Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les données de séquençage des génomes ont révélé une nouvelle famille de protéines UPF0079, comprenant des protéines de fonction inconnue qui sont exclusivement et largement présentes chez les bactéries et qui possèdent un motif A de Walker dans leur séquence. La caractérisation biochimique et l'élucidation du rôle physiologique de cette famille contribueront à élargir nos connaissances en biologie fondamentale, et sont également un préalable vers le développement de nouveaux composés antimicrobiens. Notre étude sur YdiB, un archétype de cette famille chez Bacillus subtilis a révélé à la fois l‟autophosphorylation de YdiB et son activité de protéine kinase. L‟activité kinase de double spécificité Ser/ Thr et Tyr de YdiB semble nécessiter son oligomérisation et semble être stimulée par des molécules basiques telles que des polyamines naturelles ou la poly-L-lysine. Les 10 résidus les plus conservés chez cette famille ont été étudiés afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire de YdiB. Concernant la caractérisation fonctionnelle de la phosphorylation liée à YdiB, l‟étude de l‟opéron ydiA-B-C-D-E de B. subtilis nous a permis de montrer que YdiB et YdiC fonctionnent comme un couple de protéine kinase/phosphatase de deux protéines substrats dont les fonctions seraient liées aux ribosomes, YdiD et YdiE. Une co-localisation partielle entre YdiB et les ribosomes a été observée. En outre, YdiB est capable de phosphoryler des protéines ribosomiques appartennant aux deux sous-unités 50S et 30S, ainsi que deux GTPases impliquées dans la biogénèse des ribosomes, EngA et EngB. Nous avons également démontré que EngA phosphorylée par YdiB est un substrat in vitro de la phosphatase YdiC. Enfin, basé sur le phosphoprotéome de Bacillus subtilis, des peptides mimant des sites de phosphorylation in vivo ont été utilisés. Certains entre eux sont phosphorylés in vitro par YdiB. Deux de ces peptides appartiennent à la superoxyde dismutase, SodA, dont l'activité in vitro et après purification est régulée positivement via la phosphorylation par YdiB. Nous avons ensuite constaté que les cellules de B. subtilis dépourvues du gène ydiB sont plus sensibles aux agents oxidants tels que le paraquat ou la norfloxacine. Nous proposons que, in vivo, YdiB fonctionne comme une protéine kinase impliquée dans l‟activité et/ou la stabilité des ribosomes dans des conditions physiologiques normales, et YdiB contribuerait à protéger les cellules contre les dommages du stress oxydatif.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 18 sept. 2007). Bibliogr.

La myopathie centronucléaire (CNM) est un groupe de maladies génétiques caractérisées au niveau histologique par des noyaux au centre des myofibres au lieu de la périphérie. Des mutations dans trois gènes (MTM1, DNM2 et BIN1) sont associées à cette pathologie. Récemment, l’implication d’un nouveau gène a été révélée dans une myopathie congénitale, le gène PYROXD1. Cependant, la base moléculaire responsable du déséquilibre à l'intérieur de la cellule reste incertaine et la relation entre le niveau histologique et les symptômes chez les patients n'est pas comprise. De plus, aucun traitement n'est disponible pour ces maladies. Au cours de ma thèse, j'ai centré mon travail sur l'utilisation du modèle de levure S. cerevisiae pour comprendre trois protéines associées au CNM : la myotubularine Mtm1, l'oxydoréductase Pyroxd1 et la dynamine Dnm2. Ces données révèlent qu’il est possible d’utiliser une simple cellule eucaryote afin d'élucider certains aspects moléculaires de ces protéines impliquées dans des maladies humaines. / Centronuclear myopathy (CNM) is a group of genetic disorders characterized at the histological level by nuclei at the center of the myofibers instead of the periphery. Mutations in three genes (MTM1, DNM2 and BIN1) are associated with this pathology. Recently the implication of a new gene has been revealed in a congenital myopathy, the PYROXD1 gene.However, the molecular basis responsible for the imbalance inside the cell remains unclear and the relation between the histological level and the symptoms in patients is not understood. Moreover, there is no treatment available for these diseases.During my thesis I have focused my work on using yeast S. cerevisiae model to understand three proteins associated to CNM: the myotubularin Mtm1, the oxidoreductase Pyroxd1 and the dynamin Dnm2. These data reveal that it is possible to use a single eukaryote cell to elucidate some molecular aspects of these proteins implicated in human disorders.

Lorsque les cellules normales évoluent vers un état néoplasique, elles acquièrent de nombreuses caractéristiques. Par exemple, ces cellules exhibent des voies métaboliques anormales et possèdent la capacité d’échapper à la destruction par les cellules de l’immunité, notamment en exploitant des points de contrôles immunitaires ou « immune checkpoints ». La molécule PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1) appartient à la famille de protéines immuno-régulatrices B7 et a tout d’abord été décrite comme impliquée dans l’immuno-échappement tumoral suite à son interaction avec PD-1, récepteur exprimé à la surface des lymphocytes T. Associée à un mauvais pronostic, une expression aberrante de PD-L1 est retrouvée dans les hémopathies malignes ainsi que dans de multiples tumeurs solides. De manière intéressante, il a été montré que PD-L1 possède également des fonctions pro-tumorales intrinsèques. En effet, cette protéine joue un rôle dans la prolifération des cellules cancéreuses et leur résistance aux chimiothérapies, sans interagir avec PD-1. Toutefois, les mécanismes moléculaires modulés par PD-L1 et impliqués dans ces fonctions sont encore inconnus. Des voies métaboliques anormales ont été décrites comme pouvant contribuer à la croissance tumorale et la résistance aux thérapies. Ainsi, les objectifs de ma thèse ont été d’explorer le potentiel rôle de la protéine PD-L1 dans le métabolisme des cellules tumorales. En utilisant la méthode d’édition du génome avec les Zinc Finger Nucleases, nous avons invalidé le gène CD274 codant la protéine PD-L1 dans les cellules cancéreuses de sein MDA-MB-231 et investigué les fonctions métaboliques de cette molécule après surexpression dans ces mêmes cellules. Nous avons observé que PD-L1 induit un shift de la phosphorylation oxydative vers la glycolyse, correspondant à l’effet Warburg. Afin de valider cette reprogrammation métabolique, nous avons analysé le profil métabolique de ces cellules et mis en évidence une élévation des niveaux des intermédiaires de la glycolyse tels que le F-6-P, le F-1,6-P, le GAP, le DHAP, le PEP et le pyruvate dans la lignée surexprimant PD-L1, confirmant nos précédents résultats. D’autre part, et en accord avec nos observations quant à une augmentation de la production de ROS (Reactive Oxygen Species), nos données transcriptomiques suggèrent une répression de la voie de réponse au stress oxydatif NRF2 suite à l’expression de PD-L1 et notamment de ses gènes cibles tels que NQO2, GSTM3 et ABCC2. En outre, l’analyse in silico de bases de données de cohortes de patients atteints de cancer du sein a révélé une corrélation entre l’expression du gène PD-L1/CD274 et l’expression des gènes de la voie du stress oxydant (GSTM3 ; CYBB) ou des gènes codant les transporteurs de glucose (SLC2A1/GLUT1 ; SLC2A3/GLUT3), ces données supportant nos résultats obtenus in vitro. Par ailleurs, le glucose étant principalement utilisé par les cellules cancéreuses pour favoriser la biosynthèse de diverses biomolécules nécessaires à la prolifération cellulaire, ces résultats pourraient expliquer la tumorigénicité augmentée dans la lignée surexprimant PD-L1 lors des expériences de xénogreffe de cellules de cancer du sein humain chez des souris Nude. Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse mettent en évidence de nouvelles fonctions intrinsèques de PD-L1 promouvant le développement tumoral, suggérant l’utilisation d’agents thérapeutiques inhibant ces mécanismes seraient prometteurs pour le traitement du cancer du sein. / Evolving to a neoplastic state, normal cells acquire many characteristics; indeed, tumor cells follow abnormal metabolic pathways and exhibit the ability to avoid immune destruction, partly by exploiting immune checkpoints. Many of these are currently under clinical investigation for new cancer treatments, notably the PD-1/PD-L1 axis.Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) molecule belongs to the B7 immunoregulatory proteins family and was originally described as mediating tumor immuno-escape through interaction with its receptor PD-1 on T cells. Associated with poor cancer outcome, aberrant PD-L1 expression has been observed in hematologic malignancies and in multiple solid tumor types. Actually, this protein has been shown to regulate tumor cell proliferation and resistance to chemotherapy through apoptosis inhibition, without interacting with PD-1. However, cellular mechanisms modulated by PD-L1 and involved in these functions are still unclear. Abnormal metabolic pathways are known for contributing to tumor growth and therapy resistance; therefore, the objective of my PhD thesis was to investigate the impact of PD-L1 in breast cancer cell metabolic reprogramming.Using genome editing, we knocked-out the CD274 gene encoding PD-L1 in breast cancer cell line MDA-MB-231 and investigated metabolic functions after PD-L1 overexpression in the same cells. We observed that PD-L1 induces a shift from oxidative phosphorylation to glycolysis, indicating this molecule promotes the Warburg effect in these tumor cells. To validate PD-L1 metabolic reprogramming, we performed metabolomic profiling that highlighted significantly increased levels of glycolysis intermediated such as F6P, F1,6P, GAP, DHAP, PEP and pyruvate in PD-L1-expressing cells, confirming our latter results. Moreover, in agreement with an increasing mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, transcriptomic study suggested that PD-L1 represses NRF2-mediated oxidative stress response pathway, especially NQO2, GSTM3 and ABCC2 genes. Furthermore, in silico analysis of breast cancer patients databases highlighted a correlation between PD-L1/CD274 gene and oxidative stress gene signature (GSTM3; CYBB) or glucose transporters genes (SLC2A1; SLC2A3) expressions, supporting our results. Besides, glucose is mostly used by cancer cells to favor biosynthesis of diverse biomolecules required for cellular proliferation; the above results could explain our human breast cancer cells xenograft experiments in Nude mice demonstrating that PD-L1 increases tumoreginicity.Thus, the work presented in this thesis evidences novel PD-L1 intrinsic tumor-promoting functions, suggesting that therapeutic agents inhibiting these mechanisms would be promising for breast cancer treatment.

Les hépatopathies médicamenteuses survenant sur un mode idiosyncrasique représentent un obstacle majeur au développement de médicaments et sont à l’origine du retrait du marché de nombreux d’entre eux. Un des mécanismes mis en cause est lié à la survenue d’un épisode inflammatoire aigu qui, lors d’un traitement médicamenteux, sensibiliserait le foie pour les effets indésirables des médicaments, mettant en évidence leur toxicité idiosyncrasique. A l’heure actuelle, la détection précoce de médicaments potentiellement hépatotoxiques dans un contexte inflammatoire avant leur mise sur le marché, reste encore difficile et leurs mécanismes sous-jacents ne sont pas clairement élucidés. Dans ce contexte, notre travail s’articule sur 3 axes : 1) Développer un nouveau modèle cellulaire in vitro humain, adaptable au criblage à haut débit prédictif d'hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire, basé sur l’exposition synergique des cellules HepG2 cultivées dans des conditions particulières exposées à des médicaments potentiellement idiosyncrasiques et des médiateurs pro-inflammatoires(LPS et TNF- ).2) Elucider les mécanismes sous jacents de la toxicité de 4 médicaments idiosyncrasiques connus (trovafloxacine, nimésulide, télithromycine et néfazodone), en mettant l'accent sur le stress oxydatif, la stéatose et la cholestase 3) Etudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la mort cellulaire observée lors d’une hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire. Ainsi, nous avons développé un modèle cellulaire humain prédictif d’hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire sensible, spécifique et applicable au criblage en haut débit d’un grand nombre de médicaments. Pour cela, nous avons étudié dans ce modèle, les effets toxiques de quatre médicaments testés et élucidé leurs mécanismes. La trovafloxacine exerce un effet cholestatique par diminution de l’expression et de l’activité de MDR1 et MRP2. Le nimésulide favorise l'accumulation intracellulaire de radicaux superoxydes en plus de son potentiel cholestatique par inhibition de l’activité MRP2. La télithromycine favorise une hépatotoxicité principalement via un mécanisme cholestatique impliquant l’inhibition de MDR1. La néfazodone favorise l'accumulation des radicaux superoxydes en plus de son potentiel stéatosique important et de son effet inhibiteur sur les deux transporteurs MDR1 et MRP2. Bien que chaque médicament idiosyncrasique testé présente un mécanisme de toxicité différent, ils ont tous entraîné une mort hépatocellulaire amplifiée en présence de LPS et TNF- , via la voie apoptotique intrinsèque pour la trovafloxacine, extrinsèque pour la néfazodone et les deux voies de l'apoptose pour le nimésulide et la télithromycine. Le potentiel apoptotique amplifié des quatre médicaments s'est avéré être médié par la surexpression de Bax et de caspase 8 via un mécanisme dépendant de ERK ½. Nos résultats indiquent que notre modèle peut être utilisé non seulement comme un outil préclinique pour l'identification de nouveaux médicaments qui pourraient être potentiellement hépatotoxiques lors d’un stress inflammatoire, mais aussi pour l'élucidation de leurs mécanismes. / Idiosyncratic adverse drug reactions (IADRs) are considered as an important subset of ADRs, accounting for approximately 13% ofall acute liver failure cases and representing one of the leading causes for post-marketing drug withdrawal (Shaw et al. 2010). The lack of effective in vitro or in vivo models able to predict the hepatotoxic potential of idiosyncratic drugs before being approved formarketing on one hand, and the ambiguity of the mechanisms underlying their hepatic pathogenesis on the other hand render IADRs a perplexing human health problem (Shaw et al. 2010). Accordingly, the work presented in this thesis was based on three main objectives: 1) Development of a high throughput human-based cellular model for the prediction of inflammation associated idiosyncratic drug-induced hepatotoxicity; based on the synergistic exposure of HepG2 cells to potentially hepatotoxic drugs and proinflammatory mediators (LPS and TNF- ). 2) Elucidation of the hepatotoxic mechanisms underlying four known idiosyncratic drugs (trovafloxacin, nimesulide, telithromycin and nefazodone) with emphasis on oxidative stress, steatosis and cholestasis.3) Investigation of the molecular mechanisms underlying drug-inflammation synergistic induction of hepatocellular death Firstly, the results attained in this thesis demonstrated that the developed model is sensitive, specific and applicable to high throughputtoxicity screening of different categories of drugs. Secondly, our results demonstrated that the inflammation associated hepatotoxicpotentials of the four tested idiosyncratic drugs are mediated as follows: trovafloxacin exerts a cholestatic potential that involves thedown-regulation of both MDR1 and MRP2. Nimesulide promotes the intracellular accumulation of superoxide anions in addition topotently inhibiting MRP2. Telithromycin promotes hepatotoxicity predominately via a cholestatic mechanism that involves the downregulation of MDR1. Nefazodone favors the accumulation of superoxide anions in addition to its prominent steatotic potential and inhibitory effect on both MDR1 and MRP2. Although each of the idiosyncratic drugs exhibited a different mechanism of toxicity they all induced amplified hepatocellular death in presence of LPS and TNF- , which proved to be mediated via the intrinsic apoptotic pathway for trovafloxacin, the extrinsic for nefazodone and both apoptotic pathways for nimesulide and telithromycin. The amplified apoptotic potential of the four drugs proved to be based on the up-regulation of Bax and caspase 8 via an ERK½-dependent mechanism. These results indicate that the presented drug-inflammation model constitute an effective pre-clinical tool not only for the detection of inflammation-associated hepatotoxic drugs but also for the elucidation of their underlying mechanisms.

La qualité nutritionnelle de la mangue se construit du champ à la mise sur le marché. Outre le stade de maturité à la récolte, les facteurs environnementaux comme l'irrigation en pré-récolte, ou la température de stockage en post-récolte peuvent avoir une incidence sur la composition du fruit. Les caractéristiques physico-chimiques de la mangue sont également reliées à sa réponse aux espèces réactives d'oxygène (ERO) générées naturellement par la maturation, mais aussi par les contraintes externes (stress abiotiques), avec une incidence directe sur la durée de vie commerciale et la qualité du fruit. Ce travail de thèse a pour objectifs d'évaluer les effets relatifs du stade de récolte, du déficit hydrique ou de la conservation au froid (7 et 12 °C) sur la capacité de réponse de la mangue Cogshall aux ERO et sa capacité de synthèse en caroténoïdes et en polyphénols, composés impliqués dans la qualité nutritionnelle et participant avec l'ascorbate à la régulation du stress oxydatif. L'identification des caroténoïdes et composés phénoliques de la mangue Cogshall, a permis (i) d'approfondir les connaissances existantes sur le cultivar et (ii) de disposer d'un référentiel pour évaluer l'impact des paramètres abiotiques étudiés. La maturation induit un stress oxydatif majeur, mais il est montré que le potentiel de régulation du stress oxydatif lié aux conditions environnementales est partiellement lié au stade de maturité. À la récolte à un stade vert-mature, le déficit hydrique appliqué se traduit par une augmentation du stress oxydatif, avec des teneurs plus élevées en H2O2 et des teneurs en ascorbate plus importantes pour les fruits les plus précoces, une synthèse des teneurs en composés phénoliques marquée. En revanche après maturation, le stress associé à la crise respiratoire estompe les tendances observées quel que soit le stade de récolte. La voie de biosynthèse des caroténoïdes est modulée par le déficit hydrique avec une accumulation marquée d'acide abscissique. Le stockage à basse température pendant 14 jours favorise le stress oxydatif. Après maturation à 20 °C, le stade de récolte et de la température appliquée vont moduler le métabolisme des mangues. Les fruits précoces stockés à basses températures ont les teneurs en caroténoïdes les plus faibles et une capacité de réponse peu développée aux ERO alors que des fruits plus avancés ont un système de défense plus actif et une meilleure accumulation des caroténoïdes. Enfin, les corrélations entre les descripteurs de qualité classiques et la composition des fruits mettent évidence des relations assez robustes entre teneurs en sucres et extrait sec soluble et caroténoïdes majoritaires et angle de teinte, mais montrent aussi des décalages entre caroténoïdes totaux et angle de teinte, entre acidité titrable et acides organiques, quand les fruits sont conservés au froid. / The construction of mango nutritional quality begins in the field and ends on the shelf. In addition to the ripening stage at harvest, environmental factors such as irrigation and post-harvest storage temperature can influence fruit composition. The physico-chemical properties of mango are also related to its response to reactive oxygen species (ROS) that are naturally generated during ripening, as well as to external constraints (abiotic stress), which have a direct impact on shelf life and fruit quality. The aim of this thesis is to evaluate the effects of harvest stage, water deficit and cold storage (7 and 12 °C) on the response ability of Cogshall mango towards ROS and on its ability to synthesize carotenoids and phenolics compounds involved in nutritional quality and that contribute, with ascorbate, to the regulation of oxidative stress. The identification of carotenoids and phenolics from Cogshall mango made it possible to: (i) expand existing knowledge about this cultivar; and (ii) assess reference data in order to evaluate the influence of the abiotic parameters studied.Ripening induces a major oxidative stress, but it was shown that the regulation potential for oxidative stress linked to environmental conditions was, in part, driven by harvest stage. At harvest for the green-mature stage, the water deficit applied resulted in an increase in oxidative stress, with higher H2O2 and ascorbate contents for the earliest fruits, accompanied by a pronounced increase in phenolic content. However, after ripening, the stress linked to the respiration crisis eliminates the trends observed at harvest, regardless of the stage. The carotenoid pathway was modulated by water deficit with a marked accumulation of abscisic acid. Cold storage for 14 days encourages oxidative stress. After ripening at 20 °C, both harvest stage and storage temperature will modulate mango metabolism. Early fruits stored at low temperatures had low carotenoid contents and low ROS scavenging capacities, whereas later fruits had a more active defense system and a better accumulation of carotenoids. Finally, correlations between classic quality descriptors and fruit composition provided strong relationships between sugar contents and dry soluble extract and between major carotenoid contents and hue angle. However, discrepancies were observed between total carotenoids and hue angle and between titratable acidity and organic acid contents when fruits were kept in cold storage.

TP53INP1 est un gène cible de p53 qui code une protéine à activité suppressive de tumeur. En son absence, on observe la dérégulation de nombreux phénomènes cellulaires impliqués dans le processus tumoral, comme la mort cellulaire, la prolifération, la migration ou encore l’instabilité génétique. Certains d’entre eux sont modulés par le stress oxydatif chronique qui existe dans les cellules et organes déficients pour TP53INP1. Cette thèse a pour objectif de mieux caractériser le mécanisme d’action de TP53INP1, afin de mieux comprendre son rôle suppresseur de tumeur en lien avec la régulation du métabolisme oxydatif. Nous avons montré dans un premier temps que TP53INP1 est impliquée dans l’autophagie, où elle interagit avec les protéines de la famille LC3/Atg8 au sein des autophagosomes, et favorise la mort cellulaire de manière dépendante de l’autophagie. Puis nous avons déterminé que c’est un défaut du processus mitophagique qui est à l’origine du stress oxydatif chronique constaté en absence de TP53INP1. Ce niveau de ROS élevé induit une dérégulation du métabolisme des lipides, observée in vitro dans les cellules déficientes pour TP53INP1 (accumulation de gouttelettes lipidiques), et retrouvée in vivo dans les souris TP53INP1 KO (prédisposition à l’obésité et au phénomène de résistance à l’insuline). C’est une levée du blocage de l’expression du gène Pparg régulant la lipo- et l’adipo-genèse et une inhibition du processus de lipolyse qui expliquerait notre phénotype. Ces travaux ont donc permis de mieux caractériser le rôle suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son mécanisme de régulation. / TP53INP1 is a p53 target gene coding a protein with a tumor suppressor activity. In absence of TP53INP1, we observe deregulation of different cellular phenomena implicated in tumoral progression, such as cell death, proliferation, migration or even genetic instability. Some of them are modulated by chronic oxidative stress existing in TP53INP1-deficient cells or organs. The aim of this work is to better characterize the molecular mechanism of action of TP53INP1 in order to better understand its tumor suppressor role related to regulation of oxidative metabolism. Firstly, we demonstrated that TP53INP1 is involved in autophagy, through its direct interaction with LC3/Atg8 family proteins within autophagosomes, and induces autophagy-dependent cell death. Then we evidenced that a defect in mitophagic process is at the origin of chronic oxidative stress noticed in absence of TP53INP1. This elevated ROS level induces lipid metabolism deregulation, observed in vitro in TP53INP1-deficient cells (lipid droplets accumulation), and mirrored in vivo in TP53INP1 KO mice (predisposition to obesity and to insulin resistance phenomenon). A derepression of Pparg gene expression, which regulates lipo- and adipo-genesis, and inhibition of lipolysis process would explain our phenotype. Altogether these findings allow a better understanding of the tumor suppressive function and regulation mechanisms of TP53INP1.

En raison des activités anthropiques croissantes, de larges sites sont contaminés par les métaux lourds qui affectent les systèmes biologiques. La souche Oidiodendron maius Zn pourrait être un organisme intéressant dans un programme de bioremédiation étant à la fois un champignon mycorhizien éricoïde et une souche tolérante aux métaux lourds. Pour comprendre les mécanismes de la tolérance de cette souche, trois approches différentes ont été menées.La première approche a abouti à la génération de mutants du gène superoxyde dismutase 1 (OmSOD1). Il s'agit de la première délétion d'un gène par recombinaison homologue chez un champignon mycorhizien. Nous démontrons que l'absence d'OmSOD1 cause un déséquilibre dans l'homéostasie rédox et un changement dans le dialogue entre le champignon et sa plante hôte.La deuxième approche a été basée sur la complémentation fonctionnelle d'un mutant de levure en utilisant une banque d'ADNc d'O. maius. Nous décrivons les premiers transporteurs d'un champignon mycorhizien éricoïde capables de conférer la tolérance au Zn dans des levures. Deux gènes ont été isolés et nommés OmCDF et OmFET. L'expression hétérologue de ces deux gènes dans différents mutants de levure a permis de conférer la tolérance au Zn. De plus, OmCDF a également permis de conférer la tolérance au Co. Nos données suggérent que OmCDF est un transporteur de Zn responsable du transfert du Zn cytoplasmique vers le réticulum endoplasmique, tandis que l'expression d'OmFET pourrait neutraliser la toxicité engendrée par le Zn en augmentant le contenu du Fe dans la cellule. La troisième approche a concerné le criblage d'une collection de mutants aléatoires d'O. maius sur Zn, Cd et ménadione. Nous décrivons la caractérisation d'un mutant dans le gène nmr. Dans ce mutant, une diminution de la teneur en glutamine et asparagine, ainsi qu'une réduction de l'activité de la glutamine synthétase ont été enregistrées. Les liens possibles entre la tolérance au stress oxydatif et le métabolisme azoté sont discutés. / Due to increasing anthropogenic activities, large areas are highly contaminated by heavy metals which are affecting biological systems. Oidiodendron maius strain Zn could be an interesting organism in a bioremediation program being both an ericoid mycorrhizal fungus and a heavy metal-tolerant strain. To understand the mechanisms underlying the oxidative stress tolerance of this strain, three different approaches were used. The first approach allowed us to obtain superoxide dismutase 1 (SOD1) null mutants. The most important technical advance in this work was the first successful disruption of a gene by homologous recombination in a mycorrhizal fungus. We demonstrate that the lack of OmSOD may cause an imbalance in the redox homeostasis and an alteration in the delicate dialogue between the fungus and its host plant. The second approach was based on a yeast functional complementation screening using an O. maius cDNA library. In this work we report the first transporters of an ericoid mycorrhizal fungus capable of conferring Zn tolerance to yeast transformants. Two full-length cDNAs were isolated and named OmCDF and OmFET. The heterologous expression of these two genes in various yeast mutants conferred resistance to zinc. Additionally, OmCDF expression also conferred Co tolerance. We provide evidence that OmCDF functions as a Zn transporter responsible for relocating cytoplasmic Zn into the endoplasmic reticulum, whereas expression of OmFET could counteract Zn toxicity by increasing Fe content of cells. The third approach consisted in the screening of a collection of O. maius random-mutants on Zn, Cd and menadione. We report the characterization of an O. maius-mutant that carries a mutation in the nmr gene. In this mutant, a decrease of glutamine and asparagine pools, and a reduction of the activity of glutamine synthase were recorded. Possible links between the oxidative stress tolerance and the nitrogen metabolism are discussed.

La pathologie de l'obésité est définie comme un excès de masse grasse corporelle pouvant nuire à la santé. Elle constitue un véritable problème de santé publique dans de nombreux pays et à La Réunion. Dans l'organisme, c'est au niveau du tissu adipeux que le stockage de gras se localise, plus précisément dans les cellules adipeuses (adipocytes) provenant elles-mêmes de la maturation de cellules précurseurs appelées préadipocytes. Chez le sujet obèse, le tissu adipeux stockant un excès de gras est le siège d'un stress oxydatif et d'une inflammation chronique qui concourent à la résistance à l'insuline et au développement du diabète et de ses complications vasculaires. De nombreuses études montrent les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires des produits végétaux riches en polyphénols et soulignent leur intérêt dans le cadre de stratégies innovantes vis-à-vis de l'obésité et de ses complications. La Réunion présente une multitude de ressources végétales comme les fruits tropicaux et de nombreuses plantes à parfums, aromatiques et médicinales qui exerceraient des effets bénéfiques pour la santé. Toutefois, il manque encore des données scientifiques pour les valider. L'objectif du travail de thèse était d'évaluer l'impact d'extraits riches en polyphénols antioxydants issus du curcuma et de fruits tropicaux de La Réunion sur la réponse métabolique et inflammatoire de la cellule adipeuse, en situation de stress oxydatif dans le contexte de la pathologie de l'obésité. Pour ce faire, le curcuma et neuf fruits tropicaux de La Réunion, à savoir l'ananas Victoria, la banane (grosse et petite variétés), le fruit de la passion, le letchi, la mangue (Américaine et José) et la papaye (Solo et Colombo) ont été sélectionnés. Nos résultats ont mis en évidence une variabilité du profil glucidique et des teneurs en micronutriments de type vitamine C, caroténoïdes et polyphénols. Pour la plupart des extraits végétaux étudiés, les polyphénols représentaient les antioxydants les plus abondants et leur présence a conféré aux extraits végétaux diverses propriétés biologiques. Celles-ci ont été explorées sur le modèle in vitro de cellules adipeuses 3T3-L1 exposées aux extraits végétaux riches en polyphénols, en situation de stress oxydatif induit par l'agent H2O2 ou des acides gras de type acides linoléique et arachidonique. Nos résultats ont mis en évidence les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires des extraits végétaux, ainsi que leur capacité à améliorer la réponse à l'insuline des cellules en terme d'accumulation de gras. De plus, tous les extraits végétaux ont exercé un effet protecteur contre la sur-production de molécules pro-inflammatoires induites en situation de stress oxydatif. Plusieurs cibles moléculaires ont été identifiées, dont les enzymes antioxydantes superoxyde dismutase et catalase, les facteurs de transcription PPAR-γ et NF-κB, ainsi que les adipokines de type adiponectine, IL-6, TNF-α et MCP-1. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence le potentiel bioactif d'extraits riches en polyphénols issus du curcuma et des fruits tropicaux sur la réponse métabolique et inflammatoire de la cellule adipeuse, en situation de stress oxydatif dans le contexte de la pathologie de l'obésité. L'utilisation des modèles expérimentaux développés au cours de ce travail de thèse permettra de poursuivre l'exploration des voies moléculaires impliquées et d'identifier de possibles cibles thérapeutiques. / Obesity is defined as an excessive fat accumulation and has been related to several major complications such as type 2 diabetes and vascular disorders. In obese patients, adipose cells responsible for fat storage are the targets of oxidative stress and chronic inflammation which contribute to insulin resistance and the onset of diabetes. Here, our objective was to evaluate the impact of polyphenol-rich extracts from Curcuma longa spice and tropical fruits from Reunion Island in France on the metabolic and inflammatory response of adipose cells exposed to oxidative stress mediated by H2O2 or free fatty acids comprising both linoleic and arachidonic acids. Our data led to demonstrate the abundance of polyphenols from Curcuma longa spice and the tropical fruits selected, and their free radical-scavenging capacities. Polyphenol-rich plant extracts were also able to protect 3T3-L1 preadipocytes and adipocytes against oxidative stress, by regulating the production of reactive oxygen species and major adipocytokines, antioxidant enzymes and transcriptional factors involved in the metabolic and inflammatory response of the adipose tissue. Further work needs to be developed on animal models and then in obese subjects to identify and validate new therapeutic targets.