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Consumer demand for fresher foods has necessitated the use of non-thermal technologies in processing milk. Two Dean Flow UV reactors (1/16" ID × 1/32" Thick & 1/8" ID × 1/32" Thick) were designed in the laboratory. The objective of this study was to examine the efficacy of designed UV reactors at four levels of Reynolds numbers (Re) on inactivation of Escherichia coli W 1485 cells and Bacillus cereus spores in raw cow milk (RCM), commercially processed skimmed cow milk (SCM) and raw soymilk (RSM). RCM, SCM and RSM were inoculated separately with E. coli W 1485 and B. cereus spores and were treated through the designed reactors for a residence time of 11.3 ± 0.1 s, equivalent to an UV dose of 0.05 J/ml in 1/16" ID reactor and 0.02 J/ml in 1/8" ID reactor. Four levels of Re were tested in the range of 181-1372. The influence of tube diameter (thickness of milk exposed to UV) and Re (indicator of turbulence) at constant residence time (11.3 ± 0.1 s) on inactivation of both the bacteria in both the UV reactors was analyzed using two-way ANOVA with proc GLM in SAS software. E. coli was inactivated to non-detectable levels (≥7.8 log10 CFU/ml) in SCM from the second level of Re (532.2) in 1/16" ID reactor. E. coli was also inactivated significantly (> 5logs) in RSM at the highest Re (1372) but this was not achieved in the case of RCM (712.7). Increasing the residence time to 14.2 s or greater (17 s) (equal to UV dose of 0.06 and 0.08 J/ml) inactivated E. coli cells to non-detectable levels in RCM using 1/16" ID reactor at the highest level of Re (712.7). Reduction of E. coli cells were in the range of 0.45-7.78 logs whereas B. cereus spores were in range of 1.06- 3.29 logs in all types of milk used in this study. The interaction effect of tube diameter and Re was statistically significant for E. coli cells in RCM, and SCM; B. cereus spores in SCM, and RSM (p < 0.05) whereas this was statistically non significant for E. coli cells in RSM and B. cereus spores in RCM (p > 0.05). Main effects of Reynolds number, and tube diameter were statistically significant (p < 0.05) on inactivation of B. cereus spores in RCM and E. coli cells in RSM. Inactivation efficiencies for both bacteria were higher in 1/16" ID reactor than 1/8" ID reactor. Using the 1/16" ID reactor at highest level of Re (RCM Re = 712.7, RSM Re = 1372), inactivation of standard plate count (SPC) present in RSM and RCM, and lipid oxidation during storage period (0, 1, 3 and 7 days) were measured. Inactivation of SPC in UV-treated RSM (3 logs) was lower than thermal pasteurization at 72°C for 20 s (7 logs). In case of RCM, the SPC was inactivated to 1.9 logs from 4.2 logs. Sensory evaluation (olfactory) of UV treated, untreated (milk passed through the 1/16" ID reactor while the UV lights turned off), and fresh RCM (control) suggested no change in flavor after treatment and upto 1 day after storage in refrigerated condition, but a perceivable change in the quality of UV treated and untreated cow milk were observed during the 3rd and 7th days when compared with fresh RCM (milked same day). RCM was treated with different UV dose levels (0.04, 0.05, 0.08, 0.12 and 0.16 J/ml) to examine the effect of UV light on malondialdehyde and other reactive substances using TBARS test kit. Reactive substances such as malondialdehyde content increased as the UV dose increased. The presence of malondialdehyde and other reactive substances were not significantly different (p < 0.05) in both thermal and UV-pasteurized soymilk; whereas these substances were found to be higher in UV-treated RCM after 7 days of storage than the untreated milk stored for 7 days at 4 °C and the fresh RCM. The designed reactors 1/16" ID and 1/8" ID reactors were useful to inactivate bacteria present in milk. But, the inactivation efficiency was more in 1/16" ID reactor than 1/8" ID reactor.

The prevalence of microsporidial infection among different species of exotic birds was screened using molecular methods. Moreover, the course of microsporidial spores excretion by naturally infected budgerigars was monitored during 30 days long period and subsequently, the site of the infection in tissues of these budgerigars was attempted to be located using histology, electron microscopy and molecular methods.

O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.

A água de coco, como comercializada atualmente, é esterilizada e adicionada de conservante químico ou antioxidante, o que ocasiona a redução de suas qualidades sensorial e nutricional. Para evitar esses efeitos indesejados tem se estudado o aquecimento da água de coco através da radiação por micro-ondas, o que possibilitaria uma bebida de melhor qualidade sensorial e sem adição de conservante ou com menor quantidade dessa substância. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a viabilidade da pasteurização da água de coco por micro-ondas, utilizando esporos de B. coagulans como indicador biológico do processo. Esporos de B. coagulans CCGB (LFB-FIOCRUZ) 1433 foram inoculados em amostras de água de coco, obtida diretamente de frutos verdes (Cocos nucífera L.) e previamente acidificada (ácido ascórbico e cítrico), seguida de pasteurização em micro-ondas com frequência de 2450 MHz. Os ensaios, provenientes de um Delineamento Central Composto Rotacional, com 4 variáveis (temperatura, quantidade e composição dos ácidos e potência do aparelho de micro-ondas) foram realizados aleatoriamente, com tempo de processo de até 20 minutos. Os testes foram conduzidos com 3 repetições do ponto central. Também foi realizado o processo em manta de aquecimento a fim de comparar os dois métodos. Os resultados da inativação foram expressos em log número de esporos/mL de água de coco. A temperatura é o fator preponderante para o processo de pasteurização da água de coco através da análise dos resultados obtidos pela DCCR. Também foi possível observar que, nas seguintes condições: a) potência de 120 W; b) 76 mg de ácidos adicionados à bebida e c) composição dos ácidos de 22% ascórbico e 78% cítrico, houve uma separação dos resultados em dois grupos. Um grupo à temperatura de 86 °C, em que, a redução da população de esporos foi menor (entre 0,5 log e 3,7 log número de esporos/mL de água de coco), e outro à temperatura de 92 °C, que apresentou maiores reduções logarítimicas do micro-organismo (entre 3,4 log e 7,0 log número de esporos/mL de água de coco). Realizado o teste ANOVA, ficou comprovado que o aumento predito foi significativo. Houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre o aquecimento por micro-ondas e o convencional. Porém, essa diferença não foi considerada uma vez que microbiologicamente pode ser desprezada. Quanto ao tempo de processo, são necessários, em média, 10 a 15 minutos de retenção na temperatura desejada para atingir o maior nível de inativação de esporos nas condições do ponto central (89 °C, 125 W, 75 mg de ácidos adicionados à água de coco e a composição desses ácidos de 75% cítrico e 25% ascórbico). A pasteurização da água de coco por micro-ondas mostrou-se viável, mas outros estudos são necessários para otimizar o processamento. / Coconut water, as currently marketed, is sterilized and added with chemical preservative or antioxidant, which reduces its sensory and nutritional qualities. In order to avoid these undesired effects, the heating of coconut water through microwaves radiation has been studied, which would allow a drink of better sensorial quality and without addition of preservatives or with reduced amount of these substances. The objective of this study was to evaluate the viability of the pasteurization of coconut water by microwave, using spores of B. coagulans as biological indicator of the process. Spores of B. coagulans CCGB (LFB-FIOCRUZ) 1433 were inoculated in samples of coconut water, obtained directly from green fruits (Cocos nucífera L.) and previously acidified (ascorbic and citric acid), followed by pasteurisation using microwaves with frequency of 2450 MHz. The tests, from a Rotational Composite Central Design, with 4 variables (temperature, quantity and composition of the acids and power of the microwave apparatus) were carried out randomly, with a process time of up to 20 minutes. The tests were conducted with 3 replicates of the central point. The conventional heating process was also carried out in order to compare the two methods. Inactivation results were expressed as log of spores /mL of coconut water. Temperature is the preponderant factor for the process of pasteurization of coconut water through the analysis of the DCCR. It was also possible to observe that, under the following conditions: a) power of 120W; b) 76 mg of acids added to the beverage and c) composition of acids of 22% ascorbic and 78% citric acid, the results were separated into two groups: one group at a temperature of 86 °C, where the reduction of the spore population was lower (between 0,5 log and 3,7 log of spores/mL of coconut water), and another one at a temperature of 92 °C, which presented higher logarithmic reductions of the microorganism (between 3,4 log and 7,0 log of spores/mL of coconut water). Once the ANOVA test was performed, it was verified that the predicted increase was significant. There was a difference statistically significant between conventional and microwave heating. However, this difference was not taken into account because microbiologically it could be neglected. As for processing time, an average of 10 to 15 minutes of retention at the desired temperature is required to achieve the highest level of inactivation of spores at the center point conditions (89 °C, 125 W, 75 mg of acids added to the cocnut water and the composition of acids of 75% cítrico e 25% ascórbico). The pasteurisation of coconut water by microwave has proved to be feasible, but other studies are needed to optimize processing.

Esporos de Bacillus subtilis podem ser utilizados como veículos vacinais capazes de expressar ou adsorver proteínas heterólogas em sua superfície. Estudos recentes indicaram que esporos de B. subtilis também conferem um forte efeito adjuvante para vacinas baseadas em proteínas purificadas administradas por via parenteral. Nesse cenário, o objetivo do presente projeto foi avaliar o papel adjuvante dos esporos de B. subtilis e viabilizar sua utilização como carregadores de vacinas de DNA pelo método da biobalística (gene gun). Nesta metodologia, os esporos foram utilizados como substitutos das micropartículas de ouro usualmente empregadas, mantendo a capacidade de transfecção de células eucarióticas in vitro, e produção de anticorpos específicos em camundongos C57BL/6 imunizados com o plasmídeo vacinal pgDE7h (que codifica para uma forma atóxica da oncoproteína E7 do HPV-16). Além disso, esporos de B. subtilis foram capazes de ativar células dendríticas in vitro e, quando coadministrados a pgDE7h pela via intramuscular, conferiram um aumento de 50% na proteção anti-tumoral de animais previamente transplantados com a linhagem tumoral TC-1 (que expressa a proteína E7 do HPV-16), em uma relação dose-dependente. / Bacillus subtilis spores can be used as vaccine vehicles capable of to display or adsorb heterologous proteins in its surface. Recent studies have indicated that spores of B. subtilis confer a strong adjuvant effect for vaccines based on purified proteins administered by the parenteral route. In this scenario, the objective of this project is to evaluate the adjuvant role of B. subtilis spores e viabilize its use as DNA vaccine carriers of biolistic method (gene gun). In this methodology, the spores are used as gold microparticles substitutes usually employed, maintaining the ability to transfect eukaryotic cells in vitro and production of specific antibodies in C57BL / 6 mice immunized with the vaccine plasmid pgDE7h (encoding a non-toxic form of the E7oncoprotein of HPV-16). Additionally, spores of B. subtilis were able to activate dendritic cells in vitro when co-administered intramuscularly to pgDE7h, conferring an increase of 50% of anti-tumor protection in animals previously transplanted with the TC-1 tumor cell line (expressing the E7 protein of HPV-16) in a dose-dependent manner.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-29T15:01:55Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T14:38:04Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-13 / As hepáticas são plantas avasculares, criptogâmicas, com alternância de gerações heteromórficas em seu ciclo de vida e constituem uma linhagem monofilética, a divisão Marchantiophyta. Nessas plantas, o estabelecimento no ambiente ocorre através de reprodução assexuada ou sexuada, mas a produção e a germinação dos esporos permitem a colonização de novos ambientes e substratos. Possuem gametófitos folhosos ou talosos, achatados dorsiventralmente, rizóides unicelulares e esporófitos aclorofilados. As Frullaniaceae Lorch compreendem hepáticas folhosas, medianas a robustas, com características que podem ser interpretadas como adaptação ao epifitismo, como lóbulos sacados, seta curta e germinação endospórica. Estão representadas pelo gênero Frullania Raddi, com 38 espécies no Brasil. O presente trabalho teve por objetivos realizar o estudo palinológico das espécies de Frullaniaceae, através de estudos morfológicos e ultraestruturais dos esporos; analisar as estratégias ecológicas das espécies estudadas, relacionando-as à morfologia dos esporos e acompanhar os estágios germinativos e o desenvolvimento dos esporos de Frullania ericoides (Nees) Mont, sob diferentes concentrações do meio de cultura. Os resultados obtidos permitem observar que os esporos das espécies da família Frullaniaceae possuem tamanho do diâmetro maior variando de médio a grande (33,3 a 63,3 micrômetros). Foram observados dois tipos morfológicos distintos baseados na elaboração da ornamentação da superfície dos esporos. A espessura dos estratos do esporoderma permitiu separação das espécies em subgrupos, que não refletiram a classificação taxonômica atual. A germinação de F. ericoides foi endospórica, com divisão e proliferação celular, formando um protonema globoso, com ocorrência tardia da quebra da parede do esporo. Ao longo do período do estudo, os esporos submetidos aos tratamentos de concentração mais fraca apresentaram melhores resultados quanto ao desenvolvimento do protonema. Os filídios primordiais são fortemente côncavos, com margem inteira e parede celular fina. Os resultados deste estudo demonstraram a importância taxonômica e o potencial das técnicas de culturas de tecidos para os estudos de germinação de esporos de briófitas. / Liverworts are nonvascular and cryptogamic plants, with heteromorphic alternation of generations in their life cycle, consisting on a monophyletic lineage, the division Marchantiophyta. In these plants, establishment occurs by asexual or sexual reproduction, but the production and germination of spores enables colonization of new habitats and substrates. Marchantiophyta differ from the others divisions by leafy or thallose gametophyte, dorsi-ventral orientation, unicellular rhizoids and non chlorophyllous sporophytes. Frullaniaceae Lorch include leafy liverworts, median to robust, highly branched, with features that can be interpreted as adaptation to epiphytism, such as saccate lobes, short seta and intracapsular germination. The family includes cosmopolitan species, but it’s more diverse in the tropics. There is one genus, Frullania Raddi, with 38 species in Brazil. This study aimed to perform palynological study of Frullaniaceae species through morphological and ultrastructural studies; and to evaluate the relationship of the features of the spores to ecological strategies of species, and to follow germination and sporeling development in Frullania ericoides (Nees) Mont., under different concentrations of culture media. The spores of Frullaniaceae species have larger diameter with size ranging from medium to large (33.3 to 63.3 micrometers). Two distinct morphological types, based on the spore surface ornamentation, were observed and are not related to the taxonomic organization of the family. The thickness of sporoderm strata allowed the separation of the species into two large groups, which also did not confirm the taxonomic classification. The germination was endosporic, showing cell division and proliferation, forming a globose protonema, without spore wall break. Throughout the period of study, the spores undergo the lowest concentration treatments showed better results of development. Primordial leaves are highly concave, with entire margins and a thick cell wall. The results of this study demonstrate the taxonomic importance and the potential of tissue culture techniques for bryophyte spore studies.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-06-14T15:03:52Z No. of bitstreams: 1 marcelladealmeidapassarella.pdf: 2836466 bytes, checksum: fbbb0b0cabcf2306412b24731f01fa85 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-06-27T14:43:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marcelladealmeidapassarella.pdf: 2836466 bytes, checksum: fbbb0b0cabcf2306412b24731f01fa85 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-27T14:43:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcelladealmeidapassarella.pdf: 2836466 bytes, checksum: fbbb0b0cabcf2306412b24731f01fa85 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / A família Rhabdoweisiaceae Limpr. inclui musgos acrocárpicos, de tamanho pequeno a médio, que crescem, predominantemente como tufos e ocorrem, geralmente, sobre rochas e solo. A circunscrição da família é controversa, sendo sua monofilia sustentada por dados moleculares. O presente trabalho tem como objetivo realizar o estudo palinológico de espécies de Rhabdoweisiaceae Limpr. ocorrentes nas Américas e interpretar as relações entre as características palinológicas e as estratégias ecológicas das espécies estudadas, que pertencem aos gêneros Amphidium Schimp.; Arctoa Bruch & Schimp.; Cynodontium Schimp; Dichodontium Schimp.; Dicranoweisia Lindb. ex Milde; Kiaeria I. Hagen; Oncophorus (Brid.) Brid.; Oreas Brid.; Oreoweisia (Bruch & Schimp.) De Not.; Rhabdoweisia Limpr. Os esporos foram observados sob microscópio de luz antes e após acetólise e sob microscópio eletrônico de varredura e de transmissão. Para a avaliação das relações entre a morfologia dos esporos e as estratégias ecológicas foi realizada a análise de agrupamento, considerando os tipos de elementos de ornamentação, espessura do esporoderma polaridade, condição de tamanho, área apertural, forma de vida e substrato. As espécies estudadas apresentam esporos de tamanho pequeno a médio, com simetria radial e âmbito subcircular, são heteropolares ou apolares. O esporoderma é formado por intina, exina e perina. Os elementos de ornamentação permitiram a caracterização de quatro tipos morfológicos. Das 23 espécies estudadas, nove, incluídas em três gêneros apresentam esporos anisomórficos, sendo aqui relatados pela primeira vez. Os esporos das espécies de Amphidium Schimp. apresentam características palinológicas que permitem diferenciá-las das demais espécies integrantes de Rhabdoweisiaceae Limpr. Os padrões de ornamentação da superfície do esporoderma mais frequentes foram o baculoide e o granuloide; cerca de 80% das espécies analisadas apresentam área apertural diferenciada; dentre as carcterísticas ecológicas, rocha foi o substrato mais frequente, seguido por solos e a maioria das espécies apressentm tufo como forma de vida. As espécies de Rhabdoweisiaceae Limpr. analisadas neste trabalho foram agrupadas através de características palinológicas e ecológicas. / The family Rhabdoweisiaceae Limpr. includes small to medium sized acrocarpic mosses that grow predominantly as tufts and usually occur on rocks and soil. The circumscription of the family is controversial, and its monophyly is supported by molecular data. The present work aims to carry out the palynological study of species of Rhabdoweisiaceae Limpr. occurring in the Americas and to interpret the relationships between the palynological and ecological strategic characteristics of the species studied, which belong to the genera Amphidium Schimp.; Arctoa Bruch & Schimp.; Cynodontium Brid.; Dichodontium Schimp.; Dicranoweisia Lindb. ex Milde; Kiaeria I. Hagen; Oncophorus (Brid.) Brid.; Oreas Brid.; Oreoweisia (Bruch & Schimp.) De Not.; Rhabdoweisia Limpr. The spores were observed under light microscopy before and after acetolysis and under scanning and transmission electron microscopy. For the evaluation of the relationships between the spore morphology and the ecological strategies, the grouping analysis was performed considering the types of ornamentation elements, sporoderma polarity thickness, size condition, aesthetic area, life form and substrate. The species studied present small to medium spores, with radial symmetry and subcircular extent, are heteropolar or nonpolar. The sporoderm is formed by intina, exina and perina. The ornamentation elements allowed the characterization of four morphological types. Of the 23 species studied, nine, included in three genera present anisomorphic spores, being reported here for the first time. The spores of Amphidium Schimp. species have palynological characteristics that allow them to differentiate them from the other Rhabdoweisiaceae Limpr species. The most frequent patterns of ornamentation of the sporoderm surface were baculoid and granuloid; about 80% of the analyzed species present a distinct aperural area. Among the ecological characteristics, rock was the most frequent substrate, followed by soils and most species apressentm tuff as a way of life. The species of Rhabdoweisiaceae Limpr. analyzed in this work were grouped through palynological and ecological characteristics.

Orientador: Angélica Zaninelli Schreiber / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SilvaFonseca_AdenilzaCristinada_M.pdf: 2857134 bytes, checksum: 9329779ba094b04efc1a51c3932a5dfd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Mucormicose é uma infecção oportunista invasiva causada por fungos filamentosos denominados de Mucorales, antes Zygomycetes, de difícil tratamento e, com mau prognóstico em pacientes imunocomprometidos, caracterizada por manifestações rinocerebrais, pulmonares ou disseminadas. Espécies dos gêneros Rhizopus, Mucor, Absidia (Lichtheimia) e Rhizomucor, são os Mucorales mais isolados de pacientes. São micro-organismos resistentes a voriconazol e equinocandinas in vitro e in vivo. A terapia inclui a reversão dos fatores predisponentes, retirada cirúrgica da área infectada e administração de antifúngicos, em geral, anfotericina B, de atividade terapêutica limitada e muitos efeitos colaterais. Objetivos: Identificação dos isolados de Mucorales selecionados para o estudo por metodologia clássica e técnicas moleculares; padronização da técnica de microdiluição em caldo para avaliação de suscetibilidade aos antifúngicos isolados: anfotericina B; 5-fluorocitosina; fluconazol; micafungina; itraconazol; voriconazol; miconazol e terbinafina de outros gêneros de Mucorales que não Rhizopus spp.; avaliação da Concentração Inibitória Fracional para determinação do tipo de interação que ocorre entre as combinações de antifúngicos anfotericina B x itraconazol; anfotericina B x voriconazol; terbinafina x itraconazol; terbinafina x voriconazol e terbinafina x anfotericina B; padronização da metodologia de avaliação dinâmica de crescimento para o gênero Rhizopus sp. e Rhizopus oryzae (LIF 1832), para possível estabelecimento de correlação clínico-laboratorial já que este foi isolado de um paciente em tratamento de mucormicose. Metodologia: Estudo realizado com 10 isolados clínicos de Mucorales com identificação morfológica prévia de gênero. A identificação molecular foi realizada com os iniciadores ITS1/ITS4; ITS4/ITS5 e NL1/NL4. Os testes de suscetibilidade aos antifúngicos isolados, in vitro, foram realizados pelo método de microdiluição em caldo (CLSI M38-A2). Os antifúngicos combinados foram analisados de acordo com a metodologia do "tabuleiro de xadrez". Já a avaliação dinâmica de crescimento de hifas frente aos antifúngicos anfotericina B, itraconazol e terbinafina para o isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) foi realizada através do sistema Biocell-Tracer?. Resultados: As identificações morfológica e molecular foram discordantes para os isolados LIF 1237 e 1832, classificados morfologicamente como Absidia (Lichtheimia) sp. e Rhizomucor sp. e identificados como Rhizopus oryzae após sequenciamento de DNA. Considerando todos os isolados, as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram de: 8 a ? 16 µg/mL para micafungina, de 0,25 a 8 µg/mL para anfotericina B, ? 64 µg/mL para 5-fluorocitosina, de 16 a ? 64 µg/mL para fluconazol, de 1 a > 8 µg/mL para itraconazol, > 8 µg/mL para voriconazol; de 0,25 a 4 µg/mL para miconazol e de 0,031 a > 128 µg/mL para terbinafina. As interações resultantes da combinação de antifúngicos foram de: 100% de sinergismo entre anfotericina B x voriconazol e anfotericina B x itraconazol; 90% de sinergismo entre terbinafina x itraconazol; 80% de sinergismo entre terbinafina x voriconazol e 100% de sinergismo para a combinação de terbinafina x anfotericina B. As taxas de inibição de crescimento das hifas do isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente aos valores de CIMs obtidos pelo método de microdiluição em caldo foram: 88.25% para anfotericina B; 0% para itraconazol e 98,70% para terbinafina. O teste com a combinação de concentrações séricas de itraconazol e terbinafina resultaram em 49,8% de taxa de inibição. Conclusões: Foi observada divergência entre identificação morfológica e molecular para dois isolados. Perfis diferentes de sensibilidade aos antifúngicos foram observados dependendo das espécies. Os antifúngicos mais ativos contra a maioria dos isolados foram anfotericina B e itraconazol. Valores de CIM bem baixos para terbinafina foram observados para Cunninghamella bertholletiae e Syncephalastrum racemosum e todos os isolados foram altamente resistentes a micafungina, 5-fluorocitosina, fluconazol e voriconazol. Os testes de antifúngicos combinados mostraram redução da CIM dos antifúngicos em associação. CIMs elevadas para terbinafina foram observadas para os isolados de R. oryzae e R. stolonifer enquanto que no teste de combinação valores baixos de CIMs foram encontrados, o que ressalta a importância da combinação de antifúngicos no manejo de mucormicose. A taxa de inibição do crescimento das hifas para o isolado LIF 1832 frente aos antifúngicos isolados sugere que hifas podem ser mais suscetíveis que esporos frente aos antifúngicos avaliados. Apesar de não muito alta, a taxa de inibição de crescimento das hifas frente à anfotericina B e à combinação das concentrações séricas de terbinafina e itraconazol pode estar favoravelmente relacionada ao desfecho clínico do paciente em tratamento de mucormicose / Abstract: Introduction: Mucormycosis is an invasive opportunistic infection caused by filamentous fungi called Mucorales (formerly Zygomycetes), difficult to treat, and with poor prognosis in immunocompromised patients, characterized by rhino-cerebral, pulmonary or disseminated manifestations. Species of the genera Rhizopus, Mucor, Absidia (Lichtheimia) and Rhizomucor are the Mucorales most commonly isolated from patients and show resistance to voriconazole and echinocandins in vitro and in vivo. Therapy includes to reverse predisposing factors, surgical removal of the infected area and administration of antifungal agents, in general, Amphotericin B, with limited therapeutic activity and many side effects. Objectives: identification of selected Mucorales isolates by morphological and molecular methods; standardization of broth microdilution for antifungal susceptibility assessment of other Mucorales genera except Rhizopus to the alone antifungals: amphotericin B, fluorocytosine, fluconazole, Itraconazole, voriconazole ; miconazole and terbinafine; establish Fractional Inhibitory Concentration to determine the type of interaction that occurs between combinations of Amphotericin B/Itraconazole; Amphotericin B/Voriconazole; Terbinafine/Itraconazole; Terbinafine/Voriconazole and Terbinafine/Amphotericin B; standardization of the dynamic growth methodology for evaluation Rhizopus sp. and study of isolate Rhizopus oryzae (LIF 1832), for possible establishment of clinical-laboratory correlation this was isolated from a patient undergoing treatment for mucormycosis. Material and Methods: This study evaluated 10 clinical Mucorales isolates with previous morphological gender identification. The molecular identification was performed with primers ITS1/ITS4; ITS4/ITS5 and NL1/NL4. The antifungal susceptibility in vitro was performed by broth microdilution method (CLSI M38-A2). Antifungal combinations were analyzed according to the "chessboard" methodology . The dynamic evaluation of hyphal growth for the isolate Rhizopus oryzae (LIF 1832) for the antifungals amphotericin B, terbinafine and itraconazole, was carried through the BioCell-Tracer system. Results: The morphological and molecular identifications were discordant for LIF 1237 and LIF 1832 isolates, classified morphologically as Absidia (Lichtheimia) sp. and Rhizomucor sp. and after DNA sequencing both as Rhizopus oryzae. Considering all isolates, the minimum inhibitory concentrations (MICs) were 8 to ? 16 µg/mL for Micafungin; from 0.25 to 8 µg/mL for Amphotericin B , ? 64 µg/mL for 5 ¿ Fluorocytosine; of 16 to ? 64 µg/mL for Fluconazole; 1 to > 8 µg/mL for Itraconazole; > 8 µg/mL for Voriconazole ; 0.25 to 4 µg/mL for Miconazole and from 0.031 to > 128 µg/mL for Terbinafine. Interactions resulting from the combination of antifungals were: 100% synergism for Amphotericin B/Voriconazole and Amphotericin B/Itraconazole; 90% synergism between Terbinafine/Itraconazole; 80% synergism between Terbinafine/Voriconazole and 100% synergism for the combination Terbinafine/ Amphotericin B. The hyphae growth inhibition rates obtained for microdilution method MIC values for Rhizopus oryzae (LIF 1832) were 88.25%, for Amphotericin B; 0% for itraconazole and 98.70% to terbinafine. Combined Itraconazole and Terbinafine serum concentrations showed 49.8% of growth inhibition rate. Conclusions: Divergence between morphological and molecular identification for two isolates was observed. Different antifungal susceptibility profiles were observed depending on the species. The most active antifungal agents were Amphotericin B and Itraconazole. MICs for Terbinafine very low were observed to the Syncephalastrum racemosum and C.bertholletiae and all isolates were highly resistant to Micafungin, 5- Fluorocytosine, Fluconazole and Voriconazole. It was possible to observe antifungal MIC reduction in combined tests. MICs high for terbinafine alone were observerd to the Rhizopus oryzae and Rhizopus stolonifer while in the combo test low MIC values were observed, which highlights the importance of combining antifungal drugs in the management of mucormycosis. The hypha growth inhibition rates obtained for Rhizopus oryzae (LIF 1832) against antifungal isolates suggest that hyphae may be more susceptible to antifungal agents against spores. Although not too high, the hyphae growth inhibition rate obtained for the combination serum achievable concentrations of Terbinafine and Itraconazole can probably be related to the clinical outcome / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Orientador: Arnaldo Yoshiteru Kuaye / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campionas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tsuchiya_AnaClaudia_M.pdf: 449310 bytes, checksum: 3afe68453ac7a3b16148cef90be5c03f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Clostridium difficile é um bacilo anaeróbio responsável por doença intestinal associada ao tratamento prévio com antibióticos, manifestando desde uma diarreia leve até casos graves de colite pseudomembranosa causada principalmente pelas toxinas A (TcdA) e B (TcdB). Os casos de infecção estão relacionados à contaminação em hospitais, porém pesquisas recentes sugerem possível associação ao consumo de alimentos contaminados, pois C. difficile já foi isolado de bovinos, suínos e aves e suas carnes sugerindo os animais como reservatórios. Desta forma, os estudos são de suma importância para o entendimento da transmissão da doença causada por C. difficile. Diante de poucas pesquisas de C. difficile e da inexistência de método padronizado para seu isolamento a partir dos alimentos, o trabalho consistiu em três etapas: 1) avaliação de metodologia [utilizando dois procedimentos (tratamento com álcool e plaqueamento direto) e dois meios seletivos (ágar Clostridium difficile moxalactan norfloxacina ¿ CDMNA e ágar cicloserina cefoxitina frutose ¿ CCFA)] de detecção de C. difficile em carnes (bovina moída e peito de frango [Peitoralis profundus e superficialis]); 2) avaliação da ocorrência de C. difficile em amostras de carnes resfriadas (bovina moída, bovina peça [Semimembranosus], suína [Longuisimus dorsi] e frango [Peitoralis profundus e superficialis]), compreendendo detecção, isolamento e identificação dos isolados; 3) avaliação do perfil toxigênico dos isolados através da detecção de genes tcdA e tcdB codificadores de TcdA e TcdB e respectivamente avaliação de produção do toxinas pelos isolados. A partir da comparação de dois procedimentos, observou-se que o plaqueamento direto foi mais eficaz e recuperou uma maior quantidade de C. difficile se comparado com o tratamento com álcool e o ágar Clostridium difficile moxalactan norfloxacina (CDMNA) apresentou maior taxa de recuperação em relação ao ágar cicloserina cefoxitina frutose (CCFA). A ocorrência de C. difficile foi observada em 11,5% (17/147) das amostras analisadas, totalizando 80 isolados, destes 41,2% (33/83) apresentaram positivo para pelo menos um gene de virulência (A-B+), ou para ambos os genes (A+B+). Houve concordância de 70,5% entre os testes fenotípicos e genotípicos utilizados para detecção de toxinas. Desta forma, sugere-se que alimentos de origem animal são uma potencial fonte de transmissão de C. difficile para humanos / Abstract: Clostridium difficile is an anaerobic bacillus responsible for intestinal deseases in individuals previouslly treated with antibiocs, who can manifest from a mild diarrhea to severe cases of pseudomembranous colitis, mainly caused by toxins A (TcdA) and B (TcdB). The infections are related to contamination in hospitals, but recent researches sugests a possible association with the consumiption of contaminated foods as C. difficile has been isolated from bovines, suines and poultries and their meat, sugesting animals as reservatories. Thus, studies are extremelly important to elucidate the transmition of the desease caused by C. difficile. Faced with few researches about this bacteria and the lack of a standard method for its isolation from food, this work is divided in three steps: 1) Evaluation of the methodology for C. difficile detection in meet (commercial bovine mince and chicken breast ¿ [Peitoralis superficialis and Peitoralis profundus] [using two procedures (treatment with alcohol and direct plating) and two selective mediums (agar Clostridium difficile moxalactan norfloxacin ¿ CDMNA and cycloserine cefoxitin fructose agar¿ CCFA)]; 2) Assessing of the occurrence of C. difficile in samples of chilled meat (bovine: commercial mince and the whole Semimembranosus; suine: whole Longuisimus dorsi; chicken: Peitoralis profundus and Peitoralis superficialis) by detection, isolation and identification of the isolated; 3) Evaluation of the toxicogenic profile of the isolated by the detection of the genes tcdA and tcdB, which are encoding of TcdA and TcdB respectivelly, and the capacity of toxine production by the isolated bacterias. From the comparison of the two proceeding above it was observed that the direct plating was more efficient and recovered a larger aumont of C. difficile than the treatment with alcohol. Furthermore, the CDMNA agar presented a higher recovery rate compared to CCFA agar. It was observed the occurrence of C. difficile in 11,5% (17/147) of the analyzed samples, comprising 80 isolates, of which 41,2% (33/83) showed a positive response for at least one virulence gene (A-B+), or for both genes (A+B-). In addition, there was a 70,5% concordance between the phenotypic and genotypic tests used to detect toxins. In this way, it is suggested that foods of animal origin are a potential source of transmission of C. difficile for humans / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos