No universo da pecuária leiteira, a mastite representa um importante desafio, sendo responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com redução na produção de leite. O gênero Staphylococcus assume elevada importância como agente etiológico das mastites devido à sua ampla distribuição e freqüência de ocorrência. Foram coletadas amostras de leite de fêmeas bovinas com mastite subclínica para exames microbiológicos e contagem de células somáticas (CCS). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, as amostras positivas foram submetidas a análises das medianas das CCS, testes de susceptibilidade \"in vitro\" frente a diferentes antimicrobianos, assim como pesquisa de genes codificadores das adesinas - genes que codificam para proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebp), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (fnbA), proteína B ligadora de fibronectina (fnbB) e proteína associada à formação de biofilme (bap), por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com os achados do presente estudo, dentre as bactérias do gênero Staphylococcus isoladas, os S. aureus foram verificados com maior freqüência, seguido por Staphylococcus coagulase-negativos - S. intermedius, S. chromogens e S. warneri. Com respeito às medianas das CCS, o gênero Streptococcus spp. apresentou o maior valor. O perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos testados foi semelhante entre as espécies de Staphylococcus coagulase-positivos e negativos, sendo os antimicrobianos cefalexina, cefalotina e ceftiofur os que apresentaram maior frequência de sensibilidade, e penicilina, amoxicilina e ampicilina os que apresentaram maior resistência. Com exceção do (fnbA), todos os outros fatores de virulência estudados foram detectados, sendo os genes eno, fib e a associação dos genes \"eno/fib/bap\" os mais freqüentemente detectados. Nas amostras coletadas dos tanques de refrigeração não foram detectadas todas as espécies de Staphylococcus spp. isoladas dos quartos mamários. Tais informações acerca do assunto permitem o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de tratamento e controle desta enfermidade, possibilitando o aumento da produtividade leiteira. / In the world of dairy cattle, mastitis is a major challenge, accounting for economic losses related mainly to reduction in milk production. The genus Staphylococcus assumes greater importance as a etiologic agent of mastitis due to its wide distribution and frequency of occurrence. Milk samples were collected from cows with subclinical mastitis to microbiological examinations and somatic cell count (SCC). After isolation and identification of microorganisms, positive samples were analyzed for the medians of SCC, tested for susceptibility \"in vitro\" against different antimicrobials and polymerase chain reaction will be used to search for genes encoding adhesins - genes that code for collagen-binding protein (cna), lamininbinding protein (eno), elastin-binding protein (ebp), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA), fibronectin-binding protein B (fnbB) and protein associated with biofilm formation (bap). According to the findings of this study, among the bacteria of the genus Staphylococcus isolated, S. aureus were found most frequently, followed by coagulase-negative Staphylococcus - S. intermedius, S. chromogens and S. warneri. With respect to the medians of CCS, the genus Streptococcus spp. showed the highest. The profile of sensitivity and resistance to antimicrobials was similar among species of coagulase-positive and negative Staphylococcus, and antimicrobial cephalexin, cephalothin, and ceftiofur showed higher frequency sensitivity. Penicillin, amoxicillin and ampicillin showed the highest resistance. With the exception of (fnbA), all other virulence factors were detected, with genes eno, fib and the association of genes \"eno/fib/bap\" the most frequently detected. The samples collected from the cooling tanks were not detected all species of Staphylococcus spp. that were isolated from the mammary glands. Such information on the subject allow the development of more efficient strategies for treatment and control of this disease, allowing for increased milk production.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-01-30T12:53:53Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 658528 bytes, checksum: ffd305cbccb6b8d7a75431c6f5b47b01 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-30T12:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 658528 bytes, checksum: ffd305cbccb6b8d7a75431c6f5b47b01 (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Phenolic compounds are one of the major classes of secondary metabolites of plants and can be categorized into several classes, including phenolic acids, flavonoids and tannins. Several phenolic compounds have shown antimicrobial properties and capability to inhibit the biofilm formation by pathogenic bacteria, including Staphylococcus aureus. This study evaluated the efficacy of phenolic compounds in inhibiting biofilm formation of S. aureus. Flavonoids have been tested hesperetin, hesperidin, myricetin, myricitrin, phloretin, phloridzin and the tannins tannic acid. RN4220 and S. aureus AS-119B strains, which overexpress efflux protein genes were used as test strain. The S. aureus ATCC259233 strain which does not overexpress genes related to efflux proteins was used in tests. The minimum inhibitory concentration (MIC) of phenolic compounds was determined by the microdilution in broth method, while the minimum concentration for biofilm inhibition (MICB50) was determined by the microdilution in broth method with quantification of biofilm formation by absorbance at 595 nm. The tested phenolic compounds at 512 μg ml-1 showed no inhibitory activity on the growth of the strains tested; however, at lower concentrations showed inhibitory effects on biofilm formation by these same strains, the MBIC50 values varying between 1 to 256 μg ml-1, with lower values (1 and 2 μg ml-1) being observed against S. aureus RN-4220. Aglycone flavonoids showed lower MICB50 values than their respective glycone forms. Myricetin, hesperetin, phloretin and tannic acid exhibited biofilm formation inhibition > 70% for S. aureus RN- 4220. The results indicate that the tested phenolic compounds have the potential of inhibiting biofilm formation by S. aureus strains that overexpress efflux pumps. / Os compostos fenólicos formam uma das principais classes de metabólitos secundários de plantas e podem ser categorizados em várias classes, incluindo os ácidos fenólicos, flavonoides e taninos. Diversos compostos fenólicos têm demonstrado propriedades antimicrobianas e de inibição da formação de biofilmes por bactérias patogênicas, incluindo Staphylococcus aureus. Este estudo avaliou a eficácia de compostos fenólicos na inibição da formação de biofilmes por S. aureus. Foram testados os flavonoides hesperidina, hesperetina, miricitrina, miricetina, floredzina, floretina e o tanino ácido tânico. As cepas S. aureus RN4220 e S. aureus AS-119B que superexpressa genes para proteínas de efluxo foram utilizadas como cepas teste. Ainda, a cepa S. aureus ATCC259233, que não superexpressa genes conhecidos relacionados à bomba de efluxo, foi utilizada nos ensaios. A concentração inibitória mínima (CIM) dos compostos fenólicos foi determinada por meio do método de microdiluição em caldo, enquanto a concentração mínima inibitória do biofilme (MBIC50) foi determinada por meio do método de microdiluição em caldo seguida de quantificação da formação de biofilme a 595 nm. Os compostos fenólicos testados não apresentaram atividade antimicrobiana em concentrações igual ou inferiores a 512 μg.ml-1 frente as cepas testadas. Entretanto, esses mesmos compostos apresentaram capacidade de inibição da formação de biofilme por parte das cepas testadas, com os valores de MBIC50 variando de 1 a 256 μg.ml-1, onde os valores mais baixos (1 e 2 μg.ml-1) foram observados frente a S. aureus RN-4220. Os flavonoides agliconas apresentaram menores valores de MBIC50 que suas respectivas formas glicosiladas. Miricetina, hesperetina, floretina e ácido tânico apresentaram percentual de inibição da formação de biofilme > 70% para S. aureus RN- 4220. Os resultados mostram que os compostos fenólicos testados apresentam potencial de inibição da formação de biofilme em cepas de S. aureus que superexpressam genes para proteínas de efluxo.

A mastite é uma doença complexa que pode ter diferentes causas, graus de intensidade e variações de duração e de conseqüências. Os processos inflamatórios na glândula mamária são especialmente freqüentes e importantes em bovinos leiteiros. A mastite infecciosa é a mais importante sob os pontos de vista econômico e de saúde pública. A forma subclínica é a mais onerosa e prevalente com um comprometimento mundial de 40% do rebanho leiteiro e perdas econômicas entre 5% e 25% da produção leiteira. No Brasil, a mastite subclínica caracteriza-se pela alta incidência, com índices variando de 44,88% a 97,0%, e a redução da produção leiteira situa-se entre 25,4% e 43,0%. Dentre os agentes etiológicos mais isolados em casos de mastite subclínica destacam-se os Staphylococcus spp., os Streptococcus spp. e o Corynebacterium bovis. A quantidade de UFC/mL no leite proveniente diretamente da glândula mamária bovina com infecção permitiria o conhecimento da quantidade de microrganismos associada a uma determinada intensidade de processo inflamatório na glândula. A comparação destas informações com a contagem de células somáticas na amostra avaliaria mais acuradamente a natureza do processo inflamatório e infeccioso na glândula. Importante seria o risco que representa a presença de microrganismos no leite, sobretudo se considerar o hábito do consumo de leite in natura, verificando em um estudo quantitativo desta natureza, a carga microbiana ingerida pelo homem. Foram examinadas 80 amostras de leite de vacas mestiças ou holandesas, primíparas e multíparas, em diferentes estágios de lactação de plantéis do Estado de São Paulo. Quatro grupos foram formados de 20 animais cada: grupos com crescimento negativo, de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. em cultura pura e grupo com a associação de ambos microrganismos. O objetivo deste trabalho consistiu em avaliação comparativa da quantidade de UFC/mL de microrganismos e CCSs no leite proveniente de glândulas mamárias bovinas, associadas com a presença dos microrganismos Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. e infecções mistas ocorridas com a presença de ambos. Tanto Staphylococcus spp. (mediana = 4,772), quanto Streptococcus spp. em cultura pura (mediana = 5,933), não apresentam diferenças significativas na contagem de UFC com seus respectivos agentes em associação (Staphylococcus spp. com mediana da associação foi de 5,048 e mediana de Streptococcus spp. da associação foi de 5,792). Nas amostras em que houve crescimento de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. associados, a quantidade de UFC de Streptococcus spp. foi estatisticamente maior. Comparados entre si (crescimento em cultura pura de Staphylococcus spp. com mediana = 5,765 e Streptococcus spp., mediana = 5,920), mesmo apresentando um maior número na CCSs no grupo de crescimento de Streptococcus spp., este aumento não foi significativo estatisticamente. Porém, quando associados (mediana = 5,673), comparados à cultura pura de Staphylococcus spp. (mediana = 5,765), este último teve aumento significativo. Tanto em cultura pura como em associação, a presença dos microrganismos quando comparados, não induziram a um aumento significativo na CCSs ou à contagem de UFCs em amostras de leite com sinais de mastite subclínica, porém Staphylococcus spp. induziu maior contagem de células somáticas / Mastitis is a complex disease that can occur due to different causes, intensity of degrees and variation of duration and consequences. The inflammatory processes in the mammary gland are specially frequent and important in dairy producing cattle. The infectious mastitis is the most important because of the economic aspects and public health. The subclinical manifestation is the most expensive and prevailing affecting 40% of the milk producing herd and causing an economic loss between 5% and 25% of all dairy production. In Brazil, the subclinical mastitis is characterized by high incidence, with indexes varying from 44,8% to 97,0 % with the reduction of milk production between 25,4% and 43%. Among the more isolated etiological agents in subclinical mastitis, is the Staphylococcus spp., the Streptococcus spp. and the Corynebacterium bovis. The amount of CFU/mL in the milk directly originated from the infected cow mammary gland would make possible to know the amount of microorganisms associated to a determined intensity of inflammatory process in the gland. The comparison between this information with the number of body cells in the sample would evaluate more precisely the nature of the inflammatory process in the gland. The risk represented by the presence of microorganisms in the milk is very important mainly because of the habit of milk consumption in natura, checked in a quantitative study of this nature, based on the amount of microbes intake by man. Eight milk samples of half-breed cows and Dutch cows were examined as well as those in first or after various calving, in different lactation stages in breeding stocks in São Paulo State. Four groups were organized, with 20 animals in each with negative Staphylococcus spp. growth and Streptococcus spp. in pure culture and group, with the association of both microorganisms. The purpose of this study is the comparative assessment of the amount of CFU/mL of microorganisms and CCSs in the milk from the mammary bovine glands, associated with the presence of microorganisms Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. and a mixed infection that occurred with the presence of both. The Staphylococcus spp. (median = 4,772) as well as the Streptococcus spp. in pure culture (median= 5,933) did not show significant differences in the CFU count, with their respective agents in association (Staphylococcus spp. with median of association was of 5,048 and median of Streptococcus spp. of the association was of 5,792). On the samples in which there was a growth of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. associated, the amount of CFU of Streptococcus spp. was statistically larger. Compared between themselves (growth in pure culture of Staphylococcus spp., median = 5,920, this increase wasnt statistically significant. Although when associated (median=5,673), compared to the pure culture of Staphylococcus spp. (median=5,765), the latter had a significant increase. In pure culture as well as in association, the presence of microorganisms when compared to a significant increase in CCSs or to the CFUs count in milk samples with indication of subclinical mastitis, but the Staphylococcus spp. induced a larger count of somatic cells

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-07-29T13:36:35Z No. of bitstreams: 1 2011 - Bruno Rocha Pribul.pdf: 1463809 bytes, checksum: ba7b3b0f00c0b4469b45fe02ec9f8a7f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T13:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - Bruno Rocha Pribul.pdf: 1463809 bytes, checksum: ba7b3b0f00c0b4469b45fe02ec9f8a7f (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / PRIBUL, Bruno Rocha. Evaluation of Vancomycin Resistance and Susceptibility Profile Bacteriocins of staphylococci isolated from bovine mastitis in Southern State of Rio de Janeiro. 41p Thesis (Master of Veterinary Science). Instituto de Veterin?ria, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Serop?dica, RJ, 2011. Bacteria of the genus Staphylococcus are among the most implicated in the etiology of mastitis. An additional difficulty in controlling bacterial infections by this genus is represented by its frequent resistance to antibiotics. The glycopeptides (eg vancomycin) appear as an alternative therapy because of the increasing strains of staphylococci resistant to beta-lactams, which are the drugs of choice in these infections. Thus, glycopeptide resistance represents a threat to the future of antimicrobial therapy in humans and animals. This study aimed to evaluate the profile of vancomycin resistance pheno-genotypically in Staphylococcus spp. milk samples from cows with mastitis. All 150 isolates (50 isolates of Staphylococcus aureus, 50 isolates of Staphylococcus intermedius and 50 isolates of Coagulase-negative Staphylococcus spp. (CNS) were evaluated using the tests of disk diffusion, agar microdilution and detection of vanA e vanB genes. The antimicrobial susceptibility test showed high resistance to beta-lactam antibiotics for all groups. In the disk diffusion test, 24% of coagulase-positive isolates showed resistance to teicoplanin (24/100) and 23% to vancomycin (23/100). In the agar microdilution test for detection of CIM, 16% of the isolates were resistant to vancomycin (16/100). Among the resistant isolates in the agar microdilution testing, 56.25% of the isolates (9 / 16) had MIC values ranging from 4-8?g/ml. Staphylococcus coagulase-negative showed no resistance to the evaluated glycopeptides. Genes for resistance to vancomycin were detected in 37.5% of vancomycin-resistant isolates (6 / 16). To seek a correlation between the presence of glycopeptide resistance and the ability of producing biofilm, tests were performed to characterize growth in Congo red agar and also detection of the biofilm adherence test in microplates. It were detected 66.66% and 90, 00%, respectively, of isolates producing biofilm. The production of "slime" presented no statistical correlation with resistance to glycopeptides. The sensitivity profile of Staphylococcus spp. was assessed against the bacteriocins produced by Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus fermentum. Lactobacillus paracasei bacteriocins presented the highest inhibition capacity. / PRIBUL, Bruno Rocha. Avalia??o da Resist?ncia a Vancomicina e do Perfil de Suscetibilidade a Bacteriocinas de Staphylococcus spp Isolados de Mastite Bovina da Regi?o Sul do Estado do Rio de Janeiro. 41p Disserta??o (Mestrado em Ci?ncias Veterin?rias). Instituto de Veterin?ria, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Serop?dica, RJ, 2011. As bact?rias do g?nero Staphylococcus est?o entre as mais implicadas na etiologia das mastites. Uma dificuldade adicional no controle das infec??es bacterianas por este g?nero ? representada por sua freq?ente resist?ncia aos antimicrobianos. Os glicopept?deos, como a vancomicina, aparecem como uma alternativa terap?utica devido ao crescente aumento de cepas estafiloc?cicas resistentes aos betalact?micos, que s?o os f?rmacos de elei??o nestas infec??es. Desse modo, a resist?ncia aos glicopept?deos representa uma amea?a ao futuro da terapia antimicrobiana em humanos e animais. O presente trabalho buscou avaliar o perfil de resist?ncia ? vancomicina em isolados de Staphylococcus spp. oriundos de amostras de leite de vacas com mastite. Todos os 150 isolados estudados (50 Staphylococcus aureus, 50 Staphylococcus intermedius e 50 Staphylococcus spp. coagulase negativos), foram avaliados atrav?s dos testes de difus?o em disco simples, microdilui??o em ?gar e detec??o dos genes vanA e B. O teste de suscetibilidade antimicrobiana revelou elevada resist?ncia aos beta-lact?micos para todos os grupos avaliados. No ensaio de difus?o em disco, os isolados coagulasepositivos apresentaram um perfil de resist?ncia de 24% a teicoplanina (24/100) e 23% a vancomicina (23/100). No teste de microdilui??o em ?gar para detec??o da CIM, 16% dos isolados apresentaram resist?ncia ? vancomicina (16/100). Entre os isolados resistentes no teste de microdilui??o em ?gar, 56,25% dos isolados (9/16) apresentaram valores de CIM que variaram entre 4-8?g/ml. Os Staphylococcus coagulase-negativos n?o apresentaram resist?ncia aos glicopeptideos. Os genes de resist?ncia ? vancomicina foram detectados em 37,5% dos isolados vancomicina-resistentes (6/16). Para se buscar uma correla??o entre a presen?a de resist?ncia aos glicopeptideos e a capacidade de forma??o de biofilme foram realizados os testes de caracteriza??o de crescimento em ?gar vermelho congo e detec??o de biofilme pelo teste de ader?ncia em microplacas, onde foram detectados 66,66% e 90,00% respectivamente, de isolados produtores de biofilme. A produ??o de ?slime? n?o apresentou correla??o estat?stica com a resist?ncia aos glicopept?deos. O perfil de sensibilidade dos isolados de Staphylococcus spp. foi avaliado frente as bacteriocinas produzidas pelos Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophillus e Lactobacillus fermentum. As bacteriocinas que apresentaram maior capacidade de inibi??o frente aos Saphylococcus spp. testados foram as produzidas pelos Lactobacillus paracasei

Diseases caused by microbes are worldwide cause of morbidity and public health risks. Despite undisputed global benefits of antibiotics, the occurrence of infections caused by antibiotics-resistant bacteria becomes more frequent. This can be attributed to increased consumption of antibiotics in the long term, but also to their inappropriate use. Appart from that, progress in the field of synthetic antibacterial drugs research is dramatically stagnating in recent decades, plus the the antibiotics have bad effects to many bacteria types beneficial to human body. This generates a strong need to seek for natural remedies with similar or better antimicrobial effects. It is known that many plants produce a wide range of secondary metabolites with antimicrobial effects. Such metabilites inhibit growth and reproduction of pathogenic microorganisms by various mechanisms. From explored herbal medicines hemp, traditionally used to cure many diseases, appears to be a suitable alternative to antibiotics. This thesis focuses on the antimicrobial activity of extracts of six different cannabis genotypes. Extracts with different ratios of cannabinoids have been tested using in vitro microdilution method on selected pathogens, causing skin disease (Staphylococcus spp., Streptococcus spp.). Results confirmed the antimicrobial activity of all tested extracts. Very good minimum inhibitory concentration was assessed mainly for Streptococcus spp. with a concentration of 4 ug/ml. Extracts NHS4, JB3 and CK3 showed best results against all pathogens, with minimal inhibitory concentrations in the range from 4 to 16 ug/ml. Only extracts of CK2, N3 and JC1 have proven ineffective (MIC 512 ug/ml), because they could not be evaluated by the inhibitory concentration.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-10-23Bitstream added on 2014-06-13T19:49:34Z : No. of bitstreams: 1 calsolari_rao_me_botfm.pdf: 821723 bytes, checksum: 3a4c79807386500660831486c076c8ca (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / The Staphylococcus spp. are often found in the hospital ambient, being associated with a large infection variety. Several factors of virulence are responsible for the Staphylococcus pathology, and the enter toxin originated from Staphylococcus and the TTST -1 (toxin of toxic shock syndrome) are accentuated among them. In this study, ninety Staphylococcus aureus patterns and ninety negative-coagulation of Staphylococcus patterns, isolated from different clinical materials, were examined by the PCR technique for the gene's research which encode the toxins originated from Staphylococcus A (sea), B (seb), C (sec-1 ), D (sed) and TTST -1 (tst). The patterns that appeared positives for the presence of one or more genes were tested by the production capacity of the respective toxins by the RT -PCR technique. In relation to ECN species, the S. epidermidis was isolated to a large frequency, corresponding to 71, 1% of the total of ECN examined patterns, as well as S. warneri (6, 7%), S. haemolyticus (5, 6%), S. hominis (5, 6%), S.lugdunensis (5, 6%)J S. simulans (3, 3%), S. saprophyticus (1, 1 % ) and S. Xylosus (1, 1 %). The results revealed a total of 108 toxicological patterns, corresponding to 59 (54, 6%) S. aureus patterns and 49 (45, 4%) ECN patterns with one or more toxicological genes. Among the ECN studied species, only the S. simulans type didn't present genes that encode toxins originated from Staphylococcus. TheS.aureus showed toxicological genes for ali the classes of examined toxins, while the ECN presented genes to the A (sea), B (seb) C (sec-1) and TSST -1 (tst) toxins. The sec-1 gene was the most found as well in S.aureus patterns as in ECN, while the seb gene was the most frequent in S. aureus. The detection of the toxin production by the RT -PCR technique revealed43 positive patterns, corresponding to 37 (86, 0% ) S.aureus patterns producers of EEA, EEB, EEC, EED, and/or TSST -1 and six (14, 0%) ECN patterns producers of EEA and EEC.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-22T12:04:28Z No. of bitstreams: 1 fernandafernandesdossantos.pdf: 1359737 bytes, checksum: adaeb451590b863f3a59b02724e66c15 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T13:59:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandafernandesdossantos.pdf: 1359737 bytes, checksum: adaeb451590b863f3a59b02724e66c15 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T13:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandafernandesdossantos.pdf: 1359737 bytes, checksum: adaeb451590b863f3a59b02724e66c15 (MD5) Previous issue date: 2014-02-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Entre os principais patógenos causadores da mastite bovina estão as bactérias do gênero Staphylococcus. Nas últimas décadas, a resistência à oxacilina (meticilina) neste gênero tem sido motivo de preocupação, pela possibilidade de redução da efetividade dos tratamentos da mastite, e pela possibilidade de transferência de determinantes de resistência de uma bactéria para outra. A resistência à oxacilina é mediada pela proteína PBP 2a, codificada pelo gene mecA, que confere resistência a todos os antibióticos β-lactâmicos, inclusive às cefalosporinas e carbapenemas. O gene mecA faz parte de uma ilha genômica chamada staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), que pode incluir também outros genes de resistência. Neste trabalho, a resistência à oxacilina foi avaliada em 170 bactérias do gênero Staphylococcus isoladas de mastite subclínica, sendo 79 S. aureus e 91 Staphylococcus spp. coagulase-negativos (STACN). As bactérias foram provenientes de seis estados brasileiros, sendo quatro de Minas Gerais, 27 do Paraná, três de Pernambuco, onze do Rio Grande do Sul, 56 de Santa Catarina e 69 de São Paulo. O perfil de susceptibilidade a dez antimicrobianos utilizados na prática veterinária foi determinado pelo método E-TEST®. A caracterização fenotípica da resistência à oxacilina foi realizada através do teste de difusão com discos de oxacilina e cefoxetina, teste de diluição em ágar com oxacilina e E-TEST® com oxacilina. Em todas as amostras foi pesquisado, por PCR, o gene mecA, empregando dois pares de oligonucleotídeos iniciadores que amplificam regiões diferentes do gene. As bactérias com fenótipo de resistência à oxacilina foram identificadas através do sequenciamento de um fragmento de 536 pb do rRNA 16S. Neste grupo foi pesquisado ainda o gene mecC e o gene blaZ, que codifica para a enzima β-lactamase. Os produtos de PCR foram sequenciados para confirmação dos resultados. Foi feita a análise molecular dos genes mecA por meio da tipagem do cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) e das amostras mecA positivas através da macrorrestrição do DNA cromossômico seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Com exceção da penicilina e da oxacilina, mais de 86% das estirpes de estafilococos apresentaram susceptibilidade à cefalotina, gentamicina, clindamicina, eritromicina, enrofloxacina, sulfonamida, sulfametoxazol + trimetoprima e tetraciclina. Todas as estirpes de S. aureus foram susceptíveis à oxacilina, enquanto 29,7% das estirpes de STACN foram resistentes. STACN foram mais resistentes do que S. aureus à cefalotina e à eritromicina (p ≤ 0,01) e à gentamicina, clindamicina, e tetraciclina (p ≤ 0,05). A susceptibilidade das amostras S. aureus e de STACN foi semelhante para penicilina, enrofloxacina, sulfonamida e sulfametoxazol + trimetoprima. O teste de difusão em ágar com disco de cefoxetina apresentou maior sensibilidade e especificidade quanto à presença do gene mecA. Do total de amostras estudadas, 31 STACN foram fenotipicamente resistentes à oxacilina em pelo menos um dos testes realizados, e somente em dez foi detectado o gene mecA. As bactérias mecA positivas foram identificadas como S. epidermidis e classificadas em três pulsotipos (A, B e C) e quatro subtipos (A1, B1, B2 e B3). Entre as amostras com fenótipo de resistência à oxacilina 16 foram positivas para o gene blaZ, sendo sete mecA negativas e nove mecA positivas. Nenhuma das amostras analisadas amplificou o gene mecC e duas amplificaram o gene mecA-like de S. sciuri. Foram encontrados três tipos de SCCmec, os tipos I, IV e V. Os resultados sugerem que S. epidermidis pode ser um reservatório da resistência à oxacilina para outras espécies de estafilococos, tanto do homem quanto de animais. Estudos que gerem informações sobre o perfil fenotípico e molecular da resistência aos antimicrobianos em espécies de estafilococos devem ser realizados para o controle da disseminação da resistência e para que medidas terapêuticas sejam escolhidas adequadamente. / Among the major pathogens of bovine mastitis are bacteria of the genus Staphylococcus. In recent decades, resistance to oxacillin (methicillin) in this genus has been a matter of concern for the possibility of reducing the effectiveness of mastitis treatments, and transferring of resistance determinants. The oxacillin resistance is mediated by PBP 2a protein, encoded by the mecA gene, which confers resistance to all β-lactam antibiotics, including cephalosporins and carbapenems. The mecA gene is part of a genomic island called staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), which may also include other resistance genes. Oxacillin resistance was studied in 170 Staphylococcus isolated from subclinical mastitis, 79 S. aureus and 91 coagulase-negative staphylococci (CNS). The bacterial strains were isolated from six Brazilian states; four from Minas Gerais, 27 from Paraná, three from Pernambuco, eleven from Rio Grande do Sul, 56 from Santa Catarina and 69 from São Paulo. The susceptibility profile to ten antimicrobial agents used in the veterinary practice was determined by E-TEST® method. Phenotypic characterization of oxacillin resistance was performed by disk diffusion test with oxacillin and cefoxitin, agar dilution test with oxacillin and E-TEST® with oxacillin. All strains were screened by PCR to detect mecA gene using two pairs of primers amplifying different regions of the gene. The strains with oxacillin resistance phenotype were identified by sequencing a 536 bp fragment of 16S rRNA gene. This group was also evaluated for the presence of the gene mecC and blaZ, which encodes for the enzyme β-lactamase. The PCR products were sequenced to confirm the results. Molecular analysis of mecA gene was carried out by the typing of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) and the mecA-positive strains by macrorestriction of chromosomal DNA followed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). With the exception of penicillin and oxacillin, more than 86% of the strains presented susceptibility to cephalothin, gentamicin, clindamycin, erythromycin, enrofloxacin, sulfonamide, trimethoprim-sulfamethoxazole and tetracycline. All S. aureus strains were sensitive to oxacillin, while 29.7% of the CNS strains were resistant. The CNS were more resistant than S. aureus to cephalothin and erythromycin (p ≤ 0.01) and gentamicin, clindamycin, and tetracycline (p ≤ 0.05). The agar diffusion test with cefoxitin disc showed higher sensitivity and specificity for the presence of the mecA gene. Considering the total strains studied, 31 CNS were phenotypically resistant to oxacillin in at least one of the tests, and only in ten CNS was detected the mecA gene. mecA-positives bacteria were identified as Staphylococcus epidermidis and classified into three pulsotypes (A, B and C) and four subtypes (A1, B1, B2 and B3). Among strains with oxacillin resistance phenotype, 16 were positive for blaZ gene, seven mecA-negatives and nine mecA-positive strains. Two of the oxacillin resistant strains amplified mecA-like gene of S. sciuri and none amplified mecC. Three SCCmec types were found, types I, IV and V. The results suggest that S. epidermidis can be a reservoir of oxacillin resistance to other species of staphylococci, both of human and animals. Studies that generate information about the molecular and phenotypic profile of antimicrobial resistance in staphylococcal species should be performed for controlling the spread of resistance and selection of appropriate therapeutic measures.

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Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lidiane de Castro Soares.pdf: 3621583 bytes, checksum: ed47c1ba184a35cfda362913c8e922a3 (MD5) Previous issue date: 2010-02-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Coagulase-negative staphylococci (SCN) take part of the normal microbiota. Although this bacteria has been considered saprophytic, nowadays there is a concern about its pathogenic potential. Nevertheless, the improvement in SCN identification assays, it continues to be neglected in laboratorial routine of infectious diseases because of the wide range of species. In spite of this, the appropriated identification of the species is necessary in order to differentiate the potential pathogenic agents and to determine its antimicrobial susceptibility pattern. The present study was performed to characterize phenotypically and genotypically the antibiotic resistance profile and virulence factors of coagulase-negative Staphylococcus spp. isolated from milk samples of cows with subclinical mastitis. Staphylococcus xylosus, S. haemolyicus, S. cohnii and S. hominis were the identified species. Antimicrobial susceptibility test yielded a high level of resistance to penicillin and ampicillin. A total of 100 isolates were studied, mecA gene was detected in 4% of isolates, also mecR1 positive. The mecI gene was detected in 47% of isolates. All mec genes (mecA-mecI-mecR1) were detected in only 2 isolates. The production of betalactamases and blaZ gene were detected in 16% of the isolates. From this, only 3 isolates showed all bla genes (blaZ, blaI e blaRI). All bla positive isolates were penicillin and ampicillin resistant and positive to nitrocefin test. The femA gene was not detected in any of the isolates. Concerning to the virulence factors, microplate technique and the congo red agar presented production of slime in 46% and 77% of the isolates, respectively. The icaA and icaD genes were detected in 9% and 10% of isolates, respectively. Hemolysis was detected in 13% of the isolates, 15,4% of total hemolysis and 84,6% partial hemolysis. The hla and hlb genes were not detected in any isolate. The hemolytic synergism was positive in 15 isolates, of these 14 showed no hemolysins. Unable to establish a correlation between phenotypic and genotypic resistance to beta-lactam antibiotics in isolates. / Os estafilococos coagulase-negativos (ECN) fazem parte da microbiota normal da pele e apesar de terem sido considerados sapr?fitas por muito tempo, o seu significado cl?nico como agente etiol?gico tem aumentado com o passar dos anos. No entanto, apesar de todo avan?o nas t?cnicas de identifica??o dos ECN e do conhecimento destes como agentes etiol?gicos em diversos processos infecciosos, estes microrganismos muitas vezes s?o negligenciados na rotina laboratorial. A identifica??o das esp?cies de ECN, embora de dif?cil realiza??o para a maioria dos laborat?rios cl?nicos, ? necess?ria para diferenciar o potencial patog?nico e o perfil de resist?ncia de cada isolado. O presente estudo foi conduzido para caracterizar fenot?pica e genotipicamente o perfil de resist?ncia aos antibi?ticos, especialmente ? oxacilina, e fatores de virul?ncia de isolados de Staphylococcus spp. coagulase-negativos provenientes de amostras de leite de vacas com mastite subcl?nica. Foram identificadas as esp?cies Staphylococcus xylosus, S. haemolyicus, S. cohnii e S. hominis. O teste de suscetibilidade antimicrobiana revelou elevada resist?ncia ? penicilina e ampicilina. Do total de 100 isolados estudados, o gene mecA foi detectado em apenas 4 (4%), os quais tamb?m foram mecR1 positivos. O gene mecI foi detectado em 47% dos isolados. Em 2 isolados foram detectados todos os genes do sistema mec (mecA-mecI-mecR1). A produ??o de beta-lactamases e do gene blaZ foi detectada em 16% dos isolados. Em 3 isolados foram detectados todos os genes do sistema bla (blaZ, blaI e blaRI). Todos os isolados bla positivos foram resistentes a penicilina e ampicilina e positivos no teste do nitrocefin. O gene femA n?o foi detectado em nenhum dos isolados avaliados. Em rela??o aos fatores de virul?ncia, a t?cnica da microplaca e o ?gar contendo vermelho congo revelaram 46% e 77% de isolados produtores de slime , respectivamente. Os genes icaA e icaD foram detectados em 9% e 10% dos isolados, respectivamente. A hem?lise foi detectada em 13% dos isolados, destes 15,4% apresentaram hem?lise total e 84,6% a hem?lise parcial. Os genes hla e hlb n?o foram detectados em nenhum isolado. O sinergismo hemol?tico foi positivo em 15 isolados sendo que destes, 14 n?o apresentaram hemolisinas. N?o foi poss?vel estabelecer uma correla??o entre os testes fenot?picos e genot?picos de resist?ncia aos antibi?ticos beta-lact?micos nos isolados avaliados.

Introdução: O leite pode ser considerado um dos alimentos mais completos por apresentar alto teor de proteínas e sais minerais, porém, também é considerado excelente meio de cultura para microrganismos. Objetivos: Identificar o número de UFC de Staphylococcus spp. e Klebsiella pneumoniae, cultivados isoladamente ou em associação, em leite integral estéril, a 6 oC, 27 oC e 37 oC e descrever a curva de morte térmica, quando submetidas ao processo de pasteurização lenta isoladamente ou em associação. Material e Métodos: Avaliação através da contagem das UFC, do comportamento de Staphylococcus spp. e K. pneumoniae, isoladas de tanque de refrigeração de leite, submetidas a temperaturas que simulam o leite em condições de refrigeração (6 °C), condições ambientais (25 °C) e na temperatura ideal de crescimento de patógenos mesófilos (36°C). Avaliação da sensibilidade de Staphylococcus spp. e K. pneumoniae isoladas e em associações ao processo de pasteurização lenta. Resultados: Na escala 1 de Mac Farland a média de UFC de K. pneumoniae foi maior que a de Staphylococcus spp. A 6 °C as bactérias no leite, isoladas ou em associação crescem na mesma velocidade. A 25 °C a K. pneumoniae cresce mais que o Staphylococcus spp. A 25 °C K. pneumoniae associada ao Staphylococcus spp. cresce mais do que quando encontra-se isolada. A 36 °C K. pneumoniae associada ao Staphylococcus spp. cresce mais do que quando encontra-se isolada e ainda mais que a 25 °C. A pasteurização lenta foi efetiva, pois reduziu em no mínimo 90% as UFC no leite após 30 minutos a 65 °C. Conclusão: a medida que aumenta a temperatura, até 36 °C, a Klebsiella pneumoniae apresenta crescimento superior ao Staphylococcus spp., a contaminação de leite por Klebsiella pneumoniae (contaminação ambiental) irá influenciar mais na qualidade do produto final, comparando-se à contaminação por Staphylococcus spp., oriundo de mastite e a interação de microrganismos altera a morte dos mesmos, recomendando-se que novos estudos sejam realizados para que se entenda melhor esse processo. / Introduction: The milk can be considered one of the most complete food for its high contents of protein and minerals, but also it is considered an excellent medium of culture for microorganisms. Objective: To identify the number of the Colony Forming Units of Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae, in integral sterile milk, at different temperatures (6ºC, 27ºC e 37ºC) and to describe a thermal curve death, when submitted to the process of slow pasteurization isolated or in association. Materials and methods: Evaluation by counting of the colony forming units and the behavior of the Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae, isolated and in association occurred in the cooling tank, submitted to temperatures that simulate the conditions of milk in cooling (6ºC), environmental condition (25ºC) and the optimal temperature for the growth of microorganisms (36ºC). Evaluation of the sensibility of Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae isolated and in association during the pasteurization process. Results: In Scale 1 of Mac Farland the average of the colony form units of the K. pneumoniae was greater than the colony of Staphylococcus spp. At 6ºC the microorganisms in the milk isolated or in association grew at the same speed. At 25ºC K. pneumoniae associated with Staphylococcus spp. grew more than when they were isolated. At 36ºC K. pneumoniae associated with Staphylococcus spp. grew more then when it was isolated and more than at 25ºC. So we can conclude that the slow pasteurization was effective, because it has reduced at least 90% of the colony form unity in the milk after 30 minutes at 65ºC. Conclusion: By raising the temperature up to 36ºC, a Klebsiella pneumoniae had a superior growth when compared with Staphylococcus spp.; the contamination of milk by Klebsiella pneumoniae (environmental contamination) influences the most the quality of the final product when compared to the contamination by Staphylococcus spp. from mastitis, we can also conclude that the interaction of microorganisms modify the death rate of them. New studies and researches are recommended to a deeper and better comprehension of this process.