurstaki, and B. cereus T, respectively. MALDI analysis of bacterial peptides generated was performed with an average mass resolving power of 6200 and a mass accuracy of up to 10 ppm using a trap-TOF tandem configuration. Precursor ions of interest were usually selected and stored in the quadrupole ion trap with their complete isotope distribution by choosing a window of ±2 Da. Sequence-specific information on isolated protonated peptides was gained via tandem MS experiments with an average mass resolving power of 4450 for product ion analysis, and protein and bacterial sources were identified by database searching.

L’androgenèse est une biotechnologie végétale utilisée pour fixer le bagage génétique des plantes en une seule génération. Elle repose sur la capacité d’un grain de pollen immature, la microspore, à restaurer sa totipotence cellulaire végétale et se dédifférencier puis s’engager dans la voie de l’embryogenèse. Or, on observe que la capacité de la microspore à s’engager dans l’embryogenèse est génétiquement variable. En dépit des nombreux avantages qu’elle présente, l’androgenèse entraîne souvent une conséquence indésirable, soit une distorsion de la ségrégation (DS) chez les populations issues de cette biotechnologie. Ma thèse porte sur l’étude (i) du transcriptome de la microspore en transition entre la voie de développement du grain de pollen et celle de l’androgenèse et (ii) de la DS pour déterminer quand la DS survient dans le processus et où elle affecte le génome. J’ai utilisé l’orge comme espèce modèle pour mon étude. L’analyse transcriptomique a été réalisée sur la microspore isolée de l’anthère à trois stades, soit avant (jour 0) et immédiatement après (jours 2 et 5) l'application d'un traitement de stress visant à induire la voie de l’androgenèse. Je me suis intéressé à deux catégories de gènes; soit les gènes exprimés exclusivement à un stade précis et les gènes exprimés différemment lors de l’initiation de l’androgenèse. J’ai pu identifier des gènes exprimés exclusivement dans la microspore au jour 0 (11), 2 (34) ou 5 (367). Au jour 5, j’ai constaté l’induction de nombreux gènes codant pour des FT et des gènes impliqués dans la synthèse ou la transduction du signal de nombreux régulateurs de croissance. L’analyse des gènes exprimés différemment m’a permis d’identifier certains processus métaboliques qui sont activés/réprimés lors du passage de la microspore du jour 0 au jour 2 et du jour 2 au jour 5. Les gènes exprimés exclusivement à un stade précis du développement pourraient servir de marqueurs moléculaires indicateurs de la performance en androgenèse pour optimiser les protocoles de culture. Ensuite, la DS a été étudiée par une approche de génotypage à l’échelle génomique. J’ai d’abord développé une méthodologie d’analyse génotypique novatrice, reproductible et précise pour étudier la fréquence allélique sur un échantillon en composite. Cette méthode m’a permis d’étudier la fréquence allélique chez 1) des échantillons de microspores (avant et après l’application d’un stress), 2) des embryons et 3) des plantes régénérées. J’ai montré que la DS survenait à la fois lors du développement des embryons et la régénération des plantes. Aucune DS n’a été observée chez les échantillons de microspores. Mes résultats montrent que la sélection engendrant la DS s’opère au cours de la culture in vitro. Toujours à l’aide de cette méthode de génotypage en composite, j’ai identifié et comparé la fréquence et l’étendue de la DS chez 12 populations de lignées haploïdes doublées (HD). Dans cette seule étude, un plus grand nombre de populations de lignées HD (12) ont été caractérisées que ce qui avait été fait dans la somme de toutes les études antérieures dans la littérature scientifique. Nous avons montré que les régions de distorsion de ségrégation différaient beaucoup quant à leur position, leur étendue et l’amplitude de la distorsion d’un croisement à l’autre. La connaissance de ces allèles permettrait de prédire le potentiel androgénique des génotypes dans un programme de sélection. Mes travaux de thèse élèvent à l’ère des «omics» la recherche chez la microspore d’orge dans le système de l’androgenèse. À une échelle sans précédent, mon étude transcriptomique explore et décrit les changements d’expression génique au cours de la transition développementale de la microspore. Mon étude génomique identifie quand s’exerce la sélection engendrant la distorsion de la ségrégation des allèles dans ce système et décrit quelles régions chromosomiques sont affectées par cette distorsion. À la lumière de mes résultats, dans le dernier chapitre, je propose certaines pistes de recherche pour poursuivre l’étude des mécanismes moléculaires dirigeant la transition développementale de la microspore en androgenèse et pour développer des outils de génotypage afin d’utiliser la DS comme un outil d’amélioration génétique. / Androgenesis is a plant biotechnology used to fix the genetic background of plants in a single generation. This is based on the ability of an immature pollen grain, the microspore, to restore its totipotency, to dedifferentiate and then to engage in the path of embryogenesis. However, it is observed that the ability of the microspore to engage in embryogenesis is genetically variable. Despite the many desirable attributes of androgenesis, an undesirable side - effect is the segregation distortion (SD) encountered in populations resulting from this biotechnology. My thesis focuses on (i) the study of the transcriptome of microspores undergoing a developmental transition from the pollen - grain pathway towards embryogenesis and (ii) to identify when SD arises in the process and in which genomic regions it occurs. I used barley as a model species for my studies. Transcriptomic analysis was performed on microspores isolated from anthers at three stages corresponding to the microspore before (day 0) and immediately after (days 2 and 5) the application of a stress treatment aimed at inducing embryogenesis. I was interested in two categories of genes: those expressed exclusively at a specific stage of microspore development and those that were differentially expressed during the initiation of androgenesis. I was able to identify genes expressed exclusively in the microspore on day 0 (11), 2 (34) or 5 (367). On day 5, I found the induction of many genes encoding transcription factors (T Fs) in addition to genes involved in the synthesis or signal transduction of many growth regulators. The analysis of differentially expressed genes allowed me to identify certain metabolic processes that were activated/repressed during microspore development from day 0 to 2 and from day 2 to 5. Genes expressed exclusively at a specific stage of development could serve as molecular markers indicative of the performance in androgenesis to optimize isolated microspore culture protocols. Then, SD was studied using a whole - genome genotyping approach. I first developed an innovative, reproducible and accurate genotypic analysis methodology to determine allelic frequency on pooled samples. This method was then used to estimate allelic frequencies in samples of microspores (before and after the application of stress), embryos and regenerated plants. I showed that SD arises during both the development of embryos and the regeneration of plants. No SD was observed in samples of microspores. My results show that the selective forces promoting SD act during in vitro culture. Still using the same genotyping method performed on pooled samples, I identified and compared the frequency and extent of SD in 12 populations of doubled haploid lines (DH). A greater number of DH (12) populations were characterized in my study alone than the sum of all previous studies in barley. I showed that segregation distortion regions greatly differ in their position, extent, and magnitude in different DH populations. Knowledge of these alleles would be useful to predict the androgenic potential of a genotype in a breeding program. My dissertation has allowed research into barley microspores, or more widely androgenesis, to enter into the “omics” era. On an unprecedented scale, my transcriptomic study explores and describes the gene expression changes that occur during the developmental transition that the microspore undergoes in the course of androgenesis. My genomic study identifies when the selection (producing SD) arises in this system and describes which chromosomal regions are affected by this distortion. In light of my findings, in the final chapter I propose some lines of research to further study the molecular mechanisms driving the developmental transition from microspores to embryos and to develop genotyping tools to use SD as a genetic improvement tool.