Title: Imaging of fluorescently labelled mitochondria using Biplane FPALM microscopy Author: Bc. Marek Dostál Department: Fyzikální ústav UK Supervisor: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Consultants: RNDr. Petr Ježek, DrSc. Mgr. Hana Engstová, Ph.D. Abstract: In this thesis the results are presented of a search for suitable PCFP markers for a visualization inner and outer mitochondrial membranes by unique biplane FPALM microscope. We participated in debugging the measuring software for the purpose of 3D vizualization mitochondrial nets and determine their parameters. For this purpose were developed two methods. The first one can be applied to determine the parametrs of outer membranes and the second one is applicable to determine parametrs of inner membranes. On smaller statistical file we managed to confirm dependence quality of mitochondrial net on the cell culture conditions. Under stress conditions e.g. hypoxia the quality of mitochondrial net is changed. Keywords: mitochondria, Biplane FPALM, GFP, 3D visualization.

Les masques de phase sont des dispositifs réfractifs situés généralement au niveau de la pupille d’un système optique pour en modifier la réponse impulsionnelle (PSF en anglais), par une technique habituellement connue sous le nom de codage de front d’onde. Ces masques peuvent être utilisés pour augmenter la profondeur du champ (DoF en anglais) des systèmes d’imagerie sans diminuer la quantité de lumière qui entre dans le système, en produisant une PSF ayant une plus grande invariance à la défocalisation. Cependant, plus le DoF est grand plus l’image acquise est floue et une opération de déconvolution doit alors lui être appliquée. Par conséquent, la conception des masques de phase doit prendre en compte ce traitement pour atteindre le compromis optimal entre invariance de la PSF à la défocalisation et qualité de la déconvolution.. Cette approche de conception conjointe a été introduite par Cathey et Dowski en 1995 et affinée en 2002 pour des masques de phase continus puis généralisée par Robinson et Stork en 2007 pour la correction d’autres aberrations optiques.Dans cette thèse sont abordés les différents aspects de l’optimisation des masques de phase pour l’augmentation du DoF, tels que les critères de performance et la relation entre ces critères et les paramètres des masques. On utilise la « qualité d’image » (IQ en anglais), une méthode basée sur l’écart quadratique moyen définie par Diaz et al., pour la co-conception des divers masques de phase et pour évaluer leur performance. Nous évaluons ensuite la pertinence de ce critère IQ en comparaison d’autres métriques de conception optique, comme par exemple le rapport de Strehl ou la fonction de transfert de modulation (MTF en anglais). Nous nous concentrons en particulier sur les masques de phase annulaires binaires, l’étude de leur performance pour différents cas comme l’augmentation du DoF, la présence d’aberrations ou l’impact du nombre de paramètres d’optimisation.Nous appliquons ensuite les outils d’analyse exploités pour les masques binaires aux masques de phase continus qui apparaissent communément dans la littérature, comme les masques de phase polynomiaux. Nous avons comparé de manière approfondie ces masques entre eux et aux masques binaires, non seulement pour évaluer leurs avantages, mais aussi parce qu’en analysant leurs différences il est possible de comprendre leurs propriétésLes masques de phase fonctionnent comme des filtres passe-bas sur des systèmes limités par la diffraction, réduisant en pratique les phénomènes de repliement spectral. D’un autre côté, la technique de reconstruction connue sous l’appellation de « superresolution » utilise des images d’une même scène perturbées par du repliement de spectre pour augmenter la résolution du système optique original. Les travaux réalisés durant une période de détachement chez le partenaire industriel de la thèse, KLA-Tencor à Louvain, Belgique, illustrent le propos. A la fin du manuscrit nous étudions la pertinence de la combinaison de cette technique avec l’utilisation de masques de phase pour l’augmentation du DoF. / Phase masks are wavefront encoding devices typically situated at the aperture stop of an optical system to engineer its point spread function (PSF) in a technique commonly known as wavefront coding. These masks can be used to extend the depth of field (DoF) of imaging systems without reducing the light throughput by producing a PSF that becomes more invariant to defocus; however, the larger the DoF the more blurred the acquired raw image so that deconvolution has to be applied on the captured images. Thus, the design of the phase masks has to take into account image processing in order to reach the optimal compromise between invariance of PSF to defocus and capacity to deconvolve the image. This joint design approach has been introduced by Cathey and Dowski in 1995 and refined in 2002 for continuous-phase DoF enhancing masks and generalized by Robinson and Stork in 2007 to correct other optical aberrations.In this thesis we study the different aspects of phase mask optimization for DoF extension, such as the different performance criteria and the relation of these criteria with the different mask parameters. We use the so-called image quality (IQ), a mean-square error based criterion defined by Diaz et al., to co-design different phase masks and evaluate their performance. We then compare the relevance of the IQ criterion against other optical design metrics, such as the Strehl ratio, the modulation transfer function (MTF) and others. We focus in particular on the binary annular phase masks, their performance for various conditions, such as the desired DoF range, the number of optimization parameters, presence of aberrations and others.We use then the analysis tools used for the binary phase masks for continuous-phase masks that appear commonly in the literature, such as the polynomial-phase masks. We extensively compare these masks to each other and the binary masks, not only to assess their benefits, but also because by analyzing their differences we can understand their properties.Phase masks function as a low-pass filter on diffraction limited systems, effectively reducing aliasing. On the other hand, the signal processing technique known as superresolution uses several aliased frames of the same scene to enhance the resolution of the final image beyond the sampling resolution of the original optical system. Practical examples come from the works made during a secondment with the industrial partner KLA-Tencor in Leuven, Belgium. At the end of the manuscript we study the relevance of using such a technique alongside phase masks for DoF extension.

Plasma membrane of T cells is abundant in diverse receptors and other molecules orchestrating immune responses. Numerous studies demonstrate that the localisation of proteins in the cell is non-random and that mislocalisation either in the context of plasma membrane at nanoscale or with respect to the cell interior can lead to the protein malfunction and subsequent aberrant T- cell response. In my first Ph.D. project we focused mainly on the role of the transmembrane domain length and amino acid composition, proximal sequences and the presence or absence of palmitoylation on the localisation of transmembrane adaptor proteins LAT, PAG and NTAL in T cells. We showed that plasma membrane localisation of PAG and NTAL is controlled by the amino acid composition of their TMD and is palmitoylation independent. We propose that NTAL localisation to the plasma membrane is, despite its suboptimal length, facilitated by the electrochemical asymmetry of its TMD. Among transmembrane adaptor proteins, LAT was the most interesting one. Dependency of LAT plasma membrane localisation on palmitoylation in combination with unusual amino acid composition of its TMD led us to investigate it in a separate project. My first author Ph.D. project was thus to elucidate the role of highly conserved helix-breaking amino acids,...

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Skeletal muscle fascia is a connective tissue which provides structure and aidswith force transfer in a muscle. Currently there are no good ways of detectingand analyzing micrometer thick structures of this tissue in-vivo. In this thesis,we created a model to detect skeletal muscle fascia, and tested its performanceusing simulated data. Utilizing the ultrasound simulation software Vantage,which operates through MATLAB, we created a simulation model which repli-cates the properties and behaviour of skeletal muscle fascia. To detect thetissue, we changed and adapted a previously implemented model of ultrasoundlocalization microscopy (ULM), previously only used to create super resolutionimages of blood vessels. Finally we evaluated the models ability to locate anddetermine the thickness of the simulated fascia. Additionally we tested themodels ability to separate adjacent objects.We found that our model was successful at detecting and localizing thesimulated fascia, with a sub wavelength accuracy. The precision of the locatedfascia appears more accurate for horizontally aligned objects compared to thevertically aligned ones. The results from determining the thickness of the fasciaproved relatively successful as well. However the results showed a high variance.This could be improved through an inclusion of stocasticity in the simulationmodel we developed. Finally the ability to distinguish two objects close to eachother showed successful results as well. The method was able to clearly detecta fascia circle with a 0.5mm diameter. It was unable to detect the sides a fasciacircle with a 0.25mm diameter.The main limitation with the model we have developed lies in the simulationsperformed. The simulation model we used was very basic, meaning that it didnot perfectly represent the skeletal muscle fascia we sought to examine. Furtherdevelopment of the simulation model is required to provide a result which ismore representative of real skeletal muscle fascia.The analysis of this first model shows promise in detecting the simplifiedfascia provided by our simulation model. At this stage, the method will requiremore extensive testing, together with a more thorough statistical analysis, beforewe can state the usefulness of the method.

Les contacts cellulaires sont formés par l'association et la clusterisation des molécules d'adhésion, qui agissent comme des unités d'organisation et de signalisation, garantissant la cohérence et la plasticité des tissus. Bien que les détails moléculaires des complexes d'adhésion soient bien caractérisés, la façon dont ces unités d'adhérence supramoléculaires sont organisés et régulées dans les conditions physiologiques est méconnue. Nous avons développé et appliqué la microscopie super-résolue et une analyse quantitative pour caractériser l'organisation nanométrique de la E-cadhérine dans le tissu épithélial de l'embryon de drosophile. Les molécules individuelles de la E-cadhérine sont localisées en 3D avec une précision de 30 et 100 nm dans des directions latérale et axiale, respectivement. Nous avons constaté que la E-cadhérine existe soit sous forme de monomères ou d'oligomères, contenant jusqu'à une centaine de molécules. La distribution de taille des clusters suit une loi de puissance (sans taille caractéristique). L'analyse de la répartition de clusters à différentes étapes de la morphogénèse indique que l'état d'agrégation est dicté par la concentration de la E-cadhérine aux jonctions. Pour tenter de déterminer comment la clusterisation de la E-cadhérine est régulée, nous avons perturbé l'endocytose et l'ancrage de la E-cadhérine à l'actine, et analysé l'état de clusterisation. / Cell-cell contacts form through binding and clustering of adhesion molecules, which act as organizational and signaling units and ensure coherence and plasticity of tissues. While the molecular details of adhesion complexes are well characterized, little is known about how these supramolecular adhesion units are organized and regulated in physiological conditions. We developed and applied superresolution microscopy and quantitative analysis to characterize the nanoscale organization of E-cadherin clusters in the early epithelial tissue of Drosophilaembryos. E-cadherin molecules at adherens junctions were localized in 3D with precision of 30 and 100 nm in lateral and axial directions, respectively. We found that E-cadherin exists either as monomers or oligomeric clusters, containing up to one hundred molecules. The cluster size distribution follows a power law - referred as scale free with no characteristic size. Analysis of clustering distribution at different stages of tissue morphogenesis indicates that the state of aggregation is dictated by the junctional concentration of E-cadherin. In an attempt to determine how E-cadherin clustering might be regulated, we perturbed endocytosis and anchoring of E-cadherin to actin, and analyzed the state of E-cadherin clustering. While blocking dynamin-dependent endocytic pathways yields increases of junctional E-cadherin concentration and promotes macroscopic aggregates, RNAi knockdown of α-catenin and Par-3 reduces E-cadherin concentration and changes significantly the organization of E-cadherin.

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La relation entre le repliement du génome et les processus cellulaires majeurs, notamment la transcription, la réparation de l’ADN et la réplication est une question biologique centrale. De nouvelles méthodes de la génomique ont révélé un niveau inconnu de l’architecture tridimensionnelle de la chromatine. A l’échelle en dessous de la mégabase, certaines séquences génomiques se trouvent préférentiellement à proximité les unes des autres formant ainsi des domaines topologiques associés (TAD). Les gènes situés dans le même TAD ont des propriétés épigénétiques similaires, et leur expression au cours de la différentiation semble corrélée, ce qui suggère un lien fort entre la structure de la chromatine et la transcription. Les TADs sont à leur tour séparés par des régions avec peu de contacts, appelées frontières, qui sont généralement occupées par des protéines dites isolatrices. Les déterminants de cette organisation chromatinienne particulière et ses implications fonctionnelles sont largement méconnus. Selon une hypothèse récente, les TADs seraient formés par des contacts entre les séquences des frontières, stabilisés par la formation de boucles via les protéines isolatrices. Les travaux présentés ici ont pour but d’étudier le rôle des protéines isolatrices dans le mécanisme de formation des TADs chez la drosophile. La microscopie super-résolue a été implémentée et une série de développements ont été réalisés en microscopie à illumination structurée (SIM) et la microscopie à localisation de molécules uniques (SMLM), avec une attention particulière sur le marquage fluorescent. Ces développements ont directement été appliqués à l’étude de l’organisation nucléaire de la protéine associée aux éléments frontières (BEAF), une des 11 protéines isolatrices identifiées à ce jour chez la drosophile. Le fort enrichissement aux frontières des TADs, ainsi que son activité dans la formation de boucles d’ADN font de BEAF un candidat intéressant pour tester l’hypothèse de regroupement de frontières comme mécanisme général de repliement de la chromatine. La technique SMLM multi-couleurs a systématiquement localisé BEAF à la périphérie des larges domaines portant la marque épigénétique H3K27me3. L’analyse quantitative des images SMLM a révélé que BEAF forme des centaines de foyers d’une taille de 45 nm, composés en moyenne de 5 molécules, ce qui est en désaccord avec la présence de boucles de chromatine à large échelle. Afin de tester le regroupement de gènes directement au niveau de l’ADN, des frontières ont été marquées par des oligonucléotides fluorescents. Le nombre de foyers détectés par SIM s’est à nouveau révélé incompatible avec le modèle de contacts entre les frontières tout le long du génome. Par ailleurs, les distances entre paires de frontières au niveau de deux régions génomiques ont montré <5% de contacts. Ensemble, ces résultats sont en désaccord avec l’établissement d’interactions entre barrières chez la drosophile. Enfin, ces travaux de thèse ont contribué au développement méthodologique de la microscopie super-résolue, ce qui a permis d’apporter des preuves expérimentales invalidant le modèle de regroupement des frontières comme mécanisme général du repliement chromatinien. / The interplay between genome folding and key cellular functions such as transcription, DNA repair and replication is a fundamental question in chromatin biology. Recent genome-wide developments unveiled a new level of three-dimensional chromatin architecture. At the sub-megabase scale, some genome sequences are preferentially found in proximity with one another forming Topologically Associating Domains (TADs). Genes located within the same TAD display common epigenetic properties and tend to have coordinated dynamics of expression during differentiation, suggesting a strong link between chromatin structure and transcription. TADs are in turn separated by regions of low contact, termed TAD borders, which are generally occupied by factors called chromatin insulators. What are the determinants of this particular type of chromatin organization and what are the functional implications is still largely unknown. In an emerging hypothesis, TADs could be formed through contacts between TAD border sequences stabilized by the looping activity of insulator proteins. This thesis investigates the roles of insulator proteins in the TAD formation mechanism using Drosophila melanogaster as model system. Superresolution imaging was implemented and a series of developments were performed in Structured Illumination Microscopy (SIM) and Single-molecule Localization Microscopy (SMLM), with particular attention on fluorescent labeling for single-molecule detection. These developments were directly applied to study the nuclear organization of the Boundary Element Associated Factor (BEAF), one of the 11 insulator proteins discovered to date in Drosophila. The strong enrichment on TAD borders and its demonstrated looping activity make BEAF a potent candidate to test for the clustering of TAD borders as a general mechanism of chromatin folding. Multicolor SMLM systematically located BEAF foci at the periphery of large H3K27me3 chromatin domains. Quantitative analysis of SMLM images indicated BEAF forms hundreds of 45 nm foci, containing a mean of 5 molecules, which argues against a large-scale looping of BEAF-bound chromatin. To directly probe for gene clustering at the DNA level, TAD borders were labeled using fluorescent oligonucleotide probes. The number of foci detected by SIM was once more incompatible with a model of chromosome-wide contacting of multiple TAD borders. Furthermore, TAD border pairs distances were measured in two genomic regions, resulting in <5% of paired contacts among the measured barriers. Taken together, these results are inconsistent with constitutive interactions between consecutive or non-consecutive barriers in Drosophila.In conclusion, this study contributed to the methodological development of super-resolution microscopy which was applied to provide experimental evidence invalidating the TAD border clustering model as a general mechanism of chromatin folding.

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