Les bactéries sporulées sont à l’origine de risques sanitaires et d’altération des produits alimentaires. Elles peuvent sporuler pour former des cellules résistantes à diverses agressions physiques ou chimiques. Afin de limiter la formation des spores dans les aliments et sur les lignes de production en industrie agroalimentaire, une approche préventive consiste à prévoir ce processus bactérien en fonction des conditions environnementales rencontrées durant les procédés de fabrication. Pour cela, un modèle cinétique décrivant à la fois la croissance et la sporulation de la bactérie modèle Bacillus subtilis BSB1 a été développé. Ce modèle est un outil utile pour évaluer l’impact des facteurs environnementaux sur des aspects quantitatifs et physiologiques de la croissance et de la sporulation. Des conditions défavorables de température, de pH et d’activité de l’eau provoquent un ralentissement de la croissance bactérienne, une sporulation plus synchrone dans la population de B. subtilis conduisant à une apparition plus tardive des spores et une production plus faible de spores. Tous ces effets ont été décrits avec un modèle prévisionnel de croissance et de sporulation : le modèle cardinal. Ces modèles (cinétique et cardinal) sont efficaces pour prévoir la croissance et la sporulation de B. subtilis BSB1 dans différentes conditions de culture, différentes matrices et en conditions dynamiques de facteurs environnementaux. Ces travaux et ces modèles mathématiques permettront de mieux comprendre le comportement de sporulation des bactéries en fonction des facteurs environnementaux et ainsi, de mieux appréhender la sporulation en industrie agroalimentaire. / Spore-forming bacteria cause health risks and alteration of food products. They can sporulate to form cells resistant to various physical or chemical aggressions. In order to limit the formation of spores in food and on production lines in the agri-food industry, a preventive approach consists in predicting this bacterial process according to the environmental conditions encountered during the manufacturing processes. For this, a kinetic model describing both growth and sporulation of the bacterium model Bacillus subtilis BSB1 was developed. This model is a useful tool for assessing the impact of environmental factors on quantitative and physiological aspects of growth and sporulation of B. subtilis. Unfavorable conditions of temperature, pH and water activity cause a slowing of B. subtilis’ growth, a more synchronous sporulation in the bacterial population leading to later spore emergence and lower spore production. All these effects have been described with a predictive model of growth and sporulation: the cardinal model. These (kinetic and cardinal) models are efficient to predict growth and sporulation of B. subtilis BSB1 in different culture conditions, different matrices and in dynamic conditions of environmental factors. This work and these mathematical models will allow a better understanding of the sporulation behavior of bacteria according to environmental factors and thus a better understanding of the sporulation in the agrofood industry.

L’effet de la température et de la composition du milieu en nutriments sur les propriétés des spores (résistance et germination) de B. cereus a été largement étudié contrairement à l'effet de l'anaérobiose. Or, les cellules végétatives de B. cereus peuvent se retrouver dans une grande variété de milieux naturels avec un faible niveau d'oxygène (intestin, sol, lignes de traitement des aliments…) où la sporulation peut avoir lieu. Les spores produites dans ces conditions anaérobies pourraient donc avoir des propriétés particulières. Dans ce travail, un panel de 18 souches de B. cereus appartenant aux groupes phylogénétiques de II à VII a été étudié pour sa capacité à sporuler en anaérobiose dans un milieu de sporulation approprié que nous avons développé (MODS). En anaérobiose, la capacité de sporulation a été plus faible et plus hétérogène qu’en aérobiose. La souche AH187 a produit le niveau de spores le plus important en anaérobiose, elle a donc été choisie pour étudier les propriétés de ces spores. Les spores produites en anaérobiose étaient plus résistantes à la chaleur humide entre 90°C et 100°C, à 1M de NaOH, 1M d'acide nitreux et à la lumière pulsée. Aucune différence dans la résistance à 5 % de peroxyde d'hydrogène ou à 0.25 mM de formaldéhyde, ni aux UV-C, n'a été observée entre les deux conditions. En présence de L- alanine, les spores produites en anaérobiose germaient plus efficacement que celles produites en aérobiose tandis qu’aucune différence dans la germination n’a été observée en présence d'inosine. Aucune différence dans la taille des spores produites dans les deux conditions n’a été observée par microscopie électronique à transmission. Toutefois, les spores obtenues dans des conditions anaérobies avaient un exosporium endommagé ou dans certains cas un exosporium complètement détaché, contrairement aux spores produites dans des conditions aérobies. Afin de comprendre les différences dans la capacité de sporulation de B.cereus entre les 2 conditions, des PCR en temps réel (RT-PCR) ont été utilisées pour étudier l'expression des gènes de l'initiation de la sporulation spo0A, spo0B, spo0F, KinA et kinB. Les cinétiques d'expressions des gènes spo0A, spo0B, spo0F et KinA avaient la même tendance. Ils étaient caractérisés par une expression plus élevée en anaérobiose par rapport à l’aérobiose au début et à la fin de la phase exponentielle de croissance. En outre, l'expression du gène kinB était caractérisée par une augmentation en anaérobiose par rapport à l’aérobiose pour atteindre un pic entre 4 h (milieu de phase exponentielle) et 6 h (début de phase stationnaire) de croissance. Les gènes spo0A, spo0B, spo0F, KinA et kinB sont exprimés de manière différentielle entre l’aérobiose et l’anaérobiose. Ces données pourraient aider à comprendre la différence de capacité de sporulation de B. cereus entre la condition aérobie et anaérobie / The effect of temperature and nutrient composition of the medium on B. cereus spore properties (resistance and germination) has been extensively studied unlike to the effect of anaerobiosis. Nevertheless, B. cereus vegetative cells can be found in a large variety of natural environments with low oxygen level (intestine, soil, food processing line) where sporulation take place. Spores produced in these anaerobic environments could have particular properties. In this work, a panel of B. cereus strains belonging to phylogenetic groups II to VII was studied for their capacity to sporulate in anaerobiosis in an appropriate sporulation medium we developed (MODS). In anaerobiosis, sporulation ability was lower and more heterogeneous than in aerobiosis. The B. cereus AH187 strain produced the highest level of spores in anaerobiosis, it was therefore chosen to study spore properties. Spores produced in anaerobiosis were more resistant to wet heat from 90°C to 100 °C, 1M NaOH, 1M nitrous acid and pulsed light. No difference in resistance to 5 % hydrogen peroxide or 0.25 mM formaldehyde or UV-C was observed between these two conditions. In the presence of L-alanine, spores produced in anaerobiosis germinated more efficiently than spore produced in aerobiosis. No difference in germination was observed with inosine. No difference in the spores size produced in the two conditions was observed by transmission electron microscopy. However, spores obtained under anaerobic conditions had a damaged exosporium, or in some cases a completely detached exosporium, unlike spores produced under aerobic conditions. To understand differences in sporulation ability between both conditions, Real-time reverse transcription-PCR was used to study the expression the expression of sporulation initiation genes spo0A, spo0B, spo0F, kinA and kinB. The kinetics of gene expression spo0A, spo0B, spo0F and kinA had the same trend. They were characterized by a higher expression in anaerobiosis compared to aerobiosis at the beginning and the end of exponential growth phase. Furthermore, kinB gene expression was characterized by an increase in anaerobiosis compared to aerobiosis to achieve a peak between 4 (middle exponential phase) and 6 (early stationary phase) hours of growth. The spo0A, spo0B, spo0F, kinA and kinB genes are differentially expressed between aerobiosis and anaerobiosis. These data may help to understand the difference in B. cereus sporulation capacity between aerobic and anaerobic condition

Les bactéries ont besoin d’adapter leur cycle cellulaire et leur taux de croissance aux changements environnementaux et nutritionnels. L’initiation de la réplication est ainsi strictement coordonnée aux autres processus cellulaire afin de transmettre un chromosome conforme. Chez B. subtilis, bactérie modèle des Gram⁺, la protéine YabA joue un rôle majeur en réprimant l’initiation de la réplication, ceci en formant un complexe avec la protéine initiatrice DnaA et la clamp polymérase DnaN. YabA interagit en outre avec d’autres protéines partenaires et serait donc multifonctionnelle. Sa structure 3D révèle une architecture en deux domaines: Un domaine N-terminal adoptant un repliement de type superhélice et un domaine C-terminal globulaire structuré autour d’un atome de Zinc. In vivo, YabA est un tétramère par interaction entre les superhélices, connecté aux domaines C-terminaux monomériques par une séquence déstructurée hyper flexible. YabA serait un hub structural interagissant simultanément avec plusieurs protéines et constituerait une plate-forme d’intégration entre différents signaux intracellulaires et l’initiation de la réplication. La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité de nombreuses protéines en réponse à certains signaux cellulaires. Grâce à des expériences de phosphorylation in vitro et des analyses de spectrométrie de masse, nous avons montré que YabA est phosphorylée par la kinase de type Hanks YabT sur une thréonine, localisée dans la région flexible de liaison interdomaines. YabT est une kinase activée par l’ADN, exprimée en carence en glucose, en sporulation et en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants phosphomimétique de YabA (yabA-T71D) et non phosphorylable (yabA-T71A) pour i) confirmer le rôle de T71 dans la phosphorylation et ii) réaliser des études fonctionnelles.Nous avons montré in vivo que la phosphorylation de YabA n’est pas impliquée dans l’initiation de la réplication, mais module des programmes de différenciation. La phosphorylation de YabA module inversement la sporulation et la formation de biofilm, ce qui souligne sa multifonctionnalité et son implication dans la signalisation cellulaire connectant l’initiation de la réplication et la différenciation. Nos résultats suggèrent que la phosphorylation YabT-dépendante de YabA affecte la différenciation en modulant le taux intracellulaire de Spo0A-P. En effet, la phosphorylation de YabA est corrélée à un taux élevé de Spo0A-P, ce qui stimule la sporulation et inhibe la formation de biofilm. Par ailleurs, nos expériences de chromatographie sur couche fine (TLC) et de “In-Gel” suggèrent que YabA possède une activité “ATP/GTPasique” atypique modulée par la phosphorylation de YabA sur T71. Nos analyses fonctionnelles révèlent un rôle potentiel de YabA sur des voies de signalisation dépendant du c-di-GMP, qui contrôle la formation du biofilm chez de nombreuses bactéries. Ces résultats suggèrent que YabA joue un rôle complexe pendant la différenciation en intégrant différentes voies de signalisation. Enfin, des analyses de LC-MS montrent que lorsqu’elle est surexprimée chez Escherichia coli, YabA est phosphorylée sur la tyrosine 90, qui appartient au domaine d’interaction C-terminal. Une étude double-hybride chez la levure montre que la phosphorylation de Y90 module l’interaction de YabA avec ses partenaires DnaA et DnaN. In vivo, la phosphorylation de Y90 module l’initiation de la réplication. La kinase impliquée n’a pas encore été identifiée, mais ces résultats suggèrent l’existence d’un contrôle de l’initiation de la réplication lié à la phosphorylation de YabA chez B. subtilis. En conclusion, l’ensemble de nos études suggèrent l’existence de différents niveaux de régulation de l’activité de YabA par phosphorylation sur thréonine et tyrosine. YabA, outre son rôle dans l’initiation de la réplication, joue un rôle majeur dans la différenciation de B. subtilis. / Upon environmental or nutritional changes, bacteria must adjust their cell cycle with their growth rate. Most particularly, DNA replication initiation events must be controlled and coordinated with cell physiology to ensure faithful chromosome inheritance. In Bacillus subtilis, a model of Gram-positive bacteria, YabA plays a major role in down regulating initiation replication through interaction with the initiator protein DnaA and the clamp polymerase DnaN. However, YabA is a structural hub protein able to interact with other protein partners, indicating it might be multifunctional. Through its unique overall tri-dimentional structure composed of N-terminal four helix-bundle tetramer connected to four monomeric C-terminal domains by a highly flexible linker, YabA is capable to physically interact with more than one protein at a time, thus providing a suitable platform to integrate intracellular signals to replication initiation. Phosphorylation is the most prevalent post translational modification that modulates protein activities in response to cellular signals. Using in vitro phosphorylation and mass spectrometry we demonstrated that YabA is phosphorylated by the Hanks-type serine/threonine kinase YabT at a threonine residue localized within the flexible inter-domain region. YabT is a kinase activated by DNA and up-regulated during glucose starvation, sporulation and stationary phase. We constructed YabA phosphomimetic (yab-AT71D) and non-phosohorylatable (yabA-T71A) mutants to (i) confirm the requirement of T71 for YabT-mediated phosphorylation in vitro and (ii) perform in vivo and in vitro functional studies.We show in vivo that the phosphorylation of YabA is not involved in initiation control, but rather modulates bacillus developmental processes. We found that YabA phosphorylation inversely regulates sporulation and biofilm formation highlighting the multifunctional role of YabA as well as its role in integrating physiological signals to connect chromosomal replication initiation control with cell development. Our results support a role of YabT-mediated phosphorylation of YabA in Bacillus subtilis life-style decision making through the modulation of Spo0A-P intracellular levels. We established that YabA phosphorylation correlates with high cellular levels of Spo0A-P, leading to sporulation stimulation and preventing biofilm formation. Additionally, thin layer chromatography (TLC) analysis and In-Gel assays showed that YabA possess an atypical "ATP / GTPase" activity. This unusual activity seems to be modulated by phosphorylation of the YabA T71 residue. Our functional analysis pointed to a potential role of YabA in the c-di-GMP signaling transduction pathway, known to regulate biofilm formation in many bacteria. This suggesting a complex regulatory role of YabA during development, involving signaling crosstalk. LC-MS analyzes showed that when overexpressed in Escherichia coli, YabA is phosphorylated on the residue Y90 in a YabT independent manner. Y90 belongs to the interaction C-terminal domain, which contacts DnaA and DnaN. We found that Y90 was involved YabA-mediated replication initiation control. We provided evidence that phosphorylation state of YabA at Y90 can potentially modulates a protein-interaction switch with its protein partners DnaA and DnaN in a yeast-two-hybrid-based assay. Although we did not identified a kinase responsible for the phosphorylation of YabA at Y90 in B. subtilis, this finding hint at the possibility of a YabA-mediated control of initiation modulated by phosphorylation in this bacteria. Thus, all of these in vitro and in vivo observations suggest the existence of different modes of regulation of YabA activity by phosphorylation, involving threonine and tyrosine residues. This study established that YabA, apart from its role during replication initiation, plays a key regulatory role in B. subtilis development.

Les streptomycètes, des bactéries au développement morphologique complexe, sont étudiés depuis des décennies en raison de leurs caractéristiques particulières incluant leur capacité à produire une grande diversité d'enzymes hydrolytiques et de molécules complexes telle que des centaines d'antibiotiques. Streptomyces coelicolor est l'organisme modèle pour l'étude des streptomycètes et le séquençage de son génome a ouvert la voie à l'étude de centaines de gènes dont la fonction est jusqu'à présent inconnue. La protéine TerD du Serratia marcescens joue un rôle dans la résistance au tellurite chez cet organisme. Plusieurs orthologues de cette protéine ont été identifiés chez le S. coelicolor. Sur la base de la similarité de leurs séquences avec la protéine TerD, ces protéines du S. coelicolor ont été désignées comme des protéines de résistance au tellurite. Ces mêmes protéines ont été identifiées comme étant induites ou réprimées dans de nombreuses conditions exemptes de tellurite, laissant croire qu'elles participent à d'autres voies métaboliques. Au cours de ce travail de doctorat, des souches mutantes du S. coelicolor ont été produites pour les gènes SCO2367, SCO2368 et SC04277, trois gènes homologues à ter D, afin d'évaluer les répercussions de la perte de ces gènes chez la bactérie.Les souches ont été caractérisées morphologiquement et nous avons démontré que la délétion de ces gènes nuit sérieusement au développement de la bactérie, à la production de spores et à la vitesse de croissance. Parallèlement, une approche protéomique a été utilisée afin de caractériser les effets de la délétion ou de la surexpression du gène SCO2368 sur la biosynthèse des protéines intracellulaires et extracellulaires de la bactérie. Ceci a permis de démontrer qu'une grande quantité de protéines reliées au stress sont induites chez les deux souches mutantes, laissant présumer qu'un déséquilibre dans le taux de cette protéine induit un stress physiologique important. Par ailleurs, différentes isoformes de la protéine SCO2368 ont été identifiées tant au niveau intracellulaire que dans le milieu extracellulaire. Par l'analyse des modifications post-traductionnelles de ces isoformes, nous avons prouvé que celles-ci étaient méthylées sur plusieurs acides aminés. De plus, nous avons démontré que la transcription du gène SCO2368 n'est pas induite par la présence de tellurite. Ces résultats démontrent que les gènes homologues à ter D ont une autre fonction que la résistance au tellurite et qu'ils jouent vraisemblablement un rôle dans la morphogénèse.

Clostridium difficile est la principale cause de diarrhées nosocomiales liées à la prise d'antibiotiques. La souche hypervirulente NAP1/027 est apparue récemment et a causé de nombreuses épidémies en Amérique du Nord et en Europe. On considère généralement que cette souche produit plus de toxines, sporule davantage, provoque des infections plus sévères menant à des complications et est souvent associée aux cas de récurrence. Toutefois, des études récentes ont montré des données contradictoires à ce sujet. L'objectif de mes travaux de recherche est donc de déterminer si l'issue clinique des infections à C. difficile (ICD) peut être prédite en fonction du génotype et de certains phénotypes bactériens associés à la virulence, comme la production de toxines et la sporulation. Pour ce faire, 21 isolats cliniques associés à des ICD de sévérité différente (légère à modérée, sévère, compliquée) ont été caractérisés par des méthodes de typage courantes, incluant le ribotypage par PCR, le typage des répétitions en tandem, l'analyse de loci multiples de répétitions en tandem polymorphe, la détection des toxines A, B et CDT, ainsi que le séquençage du gène tcdC. Les taux de sporulation et la production des toxines A et B ont aussi été évalués in vitro, de même que la résistance des isolats à certains antibiotiques. La mobilité, la sensibilité des isolats à certains bactériophages et leur contenu en prophages ont aussi été étudiés. Les résultats de mes travaux démontrent que les méthodes de typage utilisées ne permettent pas de prévoir avec certitude le phénotype bactérien ni de prédire la sévérité des ICD. En effet, les souches NAP1/027 peuvent autant provoquer des ICD non-sévères que mener à des complications. Le phénotype n'est pas non plus nécessairement un indice de la sévérité. Les souches NAP1/027 produisent généralement plus de toxines, mais ne possèdent pas forcément la capacité de sporulation qu'on leur attribue généralement. Par conséquent, les généralisations à propos des souches NAP1/027 devraient être évitées.

Chez Schizosaccharomyces pombe, le cycle méiotique est le mode de division cellulaire spécialisé qui permet la formation d’ascospores résistantes à différents stress lorsque les conditions environnementales ne sont pas propices à la multiplication cellulaire. Lors de mes travaux de thèse, mes objectifs consistaient à caractériser le rôle et le mécanisme d’action de la protéine Cuf2 lors du cycle méiotique chez S. pombe. Mes résultats ont montré que le gène cuf2[indice supérieur +] était exprimé exclusivement lors des divisions méiotiques et que la protéine se co-localisait de manière constitutive avec le matériel génétique. De plus, mes résultats ont dévoilé que Cuf2 participait à l’activation et à la répression de plusieurs gènes méiotiques selon un mécanisme de nature transcriptionnelle en s’associant spécifiquement avec leur région promotrice. Par la suite, mes résultats ont mis en évidence que Cuf2 interagissait physiquement avec Mei4, un facteur de transcription méiose-spécifique, au noyau des cellules méiotiques. Notamment, mes résultats ont montré que la présence de Mei4 et de son motif de liaison à l’ADN dénommé FLEX étaient nécessaires afin que Cuf2 puisse s’associer au promoteur de son gène cible fzr1[indice supérieur +] afin d’en activer l’expression. L’ensemble de mes résultats indiquent que Cuf2 et Mei4 interagissent aux promoteurs de certains gènes lors des divisions méiotiques afin d’en co-activer l’expression. D’ailleurs, mes résultats ont également montré que la fonction de Cuf2 était importante à la formation d’ascospores et à leur viabilité ; en absence de Cuf2, la majorité des ascospores présentent diverses aberrations et plus de la moitié d’entre elles sont non-viables. Globalement, mes résultats démontrent que Cuf2 est un régulateur critique de l’expression génique lors du cycle méiotique et que cette fonction est essentielle à la sporulation chez S. pombe.

In Saccharomyces cerevisiae, Ime4 is a protein that is induced during meiosis and has a primary role in regulating sporulation in starving diploids. One function of Ime4 is methylation of adenosine residues within mRNA transcripts. Recent studies have shown Ime4 to be induced in haploids during the mating response, although its role in mating has not been determined. In this report, I identify the subcellular localization of Ime4 during the mating response through treatment with alpha factor. A plasmid containing IME4-GFP under the control of the medium strength promoter CYC1 was created in order to express the protein in a controlled manner. Lastly, mutational analysis was conducted to determine which regions of the protein were necessary for its nuclear localization, aggregation, and sporulation function.

In the presence of a non-fermentable carbon source, nitrogen-starved diploid cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae undergo a meiotic program called sporulation to form gametes called spores. While four spores are produced under standard laboratory sporulation conditions, spore number is known to be regulated by carbon availability: under carbon-depleted conditions, yeast cells package a portion of the four haploid meiotic nuclei into spores. Our lab has demonstrated that these unpackaged meiotic products undergo programmed nuclear destruction (PND) that is associated with apoptotic-like DNA fragmentation. Nevertheless, the mechanism that mediates PND remained to be elucidated. Here, I describe the execution of PND through an unusual form of autophagy that has not been documented previously in yeast. This form of autophagy is most similar to megaautophagy in plants and lysosomal membrane permeabilization in mammals. My results demonstrate further diversity in cell death programs in unicellular microbes that is potentially conserved across eukaryotes.

In the presence of a non-fermentable carbon source, nitrogen-starved diploid cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae undergo a meiotic program called sporulation to form gametes called spores. While four spores are produced under standard laboratory sporulation conditions, spore number is known to be regulated by carbon availability: under carbon-depleted conditions, yeast cells package a portion of the four haploid meiotic nuclei into spores. Our lab has demonstrated that these unpackaged meiotic products undergo programmed nuclear destruction (PND) that is associated with apoptotic-like DNA fragmentation. Nevertheless, the mechanism that mediates PND remained to be elucidated. Here, I describe the execution of PND through an unusual form of autophagy that has not been documented previously in yeast. This form of autophagy is most similar to megaautophagy in plants and lysosomal membrane permeabilization in mammals. My results demonstrate further diversity in cell death programs in unicellular microbes that is potentially conserved across eukaryotes.

Viruses are the most abundant biological entities in the ocean and are believed to contribute to nutrient cycling, bacterial diversity, and horizontal gene exchange. However, little is known about the relationship between temperate phages and their hosts in marine environments. In this thesis, phage-host systems from the Gulf of Mexico were used to study the influence of temperate phages in bacteria. PhiHAP-1 is a temperate myovirus induced with mitomycin C from Halomonas aquamarina isolate. The genome of this phage was 39,245 nucleotides long and contained 46 predicted genes. Besides genes involved in lysogeny, PhiHAP-1 contained a protelomerase, which is responsible for resolution of telomeric ends in linear plasmid-like phages. Hybridization studies and PCR analysis indicated not only a lack of integration of the prophage in the host chromosome, but differences in genome arrangement between the prophage and virion forms of PhiHAP-1. These results suggest that PhiHAP-1 exists as a non-integrating linear phage with telomeric ends. Eleven pigmented Bacillus spp. isolates were examined for the occurrence of lysogeny and sporulation through induction with mitomycin C and decoyinine, respectively. The results from these experiments suggested a variety of interactions can occur between phages and their hosts, some of which may influence sporulation. The lysogenic strain B14905 had high frequency of sporulation and was selected for further analysis. The genome of B14905 contained 4 prophage-like regions, one of which was independently sequenced from an induced lysate. PCR and TEM analysis of a mitomycin C induced lysate indicated that two of these regions were inducible prophage, one was a defective phage, and one was a non-inducible phage remnant. One of the inducible prophages contained a transcriptional regulator that is hypothesized to be involved in regulation of host sporulation. The diversity of prophage and prophage-like elements found in B14905 suggest that the genetic diversity of phages in the oceans is vast. The studies of the temperate phages from H. aquamarina and Bacillus spp. isolates illustrates that integration of molecular, genomic, and function studies can be used to provide insight into the influence of prophage on host bacteria.