L’architecture du système racinaire des légumineuses est déterminée par la croissance des racines et leur capacité à former des racines latérales et des nodosités symbiotiques fixatrices d’azote en fonction des conditions environnementales. Chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, nous avons mis en évidence que les phytohormones gibbérellines (GAs) et leur voie de signalisation – médiée par trois protéines MtDELLAs présentant des profils d’expression redondants – jouent un rôle clé dans la régulation du développement du système racinaire. En conditions non-symbiotiques, les GAs régulent négativement la croissance racinaire en réprimant l’activité méristématique et l’élongation cellulaire, et inhibent la formation des racines latérales. En conditions symbiotiques, le rôle des GAs et de leur voie de signalisation est double : au niveau de l’épiderme, les protéines MtDELLAs régulent positivement l’infection par les bactéries symbiotiques Rhizobia en interagissant de façon directe avec la voie de signalisation des facteurs Nod bactériens. Au niveau du cortex, les GAs régulent négativement l’organogénèse des nodosités. Les phytohormones cytokinines (CKs) et leur récepteur MtCRE1 étant essentiels pour initier la nodulation, l’interaction entre les voies de signalisation GA et CK a été analysée en parallèle. Les CKs régulent le niveau de GAs bioactives en modulant l’expression des gènes de leur métabolisme de manière dépendante du récepteur aux CKs MtCRE1. Réciproquement, les GAs régulent les gènes du métabolisme CK et le niveau de CKs bioactives de manière dépendante des MtDELLAs. Par ailleurs, une forme activée de MtDELLA complémente partiellement le phénotype de nodulation du mutant cre1 et lie le promoteur de MtCRE1, indiquant que les voies de signalisation GA et CK régulent la nodulation en étroite association. / Legume root system architecture is determined by both root growth and their ability to form lateral roots and nitrogen-fixing symbiotic nodules, depending on environmental soil conditions. In the model legume Medicago truncatula, we have shown that the phytohormones gibberellins (GAs) and their signaling – involving three MtDELLA proteins with redundant expression patterns – play a crucial role in the regulation of the root system development. In non-symbiotic conditions, GAs negatively regulate root growth through the repression of meristematic activity and cell elongation, and inhibit lateral root formation. In symbiotic conditions, GA and their signaling pathway play a dual role: in the root epidermis, MtDELLA proteins positively regulate infection by symbiotic bacteria Rhizobia, by directly interacting with the bacterial Nod factor signaling pathway. In the root cortex, GAs negatively regulate nodule organogenesis. The phytohormones cytokinins (CKs) and their receptor MtCRE1 being essential for the initiation of nodulation, we additionally analyzed the crosstalk between GA and CK signaling. CKs regulate the bioactive GA pool, controlling the expression of GA-metabolic genes, depending on the MtCRE1 receptor. In turn, GAs regulate CK-metabolic genes and the bioactive CK pool, depending on MtDELLAs. In addition, a dominant version of a MtDELLA partially complements the nodulation phenotype of the cre1 mutant and binds to the MtCRE1 promoter. These results indicate that GA and CK signaling pathways closely interact to regulate nodulation.

En cas de carence azotée, les légumineuses sont capables de mettre en place une symbiose avec des bactéries du sol fixatrices d’azote appelées rhizobia. Cette symbiose a lieu dans un organe appelé nodosité où les bactéries sont endocytées et appelées bactéroïdes. Certains clades de légumineuses imposent un processus de différenciation à leurs bactéroïdes qui agrandissent considérablement et deviennent polyploïdes, menant à des morphotypes bactériens allongés ou sphériques. Au cours de cette thèse, j’ai étudié la différenciation des bactéroïdes de Bradyrhizobium spp. en association avec Aeschynomene spp.. Les bactéroïdes de ces plantes présentent des degrés de différenciation distincts qui dépendent de l’espèce hôte. Mes données suggèrent que les bactéroïdes les plus différenciés sont aussi les plus efficaces. J’ai cherché à savoir quels facteurs procaryotes pourraient être impliqués dans les adaptations des bactéroïdes au processus de différenciation et à leurs divers hôtes, le tout en lien avec cette différence d’efficacité symbiotique au travers d’approches globales sans a priori de type -omiques. Les conditions considérées sont des bactéroïdes de différents morphotypes et des cultures libres de référence. Les fonctions activées en conditions symbiotiques ont été identifiées, ainsi que les gènes spécifiques d’un hôte donné. Des analyses fonctionnelles des gènes d’intérêt ont également été menées. Les mutants bactériens n’ont toutefois pas présenté de phénotype symbiotique drastique, montrant ainsi l’existence de réseaux de gènes complexes menant à la résilience des génomes de rhizobia. / In case of nitrogen starvation, legume plants establish a symbiotic interaction with nitrogen-fixing soil bacteria called rhizobia. This interaction takes place in nodules where the symbionts are internalized and become bacteroids. Some legume clades also impose a differentiation process onto the bacteroids which become enlarged and polyploid, leading to elongated or spherical morphotypes. During my PhD work, I have studied bacteroid differentiation of Bradyrhizobium species in association with Aeschynomene spp.. These bacteroids display distinct differentiation levels depending on the plant host, and my analyses suggest that the most differentiated ones are also the most efficient. I investigated the bacterial factors potentially involved in the adaptations to differentiation and host-specificity, and related to the higher efficiency of the most differentiated bacteroids using global-omics approaches without a priori. The analyzed conditions were bacteroids of distinct morphotypes and free-living reference cultures. Activated functions under symbiotic conditions were identified, as well as host-specific ones. Functional analyses were performed on genes of interest. However, the bacterial mutants did not display drastic symbiotic phenotypes, showing the existence of complex gene networks leading to high resilience of rhizobial genomes.

L’association symbiotique entre les légumineuses et les rhizobia aboutit à la formation de la nodosité fixatrice d’azote. Cet organe symbiotique généré de-novo permet l’hébergement intracellulaire des rhizobia qui, grâce à leurs activités nitrogénase,réduisent l’azote atmosphérique en ammonium, une forme de l’azote directement assimilable par la plante hôte.Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la reconnaissance entre les deux partenaires symbiotiques, au processus d’infection et à l’organogénèse de la nodosité sont bien décrits, cependantl’établissement et la maintenance de l’identité de cet unique organe souterrain restent incompris.Les gènes NODULE-ROOT de Medicago truncatula, BLADEON-PETIOLE d’Arabidopsis thaliana et COCHLEATA de Pisumsativum sont membres du clade spécifique très conservé NOOTBOP-COCH-LIKE1 (NBCL1) qui fait partie de la famille des gènesNON-EXPRESSOR OF PATHOGENESIS RELATED PROTEIN1-LIKE. Chez les légumineuses, les membres de ce clade NBCL1 sont connus comme étant des régulateurs clés de l’identité de l’organe symbiotique.Mon travail de thèse a eu pour but d’améliorer la compréhension des rôles des gènes NBCL1, à la fois chez des espèces formant des nodosités indéterminées et déterminées, ainsi que de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans l’identité de la nodosité dont la régulation est dépendante des gènesNBCL1, essentiellement par l’utilisation de mutants TILLING, Tnt1et LORE1 originaux chez trois espèces de légumineuses: la luzerne tronquée, le petit pois et le lotier.Ce travail rapporte essentiellement l’identification et la caractérisation de nouveaux mutants affectés dans des gènes qui font partie d’un second sous-clade NBCL2 spécifique des légumineuses.Nous avons révélé que les membres de ce sous-clade spécifique des légumineuses NBCL2 jouent d’importants rôles dans le développement de la nodosité, dans l’établissement et la maintenance de l’identité de la nodosité et par conséquence dans le succès et l’efficacité de l’association symbiotique.Ce travail suggère aussi qu’au cours de l’évolution, le programme de développement de la nodosité a recruté des mécanismes de régulations préexistants afin de réguler le développement de la nodosité et son identité, tel que le module de régulation impliquant des interactions entre des protéines NBCL et des facteurs de transcriptions basic leucine zipper de type TGACG. Nous avons identifié le facteur de transcription MtPERIANTHIA-LIKE, comme un premier partenaire protéique interagissant avec des protéines NBLC dans un contexte de nodosité symbiotique. Les gènes NBCL sont aussi impliqués dans les réseaux de régulations qui contrôlent le développement et le déterminisme de nombreux organes végétatifs et reproductifs aériens et sont également impliqués dans la capacité d’abscission de ces organes.Finalement, ce travail thèse a eu pour objectif d’explorer les rôles de ces gènes NBCL très conservés, dans le développement de la graminée non-domestiquée, Brachypodium distachyon. / The symbiotic interaction between legumes andrhizobia results in the formation of a symbiotic nitrogen fixingnodule.This de-novo generated symbiotic organ allows the intracellularaccommodation of the rhizobia which reduces through theirnitrogenase activity the atmospheric nitrogen in ammonium, anitrogen form usable by the host plant.The molecular mechanisms underlying the symbiotic partnersrecognition, the infection process and the nodule organogenesis arewell described, however the identity establishment and maintenanceof this unique underground organ remain mis-understood.The Medicago truncatula NODULE-ROOT, the Arabidopsisthaliana BLADE-ON-PETIOLE and the Pisum sativumCOCHLEATA genes are members of a highly conserved NOOTBOP-COCH-LIKE1 (NBCL1) specific clade that belongs to theNON-EXPRESSOR OF PATHOGENESIS RELATED PROTEIN1-LIKE gene family. In legumes, the members of this NBCL1 cladeare known as key regulators of the symbiotic nodule identity.The present thesis work aims to better understand the roles of theNBCL1 genes, in both indeterminate and determinate nodule formingspecies and to discover new molecular actors involved in theNBCL1-dependent regulation of the nodule identity essentially usingnovel TILLING, Tnt1 and LORE1 insertional mutants in three legumespecies, Medicago, Pisum and Lotus.This thesis work has allowed the identification and thecharacterization of new mutants for genes belonging to a secondarylegume-specific NBCL2 sub-clade. We revealed that the members ofthis legume-specific NBCL2 sub-clade play important roles in noduledevelopment, identity establishment and maintenance, andconsequently in the success and in the efficiency of the symbioticassociation.This thesis work also shows that during evolution, the noduledevelopmental program has recruited pre-existing regulatorymechanisms for the nodule development and identity, such as theregulatory module involving interactions between NBCL proteins andTGACG type basic leucine zipper transcription factors. We identifiedthe transcription factor, MtPERIANTHIA-LIKE, as a first interactingpartner of NBCL proteins in a context of root nodule symbiosis.NBCL genes are also involved in the regulatory networks thatcontrol the development and the determinacy of many abovegroundvegetative and reproductive organs and were also shown as involvedin their abscission ability.In this thesis we also explored the roles of these highly conservedNBCL genes in the development of the non-domesticated grass,Brachypodium distachyon.

Les légumineuses sont connues pour leurs capacités à établir une relation symbiotique avec des bactéries du sol fixatrices de l'azote atmosphérique. Cette interaction aboutit à la formation d'un nouvel organe au niveau des racines, la nodosité, au sein duquel le symbiote convertit l'azote atmosphérique (N2) en ammoniac, qui peut être directement consommé par les plantes. A l’intérieur de cette nodosité, la concentration en oxygène (O2) est maintenue à un très faible niveau car la réaction de réduction du N2 par l’enzyme bactérienne nitrogénase est inhibée par des traces d’oxygène. Un mécanisme de perception directe de l'O2 impliquant des membres de la famille des facteurs de transcription « Ethylene Responsive Factors » (ERFs) du groupe VII a récemment été découvert chez Arabidopsis thaliana. Ces facteurs de transcription (FT) possèdent une extrémité N-terminale caractéristique avec un résidu de cystéine à la seconde position. Dans des conditions normales d'O2, les FT sont conduit à la dégradation suivant une voie spécifique du protéasome. En condition de stress hypoxique, les TFs sont stabilisés et peuvent activer l’expression des gènes de réponse à l'hypoxie. Il a été démontré que la présence d’O2 et de NO était nécessaire pour déstabiliser ces protéines, et qu'une réduction de la disponibilité de l'un ou l'autre des gaz est suffisante pour protéger le résidu cystéine N-terminale de l'oxydation. L’objectif de cette thèse a été d'étudier le rôle de la famille ERF-VII dans la perception et l'adaptation au manque d'O2 chez M. truncatula. Des travaux ont aussi été menés pour déterminer l’importance du NO dans le fonctionnement en microoxie de la nodosité. Quatre gènes codant pour des facteurs de transcription de la famille ERF-VII ont été identifiés dans le génome de M. truncatula. La caractérisation de cette famille au niveau transcriptionnel a révélé que seul MtERF-B2.2 était induit par le stress hypoxique et au cours du développement des nodosités. Les trois autres, MtERF-B1.1, MtERF-B1.11 et MtERF-B2.3, sont constitutivement exprimés dans les feuilles, les racines et les nodosités. Pour étudier la stabilité de la protéine MtERF-B2.1, l’orthologue de RAP2.12 principal ERF-VII décrit dans la perception de l’O2 chez Arabidopsis, en fonction de la disponibilité de O2/NO, nous avons réalisé une protéine de fusion entre l’extrémité N-terminale de notre protéine et la protéine rapporteur luciférase. Les résultats obtenus sur des protoplastes d'Arabidopsis montrent l’implication la partie N-terminale de MtERF-B2.1 dans la régulation de la stabilité de la protéine, mais en contradiction avec les résultats obtenus en plantes composites de M. truncatula. La fonction de MtERF-B2.1 et MtERF-B2.11 a également été étudiée dans le cadre de la réponse au stress hypoxique et au cours du processus de nodulation en utilisant une stratégie d'interférence ARN. Des racines transgéniques dérégulées sur l’expression de MtERF-B2.1 et MtERF-B2.11 ont montré un défaut d’activation de plusieurs gènes de réponses à l'hypoxie tels que l’alcool déshydrogénase (ADH1) ou la pyruvate décarboxylase (PDC1). Ces racines transgéniques ARNi-MtERF-B2.1/B2.11 sont également affectées dans l'interaction symbiotique avec une réduction significative de la capacité de nodulation et de l'activité de fixation de l'azote dans les nodules matures. En conclusion, ces travaux révèlent que le mécanisme de détection d'O2 est médié par les ERF-VII dans les nodosités de M. truncatula et que ce mécanisme, associé aux cibles moléculaires régulées en aval, participe au développement de cet organe et au maintien de la capacité de fixatrice de celui-ci. De plus, les résultats indiquent que MtERF-B2.1/B2.11 sont des régulateurs positifs du métabolisme anaérobie et que les gènes associés au cycle hémoglobine-NO sont susceptibles d'activer d'autres voies de génération d'ATP. / Legume crops are known for their capacities to establish a symbiotic relationship with nitrogen fixing soil bacteria. This mutualism culminates in the formation of a new plant organ, the root nodule, in which the symbiont converts atmospheric nitrogen (N2) into ammonia, which can be directly consumed by plants. In nodules, bacterial nitrogenase enzyme is inhibited by traces of oxygen (O2) so different mechanisms maintain this organ at low O2 level. At the same time, nodules need to maintain a high ATP level to support the nitrogenase activity, which is highly energy demanding. Thus, a balance between a tight protection from O2 and an efficient energy production, referred as the “O2 paradox” of N2-fixing legume nodules, has to be reached. In Arabidopsis thaliana, a direct oxygen sensing mechanism has recently been discovered involving members of the ethylene responsive factors (ERFs) group VII. These transcription factors (TFs) possess a characteristic N-terminal amino acid with a cysteine residue at the second position that, under normal O2 conditions, leads to protein degradation following a specific pathway called the N-end rule pathway. Furthermore, it was shown that both O2 and nitric oxide (NO) are required to destabilize the ERFs VII and that a reduction in the availability of either gas is sufficient to stabilize these proteins. Therefore, the goal of this thesis was to investigated the role of ERF-VII family in O2 sensing and adaptation to hypoxia in M. truncatula, model plant for legumes, and to understand how NO interacts with O2 in hypoxic signalization in the microoxic environment that characterizes the nodule. We identified four genes belonging to the ERF-VII TF family in the M. truncatula genome, which present a strong similarity with ERF-VII of Arabidopsis. The characterization of this family at the transcriptional level revealed that only MtERF-B2.2 is up-regulated by hypoxia stress and during nodule development. The three others, MtERF-B1.1, MtERF-B1.11 and MtERF-B2.3 are found constitutively expressed in leaves, roots and nodules. To investigated the protein stability of MtERF-B2.1, the closest orthologous to AtRAP2.12 described as O2-sensors in Arabidopsis, in function of O2/NO availability, we realized a fusion protein with the luciferase reporter protein. Our results on Arabidopsis protoplasts indicated that the N-terminal part of MtERF-B2.1 drives its O2-dependent degradation by the N-end rule pathway. The function of MtERF-B2.1 and MtERF-B2.11 was also investigated both in response to hypoxia stress and during the nodulation process using an RNA interference strategy. Silencing of MtERFB2.1 and MtERF-2.11 showed a significant lower activation of several core hypoxia-responsive genes such as ADH1, PDC1, nsHb1 and AlaAT. These double knock-down transgenic roots were also affected in symbiotic interaction with a significant reduction of the nodulation capacity and nitrogen fixation activity in mature nodules. Overall, the results reveal that O2 sensing mechanism is mediated by ERF-VIIs in M. truncatula roots and nodules and that this mechanism, together with downstream targets, is involved in the organ development and ability to efficiently fix nitrogen. Furthermore, results indicated that MtERF-B2.1/B2.11 are positive regulator of the anaerobic metabolism and the Hb-NO cycle– related genes likely in order to activate alternative ATP generation pathways.