Die Expression homöostatischer Chemokinrezeptoren auf hämatopoetischen Neoplasien wird zunehmend mit tumorpathogenen Funktionen in Zusammenhang gebracht. In der Arbeit wurden Funktionen der Rezeptoren CXCR7 und CCR7 in der Pathogenese lymphatischer Erkrankungen anhand von Mausmodellen charakterisiert. Für CXCR7 konnte in der normalen Differenzierung von T-Zellen eine schwache Expression in murinen Thymozyten, dagegen eine verstärkte, vor allem intrazellulär lokalisierte Expression in peripheren aktivierten T-Zellen identifiziert werden. Eine aberrante Überexpression lag in humanen Zelllinien, aber auch in primären Fällen von T-ALL und klassischen Hodgkin-Lymphomen vor. Die Analyse eines retroviralen Überexpressionsmodells ergab für CXCR7 die Funktion als anti-apoptotischer Kostimulator während der thymischen beta-Selektion. Im Signaltransduktionskomplex mit CXCR4 und dem präTCR vermittelte CXCR7 einen effizienteren DN3-zu-DN4 Übergang. Unreife Thymozyten waren durch eine verstärkte Apoptoseresistenz und Expression von anti-apoptotischen Bcl2-Molekülen charakterisiert. Dies könnte CXCR7 überexprimierende Thymozyten putativ empfänglicher für die Entwicklung von T-ALLs machen. Für CCR7 konnten in der Arbeit bedeutende Funktionen in der organspezifischen Dissemination von B-Zelllymphomen identifiziert werden. Unter Verwendung des Eµ-Myc-Mausmodells wurde gezeigt, dass Eµ-Myc Lymphomzellen CCR7-abhängig in die T-Zellzone von Milz und Lymphknoten einwandern und dort durch reziproke Interaktionen mit gp38+ FRCs und DCs entscheidende Überlebenfaktoren, darunter Ihh, Igf-1 und VCAM-1, erhalten. Die Lymphomzellen vermittelten darüber hinaus eine aktive Veränderung der Stromazellzusammensetzung, welche durch ein expandiertes FRC-Netzwerk, durch die Induktion putativ immunsupprimierender DCs und durch ein inflammatorisches Milieu charakterisiert war. Eine Inhibition der Lymphom-Stroma-Interaktionen könnte daher eine neue Strategie der Lymphomtherapie darstellen. / In recent years the expression of homeostatic chemokine receptors on hematological tumors was increasingly associated with tumor pathogenic functions. Within this thesis, functions of the chemokine receptors CXCR7 und CCR7 in the pathogenesis of lymphoid diseases were characterized using different mouse models. For CXCR7, low expression levels were detected in murine thymocytes during normal T cell development. Enhanced expression was found mainly intracellularly in peripheral activated T cells. An aberrant overexpression was identified in human cell lines and primary cases of T-ALL and classical Hodgkin lymphoma. The analysis of a retroviral overexpression model suggested a function of CXCR7 as an anti-apoptotic costimulator during thymic beta-selection. In a functional complex with CXCR4 and the preTCR CXCR7 mediated a more efficient DN3-to-DN4 transition. CXCR7 expressing thymocytes were characterized by enhanced apoptosis resistance and expression of anti-apoptotic Bcl2-family genes. Thus, CXCR7 could putatively make immature thymocytes more susceptible to develop T-ALL. In addition, new insights into the function of CCR7 in the context B cell lymphoma dissemination were gained within this thesis. Applying the Eµ-Myc mouse model, CCR7 was shown to mediate the specific homing of Eµ-Myc lymphoma cells into the T cell zone of spleen and lymph nodes. Here, lymphoma cells received pivotal survival signals following reciprocal interactions with gp38+ FRCs and DCs, amongst them Ihh, Igf-1 and VCAM-1. Moreover, the lymphoma cells induced a survival promoting active remodelling of the T cell zone stroma, which was characterized by the expansion of the FRC network, by the induction of putatively immune suppressive DCs and by the induction of a pro-inflammatory milieu. Therefore, an inhibition of lymphoma-stroma interactions could provide a new strategy in lymphoma therapy.

Diversos estudos têm demonstrado que a atividade coordenada das células epiteliais com o estroma é fundamental no crescimento e diferenciação em situações fisiológicas e patológicas, inclusive no câncer. Vários relatos acentuam a importância do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente que interações contínuas entre o carcinoma e as células estromais (resultando em regulamento e modulação recíproca) são condições prévias para desenvolvimento e progressão de carcinomas. Comparativamente, pouca informação está disponível sobre as características e o papel do estroma durante o processo carcinogênico e a maioria dos dados são baseados em estudos isolados. Nos animais tratados com o carcinógeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colônica o aparececimento de “Focos de Estroma Ativado" (FEA) que diferem do foco inflamatório esporádico encontrado na mucosa normal dos animais controles devido à imuno-expressão aumentada de células CD34, CD68, α-actina de músculo liso (ASMA), COX-2 positivas e densidade microvascular. Além disso, o FEA cercou um número aumentado de criptas colônicas em fissão que freqüentemente apresentavam células epiteliais com núcleos hipercromáticos. Este último achado pode sugerir correlação entre as alterações estromais e epiteliais dentro dos FEA. Embora esses achados sejam novos, são consistentes com observações prévias que o estroma tem um papel significante na carcinogênese. Juntamente com dados da literatura, este trabalho sugere que, no cólon, a “field cancerization" epitelial pode ser acompanhada através de alterações estromais e isto pode apontar novos marcadores de transformação neoplásica. / There has been considerable that the activity of epithelial cells with their stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and pathological situations, including cancer. A number of reports stress the importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma development and progression. Comparatively, less information is available about the features and role of the stroma for the carcinogenic process. In animals treated with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal “Activated Stromal Foci" (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased immune-expression of CD34, CD68, α-smooth muscle actin (ASMA), COX-2 positive cells and microvessel density. Furthermore, the ASF surrounded a increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal stroma. This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes may be correlated. These findings are novel but expected and consistent with previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis. Taken together with literature data, our findings suggest that in the colon, the epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this may point to the finding of new markers of neoplastic transformation.

In dieser Arbeit wurden Genexpressionsprofile diffuser und intestinaler Magenadenokarzinome mittels Microarray-Technik erstellt. Der intestinale Typ konnte als stark proliferierender Tumor mit signifikanter Überexpression von zellzyklusrelevanten Genen definiert werden, während der diffuse Typ als stark stromaabhängig mit signifikanter Überexpression von Genen der extrazellulären Matrix hervortrat. Thrombospondin 4 (THBS4) wurde dabei als das am stärksten differentiell exprimierte Gen identifiziert, wobei seine mRNA in diffusen Tumoren eminent überexprimiert wird. Immunhistochemische Studien bestätigten diese starke Überexpression auf Proteinebene und zeigten, dass THBS4 eine übermäßig angereicherte extrazelluläre Komponente des Tumorstromas ist. Kolokalisierungsstudien zeigten zudem, dass THBS4-positive Zellen auch positiv für Vimentin und Smooth muscle actin (alpha) sind. Diese Ergebnisse belegen, dass THBS4 von Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAF) exprimiert wird. Dies konnte durch zusätzliche in vitro Experimente bestätigt werden, die aufzeigten, dass TAF von diffusen Tumoren eine stärkere THBS4-mRNA Expression aufweisen als normale Fibroblasten des Magens. Abschließend konnten in vitro Kokultur-Studien aufdecken, dass die THBS4-Expression in Fibroblasten durch Tumorzellen diffuser Magentumore transkriptionell stimuliert wird. Metastasenbefall regionaler Lymphknoten (N+) ist bei den meisten Magenadenokarzinomdiagnosen bereits vorhanden. Dieser ist der stärkste derzeit verfügbare Parameter zur Abschätzung der Prognose, reicht aber für eine eindeutige Vorhersage nicht aus. Um ergänzende molekulare Prognoseindikatoren zu identifizieren, wurden aus den Microarray-Daten Gene, deren Expression mit dem klinischen Verlauf von N+ Patienten korreliert, extrahiert. Einige dieser Gene, z.B. RAN binding protein 17 und ras-related associated with diabetes, konnten mittels quantitativer real-time PCR als Marker für verkürztes progressionsfreies Überleben validiert werden. / In this work, gene expression profiles of diffuse and intestinal-type gastric adenocarcinomas were established using the microarray technique. The intestinal type was identified to be a highly proliferative entity with significant overexpression of cell cycle-relevant genes, whereas the diffuse type was proven to be strongly stroma-dependent with significant overexpression of extracellular matrix genes. Thrombospondin 4 (THBS4) was identified as the gene most differentially expressed between the two types with vast mRNA overexpression in diffuse-type tumors. Immunohistochemical studies proved overexpression on protein level and elucidated that THBS4 is a heavily accumulated extracellular constituent of the tumor stroma. Colocalization studies uncovered that THBS4-positive cells are also positive for vimentin and alpha-smooth muscle actin. These data signify that THBS4 is expressed by subpopulations of cancer-associated fibroblasts (CAFs). This was further evidenced by in vitro experiments demonstrating that THBS4 mRNA expression is increased in CAFs of diffuse-type tumors compared to normal gastric fibroblasts. Finally, in vitro coculture studies revealed that transcriptional THBS4 expression in fibroblasts is stimulated by diffuse-type gastric tumor cells. Metastatic involvement of regional lymph nodes (N+) usually accompanies diagnosis of gastric adenocarcinoma and is currently considered the most important parameter for assessment of prognosis. However, estimation of prognosis based on this parameter alone is not sufficiently reliable. In order to identify additional molecular prognosis markers, genes whose expression correlates with clinical outcome of N+ patients were extracted from the microarray data. Via quantitative real-time PCR, several genes, e.g. RAN binding protein 17 and ras-related associated with diabetes, were successfully validated to allow an expression-based stratification of patients with respect to disease-free survival.

Das Zytokin Interleukin-7 (IL-7) ist für die Entstehung und das Überleben reifer T Zellen von zentraler Bedeutung. Die Gabe von IL-7 führt sowohl in der Maus als auch im Menschen zu erhöhten T Zellzahlen und einem veränderten T Zellphänotyp. Folglich könnte sich die therapeutische Gabe von IL-7 bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem positiv auswirken. Diese Hypothese wird derzeit in mehreren klinischen Studien untersucht. Bisher wurde allerdings nur die Wirkung von IL-7 auf T-Zellen studiert. Zu dessen Wirkung auf andere Immun- oder Stromazellen sowie deren IL-7-abhängigen Beitrag zur Regulation der T-Zellhomöostase ist nur wenig bekannt. Daher war es Ziel der Arbeit, den Einfluss einer therapeutischen Gabe von IL-7 auf adoptiv-transferierte T-Zellen in IL-7-Rezeptor (IL-7R)-kompetenten und defizienten lymphopenischen Mäusen zu studieren. Die Untersuchungen bestätigen, dass die Gabe von IL-7 T-Zellantworten unterstützt, zeigen jedoch auch, daß viele dieser Effekte von IL-7R-exprimierenden Wirtszellen abhängig sind. Dies weist darauf hin, dass IL-7R-vermittelte Signale in Wirtszellen indirekt T-Zellantworten beeinflussen. Zudem zeigte sich, dass effiziente anti-Tumor-T Zellantworten von IL 7R-vermittelten Signalen in Wirtszellen abhängen. Vor allem nicht-hämatopoetische Wirtszellen fungieren hier als Regulatoren der IL-7-Therapie-vermittelten T Zelldifferenzierung. Unsere Ergebnisse bestätigen außerdem, dass Stromazellen in verschiedenen Organen il-7 exprimieren und zeigen darüber hinaus, dass diese Zellen durch die Gabe von IL-7 beeinflusst werden. Wir folgern daraus, dass die Effekte der IL-7-Therapie auf T Zellhomöostase teilweise indirekt über il-7-exprimierende Stromazellen vermittelt werden. Um diese Zellen genauer identifizieren und untersuchen zu können, haben wir ein neues transgenes Mausmodell charakterisiert, was es erleichtern wird, die beteiligten molekularen Signalwege zu analysieren und den Erfolg der adoptiven T Zelltherapie zu verbessern. / Interleukin-7 (IL-7) is an essential cytokine required for the development and maintenance of mature T cell. Its availability is limited under normal conditions, but rises during lymphopenia, leading to increased T cell proliferation. The administration of recombinant IL-7 to normal or lymphopenic mice and humans results in increased T cell numbers and altered T cell phenotype. Hence, IL-7 administration could mediate therapeutic benefits in immunocompromised patients and is currently tested in several clinical trials. However, besides its well-studied effects on T cells little is known about the effect of IL-7 on other immune and non-immune cells and their influence on T cell homeostasis. Therefore, we evaluated the effect of IL-7 therapy on adoptively transferred T cells in IL-7 receptor (IL-7R)-competent and IL-7R-deficient lymphopenic mice. We confirm the benefits of IL-7 therapy on T cell responses but additionally show that many of these effects are dependent on IL-7R expression by host cells, indicating that IL-7R signaling in host cells modulates T cell responses. We show that efficient T cell responses against cancer are dependent on host IL-7R signaling. Based on studies in bone-marrow chimeric mice, we identify non-hematopoietic host cells as main regulators of IL-7 therapy-modulated T cell differentiation. We conclude from these data that IL-7 therapy affects non-hematopoietic stromal cells that modulate the success of adoptive T cell therapy. Our results confirm that stromal cells in various organs express il-7 and show that these cells are targeted by IL-7 therapy in vivo. Hence, we propose that il-7-expressing cells regulate IL-7 therapy-modulated T cell homeostasis. To identify and study these il-7 expressing stromal cells in more detail, we characterized a new transgenic mouse model that will facilitate determining the molecular pathways to improve the success of adoptive T cell therapy.

Diversos estudos têm demonstrado que a atividade coordenada das células epiteliais com o estroma é fundamental no crescimento e diferenciação em situações fisiológicas e patológicas, inclusive no câncer. Vários relatos acentuam a importância do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente que interações contínuas entre o carcinoma e as células estromais (resultando em regulamento e modulação recíproca) são condições prévias para desenvolvimento e progressão de carcinomas. Comparativamente, pouca informação está disponível sobre as características e o papel do estroma durante o processo carcinogênico e a maioria dos dados são baseados em estudos isolados. Nos animais tratados com o carcinógeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colônica o aparececimento de “Focos de Estroma Ativado” (FEA) que diferem do foco inflamatório esporádico encontrado na mucosa normal dos animais controles devido à imuno-expressão aumentada de células CD34, CD68, α-actina de músculo liso (ASMA), COX-2 positivas e densidade microvascular. Além disso, o FEA cercou um número aumentado de criptas colônicas em fissão que freqüentemente apresentavam células epiteliais com núcleos hipercromáticos. Este último achado pode sugerir correlação entre as alterações estromais e epiteliais dentro dos FEA. Embora esses achados sejam novos, são consistentes com observações prévias que o estroma tem um papel significante na carcinogênese. Juntamente com dados da literatura, este trabalho sugere que, no cólon, a “field cancerization” epitelial pode ser acompanhada através de alterações estromais e isto pode apontar novos marcadores de transformação neoplásica. / There has been considerable that the activity of epithelial cells with their stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and pathological situations, including cancer. A number of reports stress the importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma development and progression. Comparatively, less information is available about the features and role of the stroma for the carcinogenic process. In animals treated with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal “Activated Stromal Foci” (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased immune-expression of CD34, CD68, α-smooth muscle actin (ASMA), COX-2 positive cells and microvessel density. Furthermore, the ASF surrounded a increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal stroma. This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes may be correlated. These findings are novel but expected and consistent with previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis. Taken together with literature data, our findings suggest that in the colon, the epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this may point to the finding of new markers of neoplastic transformation.

No description available.

No description available.

Visualiser et analyser automatiquement des coupes fines de tumeurs cancéreuses sont des enjeux majeurs pour progresser dans la compréhension des mécanismes de la cancérisation et mettre en évidence de nouveaux indicateurs de réponse au traitement. Les nouveaux scanners microscopiques apportent une aide essentielle en fournissant des images couleur haute résolution de la totalité des lames histologiques. Ceci permet de s'affranchir de l'hétérogénéité de distribution des marqueurs à quantifier. La taille de ces images, appelées lames virtuelles, peut atteindre plusieurs GigaOctets. L'objectif de cette thèse est de concevoir et d'implémenter une méthode de segmentation permettant de séparer les différents types de compartiments stromaux présents sur une lame virtuelle de carcinome ovarien. Les deux principales difficultés à surmonter sont la taille des images, qui empêche de les traiter en une seule fois, et le choix de critères permettant de différencier les compartiments stromaux. Pour répondre à ces problèmes, nous avons développé une méthode générique de segmentation multiéchelle qui associe un découpage judicieux de l'image à une caractérisation de chaque compartiment stromal, considéré comme une texture. Cette caractérisation repose sur une modélisation multiéchelle des textures par un modèle d'arbre de Markov caché, appliqué sur les coefficients de la décomposition en ondelettes. Plutôt que de considérer tous les types de compartiments stromaux simultanément, nous avons choisi de transformer le problème multiclasse en un ensemble de problèmes binaires. Nous avons également analysé l'influence d'hyperparamètres (représentation couleur, type d'ondelettes et nombre de niveaux de résolutions intégrés à l'analyse) sur la segmentation, ce qui nous a permis de sélectionner les classifieurs les mieux adaptés. Différentes méthodes de combinaison des décisions des meilleurs classifieurs ont ensuite été étudiées. La méthode a été testée sur une vingtaine de lames virtuelles. Afin d'évaluer les résultats de la segmentation, nous avons mis en œuvre un protocole de tests fondé sur une approche stéréologique. Les résultats sur différents jeux de tests (images synthétiques, images de petite taille, images réelles) sont présentés et commentés. Les résultats obtenus sur les lames virtuelles sont prometteurs, compte tenu de la variabilité des échantillons et de la difficulté, pour un expert, à identifier parfois très précisément un compartiment : environ 60% des points sont correctement classés (entre 35% et 80% selon les lames).

Thesis (M.S.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2005. / Typescript (photocopy).

Die Leber ist das am häufigsten von Metastasen betroffene Organ und kann daher als Modellorgan für metastatische Invasion dienen. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Dissertation Genexpressionsprofile zu verstehen und metastasierungs- sowie invasionsassoziierte Gene zu identifizieren. Differentielle Genexpression wurde in drei Systemen überprüft: Einem syngenen Mausmodell, einem Xenograftmodell sowie in fünf Gewebeproben von Patienten. Genexpressionprofile des syngenen Mausmodells und der Patientenproben zeigten, dass man die Invasionsfront als Ganzes betrachten, um möglichst viele über-lappende Gene zu finden. Globale Genexpressionstudien, die auf den Wirtsteil der Invasionsfront zeigten bemerkenswerte Überrepräsentation z. B. der „GO-terms“ „extrazelluläre Matrix“, Zellkommunikation“, „Antwort auf biotischen Stimulus“, Strukturmolekülaktivität“ und „Zellwachstum“. Marker der Aktivierung hepatischer Sternzellen überrepräsentiert in der invasionsfront, was die Durchführbarkeit einer Analyse differentieller Genexpression im genomweiten Rahmen anzeigt. Globale Genexpressionsstudien, auf den Tumorzellen in der in vitro Situation, in vivo und in der Invasionsfront zeigten insgesamt einen Anstieg zellulärer Spezialisierung von der in vitro zur Invasionsfront. Sezernierte proangiogenetische Chemokine zeigten eine Hochregulation in der Invasionsfront. Das beta catenin Gen war in der Invasionsfront 9.6 fach erhöht im Vergleich zur in vitro Situation. Die Überprüfung der transkriptionellen Aktivierung von beta catenin über die Prüfung der Promotoraktivität zeigte einen 18.4 fachen Anstieg in den Tumorzellen der Invasionsfront. Weiterhin war die Promotoraktivität (an Hand der Aktivität der mRNA des Alkalischen Phosphatase Reportergens) im Tumorinneren 3.5 fach höher als in der Zellkultur, was für einen transkriptionellen Mechanismus der beta catenin Regulation zusätzlich zu den posttranslationalen Mechanismen spricht. / Liver is most frequently populated by metastases and may therefore serve as a model organ for metastatic invasion. So the aim of this thesis is to understand the gene expression profiles and identify metastasis and invasion related genes. Differential gene expression was examined in three systems: A syngeneic mouse model, a xenograft model and five clinical specimens. Gene expression profiles of a syngenic mouse model and human clinical specimen revealed that the invasion front should be considered as a whole to find more overlapping potential target genes. Global gene expression studies on the host part of the invasion front, revealed a pronounced overrepresentation of GO-terms (e.g. “extracellular matrix”, “cell communication”, “response to biotic stimulus”, “structural molecule activity” and “cell growth”). Hepatic stellate cell activation markers were over-represented in the invasion front demonstrating the feasibility of a differential gene expression approach on a genome wide scale. Global gene expression studies of the tumor cells in vitro, in vivo and tumor part of the invasion front revealed an overall increase of cellular specialization from in vitro to the invasion front. Secreted angiogenic cytokines were found to be up regulated in the invasion front. Beta catenin gene of “cell adhesion” GO term was elevated 9.6 fold in invasion front compared to in vitro. Evaluation of transcriptional up-regulation of beta catenin by promoter activity showed an 18.4 fold increase in the tumor cells of the invasion front as compared to those from the faraway tumor. Promoter activity assessed by soluble human placental alkaline phosphatase reporter gene mRNA was 3.5 fold higher in the inner parts of the tumor than in vitro cells indicating a transcriptional mechanism of beta catenin regulation in addition to the posttranslational regulatory mechanisms.