Synapse is the fundamental unit of synaptic transmission. Learning, memory and neurodegenerative diseases of the brain are attributed to the maintenance and alteration in synaptic connections. The efficiency for synaptic transmission depends on how well the post synapse receives the signals from the presynapse; this in turn depends on the receptors present in the post synaptic density (PSD). PSD is present in the post synapse right opposite to the neurotransmitter release site in presynapse (active zone) is an indispensable part of the synapse. The PSD is comprised of receptors and scaffold proteins, which is ultimately supported by the actin cytoskeleton of the dendritic spines. Cytoskeletal dynamics is shown to influence the structural plasticity of spine and also PSD, but how it regulates the dynamicity of the synaptic transmission is not completely understood. Here we studied the influence of actin depolymerisation on sub synaptic organization of an excitatory synapse. In order to study the organization of the synapse at molecular resolution, the conventional microscopy cannot be employed due to the limit of diffraction. Super resolution microscopy circumvents this diffraction limitation. In this study we have used custom built fluorescence microscope with Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) modality to observe the nanometre sized structures inside spines of mouse hippocampal primary neurons. The setup was integrated with Metamorph imaging software for both operating the microscope and imaging acquisition purpose with a separate appropriate laser system. This setup was successful in achieving the lateral resolution of ~30nm and axial resolution of ~51nm. Over all we were able to observe the loss of spines and significant reduction in area of nanometer sized protein clusters in postsynaptic density with in the spines of latrunculin A treated mouse hippocampal primary neurons compared to the native neurons. Along with the morphological alterations in neurons we also observed the changes in nanoscale organization of few key molecules in the postsynaptic density.

Le cerveau est formé d’un réseau complexe de neurones responsables de nos fonctions cognitives et de nos comportements. Les neurones reçoivent via des contacts spécialisés nommés « synapses », des signaux d’autres neurones.[...] Le mécanisme par lequel les neurones reçoivent, intègrent et transmettent ces informations est très complexe et n'est toujours pas parfaitement compris. Dans les synapses excitatrices, les récepteurs AMPA (AMPARs) sont responsables de la transmission synaptique rapide. Les récents développements en microscopie de super résolution ont permis à la communauté scientifique de changer la vision de la transmission synaptique. Une première avancée fait suite à l’observation que les AMPARs ne sont pas distribués de façon homogène dans les synapses, mais sont organisés en nanodomaines de ~ 80 nm de diamètre contenant ~ 20 récepteurs. Ce contenu est un facteur important pour déterminer l'amplitude de la réponse synaptique. En raison de la basse affinité des AMPARs pour le glutamate, un AMPAR ne peut être activé que lorsqu'il est situé dans une zone de ~ 150 nm en face du site de libération des neurotransmetteurs. Récemment, il a été montré que les nanodomaines d’AMPARs sont situés en face de ces sites de libération, formant des nano-colonnes trans-synaptiques à l'état basal. Cette organisation précise à l’échelle nanométrique semble être un facteur clé dans l'efficacité de la transmission synaptique. Une autre avancée a été l'observation que les AMPARs diffusent à la surface des neurones et sont immobilisés à la synapse pour participer à la transmission synaptique. L'échange dynamique entre le pool diffusif d’AMPARs et les récepteurs immobilisés dans les nanodomaines participe au maintien de l’efficacité de la réponse synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle des paramètres indiqués ci-dessus sur les propriétés de la transmission synaptique, à l'état basal et au cours de phénomènes dits de plasticité synaptique. Tout d'abord, nous avons identifié le rôle crucial de la Neuroligine dans l'alignement des nanodomaines d’AMPARs avec les sites de libération du glutamate. En plus de cela, nous avons mis en évidence l’impact de cet alignement sur l’efficacité de la transmission synaptique en perturbant celui-ci. En parallèle, nous avons démontré que les AMPARs désensibilisés sont plus mobiles à la membrane plasmatique que les récepteurs ouverts ou fermés, et ce, en raison d'une diminution de leur affinité pour les sites d’immobilisation synaptiques. Nous avons montré que ce mécanisme permettait aux synapses de récupérer plus rapidement de la désensibilisation et d'assurer la fidélité de la transmission synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. Enfin, les synapses peuvent moduler leurs intensités de réponse grâce à des mécanismes de plasticité synaptique à long terme, et plus particulièrement, la dépression à long terme (LTD) qui correspond à un affaiblissement durable de ce poids synaptique. [...] À la suite des découvertes précédentes concernant le rôle de la nano-organisation dynamique des AMPARs pour réguler le poids et la fiabilité de la transmission synaptique, j'ai décidé d'étudier leur rôle dans l'affaiblissement et la sélection des synapses. J'ai découvert que la quantité d’AMPAR par nanodomaine diminue rapidement et durablement. Cette première phase semble due à une augmentation de l’internalisation des AMPARs. Dans un deuxième temps, la mobilité des AMPARs augmente suite à une réorganisation moléculaire de la synapse. Ce changement de mobilité des AMPARs permet aux synapses déprimées de maintenir leur capacité à répondre aux signaux neuronaux à hautes fréquences. Ainsi, nous proposons que l'augmentation de la mobilité des AMPARs au cours de la LTD permet de transmettre une réponse fidèle dans les synapses stimulées à hautes fréquences et donc de sélectivement les maintenir tout en éliminant les synapses inactives. / The brain is a complex network of interconnected neurons responsible for all our cognitive functions and behaviors. Neurons receive inputs at specialized contact zones named synapses which convert an all or none electrical signal to a chemical one, through the release of neurotransmitters. This chemical signal is then turned back in a tunable electrical signal by receptors to neurotransmitters. However, a single neuron receives thousands of inputs coming from several neurons in a spatial- and temporal-dependent manner. The precise mechanism by which neurons receive, integrate and transmit this synaptic inputs is highly complex and is still not perfectly understood. At excitatory synapses, AMPA receptors (AMPARs) are responsible for the fast synaptic transmission. With the recent developments in super-resolution microscopy, the community has changed its vision of synaptic transmission. One breakthrough was the discovery that AMPARs are not randomly distributed at synapses but are organized in nanodomains of ~80 nm of diameter containing ~20 receptors. This content is an important factor since it will determine the intensity of the synaptic response. Due to their mM affinity for glutamate, AMPARs can only be activated when located in an area of ~150 nm in front of the neurotransmitter release site. Recently, AMPAR nanodomains have been shown to be located in front of glutamate release sites and to form trans-synaptic nanocolumns at basal state. Thus, the nanoscale organization of AMPARs regarding release sites seems to be a key parameter for the efficiency of synaptic transmission. Another breakthrough in the field was the observation that AMPARs diffuse at the cell surface and are immobilized at synapses to participate to synaptic transmission. The dynamic exchange between AMPAR diffusive pool and the receptors immobilized into the nanodomains participates to maintain the efficiency of synaptic response upon high-frequency stimulation.The overall aim of my PhD has been to determine the role of each above listed parameters on the intimate properties of synaptic transmission both at basal state and during synaptic plasticity. First, we identified the crucial role of Neuroligin in the alignment of AMPAR nanodomains with glutamate release sites. In addition, we managed to break this alignment to understand its impact on synaptic transmission properties. In parallel, we demonstrated that, due to a decrease in their affinity for synaptic traps, desensitized AMPARs diffuse more at the plasma membrane than opened or closed receptors. This mechanism allows synapses to recover faster from desensitization and ensure the fidelity of synaptic transmission upon high-frequency release of glutamate. Finally, synapses can modulate their strength through long-term synaptic plasticity, in particular, Long-Term Depression (LTD) corresponds to a long-lasting weakening of synaptic strength and is thought to be important in some cognitive processes and behavioral flexibility through synapse selective elimination. Following the previous discoveries about the impact of AMPAR dynamic nano-organization at synapses on the regulation of the synaptic transmission strength and reliability, I decided to investigate their role in the weakening of synapses. I found that AMPAR nanodomain content drops down rapidly and this depletion last several minutes to hours. The initial phase seems due to an increase of endocytosis events, but in a second phase, AMPAR mobility is increased following a reorganization of the post-synaptic density. This change in mobility allows depressed synapses to maintain their capacity to answer to high-frequency inputs. Thus, we propose that LTD-induced increase in AMPAR mobility allows to conduct a reliable response in synapses under high-frequency stimulation and thus to selectively maintain them while eliminating the inactive ones.

Approximate Nearest-Neighbour Field (ANNF\ maps between two related images are commonly used by computer vision and graphics community for image editing, completion, retargetting and denoising. In this work we generalize ANNF computation to unrelated image pairs. For accurate ANNF map computation we propose Feature Match, in which the low-dimensional features approximate image patches along with global colour adaptation. Unlike existing approaches, the proposed algorithm does not assume any relation between image pairs and thus generalises ANNF maps to any unrelated image pairs. This generalization enables ANNF approach to handle a wider range of vision applications more efficiently. The following is a brief description of the applications developed using the proposed Feature Match framework. The first application addresses the problem of detecting the optic disk from retinal images. The combination of ANNF maps and salient properties of optic disks leads to an efficient optic disk detector that does not require tedious training or parameter tuning. The proposed approach is evaluated on many publicly available datasets and an average detection accuracy of 99% is achieved with computation time of 0.2s per image. The second application aims to super-resolve a given synthetic image using a single source image as dictionary, avoiding the expensive training involved in conventional approaches. In the third application, we make use of ANNF maps to accurately propagate labels across video for segmenting video objects. The proposed approach outperforms the state-of-the-art on the widely used benchmark SegTrack dataset. In the fourth application, ANNF maps obtained between two consecutive frames of video are enhanced for estimating sub-pixel accurate optical flow, a critical step in many vision applications. Finally a summary of the framework for various possible applications like image encryption, scene segmentation etc. is provided.

Single-molecule localisation microscopy (SMLM) allows imaging of fluorescently-tagged proteins in live cells with a precision well below that of the diffraction limit. As a single-molecule technique, it has also introduced a new quantitative approach to fluorescence microscopy. In the Part A of this thesis, the design and building of three SMLM instruments, the implementation of a custom-developed image analysis package and the characterisation of the photo-physical properties of the photo-activable fluorescent protein used in this thesis (mEos), are discussed. Then, a new post-processing method for SMLM analysis is characterised: axial optical sectioning of SMLM images is demonstrated by thresholding fitted localisations using their fitted width and amplitude to reject fluorophores that emit from above or below a virtual ?light-sheet?, a thin volume centred on the focal plane of the microscope. This method provides qualitative and quantitative improvements to SMLM. In the Part B of this thesis, SMLM is applied to study T cell activation. Although the T cell receptor plays a key role in immunity, its stoichiometry in the membrane of resting T cells is still a matter of debate. Here, single-molecule counting methods are implemented to compare the stoichiometry of TCRs fused with mEos2 in resting T cells to monomeric and dimeric controls. However, because of the stochasticity of mEos2 photo-physics, results are inconclusive and new counting techniques based on structural imaging are discussed. In addition to TCR triggering, T cells require the co-stimulatory triggering of the CD28 transmembrane receptor to become fully activated. However, some immobilised anti-CD28 antibodies, referred to as super-agonists (SA), can directly activate T cells without triggering the TCR. In this thesis, single-molecule tracking techniques are used to investigate the molecular mechanism of CD28 super-agonism in live T cells. The results indicate that the diffusion of CD28 is slowed by SA binding. This effect is further discussed in light of the kinetic-segregation model proposed for TCR triggering. Quantitative SMLM as implemented and further developed in this work offers new tools to investigate the molecular mechanisms initiating T cell activation, ultimately facilitating the discovery of novel approaches to target these pathways for therapeutic purposes.

La thèse explore trois questions méthodologiques en imagerie de diffusion (DTI) clinique du cerveau, dans le contexte d’une étude sur le VIH. La première question est comment améliorer la résolution du DTI. Le deuxième problème est comment créer un atlas multimodal spécifique à la population. La troisième question porte sur le calcul des statistiques pour comparer les zones de matière blanche entre les contrôles et patients. Les DTI cliniques ont une résolution spatiale et un rapport signal sur bruit faibles, ce qui rend difficile le calcul de statistiques significatives. Nous proposons un algorithme de super-résolution pour améliorer la résolution qui utilise un a priori spatial anisotrope. Cette méthode démontre une amélioration de l’anisotropie fractionnelle et de la tractographie. Pour normaliser spatialement les images du cerveau dans un système de coordonnées commun, nous proposons ensuite de construire un atlas multimodal spécifique á la population. Ceci permet de créer un atlas probabiliste de la matière blanche qui est consistant avec l’atlas anatomique. Cet atlas peut être utilisé pour des statistiques basées sur des régions d’intérêt ou pour le raffinement d’une segmentation. Enfin, nous améliorons les résultats de la méthode TBSS (Tract-Based Spatial Statistics) en utilisant le recalage des images DTI. Contrairement á la méthode TBSS traditionnelle, nous utilisons ici des statistiques multivariées. Nous montrons que ceci permet de détecter des différences dans les régions de matière blanche qui étaient non significatives auparavant, et de les corréler avec les scores des tests neuropsychologiques. / The thesis explores three major methodological questions in clinical brain DTI, in the context of a clinical study on HIV. The first question is how to improve the DTI resolution. The second problem addressed in the thesis is how to create a multimodal population specific atlas. The third question is on the computation of statistics to compare white matter (WM) regions among controls and HIV patients. Clinical DTIs have low spatial resolution and signal-to-noise ratio making it difficult to compute meaningful statistics. We propose a super-resolution (SRR) algorithm for improving DTI resolution. The SRR is achieved using anisotropic regularization prior. This method demonstrates improved fractional anisotropy and tractography. In order to spatially normalize all images in a consistent coordinate system, we create a multimodal population specific brain atlas using the T1 and DTI images from a HIV dataset. We also transfer WM labels from an existing white matter parcellation map to create probabilistic WM atlas. This atlas can be used for region of interest based statistics and refining manual segmentation. On the statistical analysis side, we improve the existing tract based spatial statistics (TBSS) by using DTI based registration for spatial normalization. Contrary to traditional TBSS routines, we use multivariate statistics for detecting changes in WM tracts. With the improved method it is possible to detect differences in WM regions and correlate it with the neuropschylogical test scores of the subjects.

Les propriétés optiques de nanotubes de carbone sont décrites idéalement parla physique d’un objet unidimensionnel, donnant lieu notamment à l’apparition des excitons pour décrire les transitions optiques de ces objets. Les expériences d’optique(émission, absorption) réalisées sur ces objets à température ambiante et sur des ensemble d’objets ont permis de confirmer les prédictions théoriques basées sur la physique des objets 1D. Mais à température cryogénique et à l’échelle de l’objet unique,les propriétés optiques observées expérimentalement sont systématiquement très éloignées de celles d’un objet 1D. On peut notamment citer l’apparition de propriétés comme l’émission de photons uniques, qui a largement contribué à l’intensification de la recherche sur ces objets pour des applications en photonique quantique. Ces propriétés sont attribuées à la localisation des excitons le long de l’axe des nanotubes dans des puits de potentiel créés aléatoirement par l’interaction des nanotubes avec leur environnement. Les propriétés optiques sont alors proches de celles des objets0D, et sont fortement modulées par l’environnement. Les mécanismes et l’origine de la localisation et la connaissance physique de ces puits sont encore très limités. Ce travail montre d’une part le développement d’une technique d’absorption sur objet individuel et la caractérisation de sa sensibilité, et d’autre part l’étude statistique de l’émission de nanotubes à température cryogénique. Les résultats obtenus par une technique de super-résolution couplée à une imagerie hyper-spectrale montrent les grandeurs caractéristiques des puits de potentiels au sein de nanotubes individuels.Un dispositif expérimental de photoluminescence résolue en excitation implémenté au cours de ce travail a également montré une modification de l’état excitonique fondamental par l’environnement, avec l’apparition d’une discrétisation spatiale et spectrale de l’état fondamental délocalisé en une multitude d’états localisés. / The optical properties of carbon nanotubes are ideally described by the physicsof a one-dimensional object, giving rise in particular to the emergence of excitons todescribe the optical transitions of these objects. The optical experiments (emission,absorption) carried out on these objects at ambient temperature and on ensemblesconfirm the theoretical predictions based on the physics of 1D objects. But atcryogenic temperature and at the single emitter scale, the optical properties observedexperimentally are systematically different from those of a 1D object. One can citethe emergence of properties such as photon antibunching, which largely contributed tothe intensification of research on these objects for applications in quantum photonics.These properties are attributed to the localization of excitons along the nanotube axisin local potential wells (traps) created randomly by the interaction of nanotubes withtheir environment. The optical properties are then close to those of 0D objects, andare strongly modulated by the environment. The mechanisms and the origin of thelocalization and the physical knowledge of these traps are still very limited. This workshows on the one hand the development of an absorption setup on individual objectand the characterization of its sensitivity, and on the other hand the statistical studyof the emission of nanotubes at cryogenic temperature in a micro-photoluminescencesetup. The results obtained in the later setup by a super-resolution technique coupledwith hyper-spectral imaging show the characteristic quantities of potential wellswithin individual nanotubes. An experimental excitation-resolved photoluminescencesetup implemented during this work also showed a modification of the fundamentalexcitonic state by the environment, with the emergence of a spatial and spectraldiscretization of the delocalized ground state in a multitude of localized states.

Les différentes modalités d’imagerie par ondes présentent chacune des limitations en termes de résolution ou de contraste. Dans ce travail, nous modélisons l’imagerie ultrasonore ultrarapide et présentons des méthodes de reconstruction qui améliorent la précision de l’imagerie ultrasonore. Nous introduisons deux méthodes qui permettent d’augmenter le contraste et de mesurer la position super-résolue et la vitesse dans les vaisseaux sanguins. Nous présentons aussi une méthode de reconstruction des paramètres microscopiques en tomographie d’impédance électrique en utilisant des mesures multifréquence et en s’aidant de la théorie de l’homogénéisation. / Different modalities in wave imaging each present limitations in terms of resolution or contrast. In this work, we present a mathematical model of the ultrafast ultrasound imaging modality and reconstruction methods which can improve contrast and resolution in ultrasonic imaging. We introduce two methods which allow to improve contrast and to locate blood vessels belowthe diffraction limit while simultaneously estimating the blood velocity. We also present a reconstruction method in electrical impedance tomography which allows reconstruction of microscopic parameters from multi-frequency measurements using the theory of homogenization.

Parmi les diverses modalités biométriques qui permettent l'identification des personnes, l'iris est considéré comme très fiable, avec un taux d'erreur remarquablement faible. Toutefois, ce niveau élevé de performances est obtenu en contrôlant la qualité des images acquises et en imposant de fortes contraintes à la personne (être statique et à proximité de la caméra). Cependant, dans de nombreuses applications de sécurité comme les contrôles d'accès, ces contraintes ne sont plus adaptées. Les images résultantes souffrent alors de diverses dégradations (manque de résolution, artefacts...) qui affectent négativement les taux de reconnaissance. Pour contourner ce problème, il est possible d’exploiter la redondance de l’information découlant de la disponibilité de plusieurs images du même œil dans la séquence enregistrée. Cette thèse se concentre sur la façon de fusionner ces informations, afin d'améliorer les performances. Dans la littérature, diverses méthodes de fusion ont été proposées. Cependant, elles s’accordent sur le fait que la qualité des images utilisées dans la fusion est un facteur crucial pour sa réussite. Plusieurs facteurs de qualité doivent être pris en considération et différentes méthodes ont été proposées pour les quantifier. Ces mesures de qualité sont généralement combinées pour obtenir une valeur unique et globale. Cependant, il n'existe pas de méthode de combinaison universelle et des connaissances a priori doivent être utilisées, ce qui rend le problème non trivial. Pour faire face à ces limites, nous proposons une nouvelle manière de mesurer et d'intégrer des mesures de qualité dans un schéma de fusion d'images, basé sur une approche de super-résolution. Cette stratégie permet de remédier à deux problèmes courants en reconnaissance par l'iris: le manque de résolution et la présence d’artefacts dans les images d'iris. La première partie de la thèse consiste en l’élaboration d’une mesure de qualité pertinente pour quantifier la qualité d’image d’iris. Elle repose sur une mesure statistique locale de la texture de l’iris grâce à un modèle de mélange de Gaussienne. L'intérêt de notre mesure est 1) sa simplicité, 2) son calcul ne nécessite pas d'identifier a priori les types de dégradations, 3) son unicité, évitant ainsi l’estimation de plusieurs facteurs de qualité et un schéma de combinaison associé et 4) sa capacité à prendre en compte la qualité intrinsèque des images mais aussi, et surtout, les défauts liés à une mauvaise segmentation de la zone d’iris. Dans la deuxième partie de la thèse, nous proposons de nouvelles approches de fusion basées sur des mesures de qualité. Tout d’abord, notre métrique est utilisée comme une mesure de qualité globale de deux façons différentes: 1) comme outil de sélection pour détecter les meilleures images de la séquence et 2) comme facteur de pondération au niveau pixel dans le schéma de super-résolution pour donner plus d'importance aux images de bonnes qualités. Puis, profitant du caractère local de notre mesure de qualité, nous proposons un schéma de fusion original basé sur une pondération locale au niveau pixel, permettant ainsi de prendre en compte le fait que les dégradations peuvent varier d’une sous partie à une autre. Ainsi, les zones de bonne qualité contribueront davantage à la reconstruction de l'image fusionnée que les zones présentant des artéfacts. Par conséquent, l'image résultante sera de meilleure qualité et pourra donc permettre d'assurer de meilleures performances en reconnaissance. L'efficacité des approches proposées est démontrée sur plusieurs bases de données couramment utilisées: MBGC, Casia-Iris-Thousand et QFIRE à trois distances différentes. Nous étudions séparément l'amélioration apportée par la super-résolution, la qualité globale, puis locale dans le processus de fusion. Les résultats montrent une amélioration importante apportée par l'utilisation de la qualité globale, amélioration qui est encore augmentée en utilisant la qualité locale / Among the large number of biometric modalities, iris is considered as a very reliable biometrics with a remarkably low error rate. The excellent performance of iris recognition systems are obtained by controlling the quality of the captured images and by imposing certain constraints on users, such as standing at a close fixed distance from the camera. However, in many real-world applications such as control access and airport boarding these constraints are no longer suitable. In such non ideal conditions, the resulting iris images suffer from diverse degradations which have a negative impact on the recognition rate. One way to try to circumvent this bad situation is to use some redundancy arising from the availability of several images of the same eye in the recorded sequence. Therefore, this thesis focuses on how to fuse the information available in the sequence in order to improve the performance. In the literature, diverse schemes of fusion have been proposed. However, they agree on the fact that the quality of the used images in the fusion process is an important factor for its success in increasing the recognition rate. Therefore, researchers concentrated their efforts in the estimation of image quality to weight each image in the fusion process according to its quality. There are various iris quality factors to be considered and diverse methods have been proposed for quantifying these criteria. These quality measures are generally combined to one unique value: a global quality. However, there is no universal combination scheme to do so and some a priori knowledge has to be inserted, which is not a trivial task. To deal with these drawbacks, in this thesis we propose of a novel way of measuring and integrating quality measures in a super-resolution approach, aiming at improving the performance. This strategy can handle two types of issues for iris recognition: the lack of resolution and the presence of various artifacts in the captured iris images. The first part of the doctoral work consists in elaborating a relevant quality metric able to quantify locally the quality of the iris images. Our measure relies on a Gaussian Mixture Model estimation of clean iris texture distribution. The interest of our quality measure is 1) its simplicity, 2) its computation does not require identifying in advance the type of degradations that can occur in the iris image, 3) its uniqueness, avoiding thus the computation of several quality metrics and associated combination rule and 4) its ability to measure the intrinsic quality and to specially detect segmentation errors. In the second part of the thesis, we propose two novel quality-based fusion schemes. Firstly, we suggest using our quality metric as a global measure in the fusion process in two ways: as a selection tool for detecting the best images and as a weighting factor at the pixel-level in the super-resolution scheme. In the last case, the contribution of each image of the sequence in final fused image will only depend on its overall quality. Secondly, taking advantage of the localness of our quality measure, we propose an original fusion scheme based on a local weighting at the pixel-level, allowing us to take into account the fact that degradations can be different in diverse parts of the iris image. This means that regions free from occlusions will contribute more in the image reconstruction than regions with artefacts. Thus, the quality of the fused image will be optimized in order to improve the performance. The effectiveness of the proposed approaches is shown on several databases commonly used: MBGC, Casia-Iris-Thousand and QFIRE at three different distances: 5, 7 and 11 feet. We separately investigate the improvement brought by the super-resolution, the global quality and the local quality in the fusion process. In particular, the results show the important improvement brought by the use of the global quality, improvement that is even increased using the local quality

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a powerful approach to investigate the molecular ultrastructure of labeled cell compartments. However, quantitative CLEM studies are rare, mainly due to small sample sizes and the sensitivity of fluorescent proteins to strong fixatives and contrasting reagents for EM. Here, we show that fusion of a self-labeling protein to insulin allows for the quantification of age-distinct insulin granule pools in pancreatic beta cells by a combination of super resolution and transmission electron microscopy on Tokuyasu cryosections. In contrast to fluorescent proteins like GFP organic dyes covalently bound to self-labeling proteins retain their fluorescence also in epoxy resin following high pressure freezing and freeze substitution, or remarkably even after strong chemical fixation. This enables for the assessment of age-defined granule morphology and degradation. Finally, we demonstrate that this CLEM protocol is highly versatile, being suitable for single and dual fluorescent labeling and detection of different proteins with optimal ultrastructure preservation and contrast.

Diplomová práca je zameraná na spracovávanie obrazov sietnice s vysokým rozlíšením. Cieľom práce je zlepšiť výslednú kvalitu výsledných snímkov sietnice získaných zo sekvencie snímkov nižšej kvality. Jednotlivé snímky sú najskôr spracované pomocou bilaterálnej filtrácie a zlepšenia kontrastu. v ďalšom kroku sú odstránené rozmazané snímky a snímky zobrazujúce iné časti sietnice. Posun medzi jednotlivými snímkami v sekvencii sa odhaduje pomocou fázovej korelácie, a tieto obrazy sú potom fúzované do výsledného snímku s vysokým rozlíšením pomocou priemerovania a využitia superrozlišovacej techniky, presnejšie regularizácie pomocou bilaterálneho celkového rozptylu. Výsledné mediánové hodnoty skóre kvality získaných obrazov sú PIQUE 0.2600, NIQE 0.0701, a BRISQUE 0.3936 pre techniku priemerovania, a PIQUE 0.1063, NIQE 0.0507, and BRISQUE 0.1570 pre superrozlišovaciu techniku.