Die Funktion unseres Zentralnervensystems beruht auf der zeitlich präzisen Übertragung elektrischer Signale zwischen Neuronen. Diese synaptische Übertragung findet in weniger als einer tausendstel Sekunde statt. Eine schnelle und hochfrequente Signalübertragung erweitert die Kodierungskapazität und beschleunigt die Verarbeitung von Informationen. Obwohl viele der an synaptischer Übertragung beteiligten Prozesse und Proteine bekannt sind, ist das Verständnis der Mechanismen, die für eine schnelle und hochfrequente Signalübertragung verantwortlich sind, bisher unvollständig. Um die Mechanismen hochfrequenter synaptischer Übertragung zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit prä- und postsynaptische Patch-Clamp Ableitungen an der zerebellären Moosfaser-Körnerzell-Synapse in akuten Hirnschnitten der Maus eingesetzt. Es zeigte sich, dass diese Synapse präsynaptische Aktionspotenziale mit einer Frequenz über einem Kilohertz feuern kann und dass Informationen in diesem Frequenzbereich an die postsynaptische Zelle übertragen werden können. Hierbei vermitteln besonders schnelle Natrium- und Kalium-Kanäle eine extrem kurze Dauer der Aktionspotenziale, die dennoch metabolisch relativ effizient sind. Schnelle Kalzium-Kanäle und eine schwache präsynaptische Kalzium-Pufferung ermöglichen eine synchrone Vesikelfreisetzung mit hohen Frequenzen. Zusätzlich greift die Präsynapse auf einen großen Vorrat an freisetzbaren Vesikeln zurück, dessen Auffüllung besonders schnell stattfindet. Aufgrund der hochfrequenten synaptischen Übertragung ist die Moosfaser- Körnerzell-Synapse ideal, um zu untersuchen, wie schnell die auf eine Vesikelfreisetzung folgende Endozytose vonstatten geht. Mit optimierten, hochauflösenden Kapazitätsmessungen konnte an der Moosfaser-Körnerzell- Synapse eine sehr schnelle Endozytose nach einzelnen Aktionspotenzialen gezeigt werden. Die hohe Geschwindigkeit der Endozytose unterstützt somit eine hochfrequente synaptische Übertragung. Diese schnelle Endozytose wird durch die Moleküle Dynamin und Actin vermittelt und ist unabhängig von einer Wirkung von Clathrin. Stärkere Stimuli wie längere Depolarisationen evozieren eine langsamere Form der Endozytose, die zusätzlich Clathrin-abhängig ist. Durch die mechanistische Beschreibung hochfrequenter Signalübertragung an einer zentralen Synapse erweitern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unser Verständnis von synaptischer Übertragung und Informationsverarbeitung im Zentralnervensystem.

Dans le cortex cérébelleux, au premier chef impliqué dans l’apprentissage moteur, chaque neurone de Purkinje reçoit des centaines de milliers d'entrées provenant de cellules granulaires. Etonnement, il a été suggéré qu'une grande majorité de ces connexions (synapses) sont silencieuses, c’est-à-dire qu’elles ne transmettent pas d’information détectable. Les propriétés et le rôle de ces synapses silencieuses restent mystérieux. Jouent-elles le rôle d’une réserve ou sont-elles le produit de l’apprentissage cérébelleux ? En combinant l’enregistrement électrique de la transmission synaptique et la cartographie des entrées synaptiques dans des tranches aigües de cervelet de souris, nous avons étudié l'évolution du pourcentage des synapses qui sont silencieuses entre deux âges : avant le sevrage et une fois que l’agilité d’adulte est acquise. Nous avons observé que le pourcentage de synapses qui sont silencieuses reste remarquablement stable malgré l’augmentation du nombre total de synapses. / In the cerebellar cortex, primarily involved in motor learning, any Purkinje neuron receives hundreds of thousands of inputs from granule cells. Disturbingly, it has been suggested that the vast majority of these connections (synapses) are silent, that is to say they do not transmit any detectable information. The properties and the role of these silent synapses remains mysterious. Do they serve as a reserve pool for additional information storage or are they a byproduct of cerebellar learning? Combining the electrical recording of synaptic transmission and the mapping of synaptic inputs in acute cerebellar slices from mice, we have studied how the percentage of synapses which are silent changes between two postnatal ages: before weaning and once adult agility is acquired. Our main finding is that the percentage of synapses which are silent remains remarkably stable despite the increase in the total number of synapses.

.Les récepteurs AMPA, NMDA et mGluR5 sont responsables de la majeure partie des courants excitateurs dans la transmission synaptique glutamatergique. Le contrôle de la dynamique et de l’organisation de ces récepteurs dans la synapse, via une combinaison de diffusion latérale et d’endo/exocytose, est essentiel à la régulation de l’intensité de la transmission synaptique. Les protéines de la densité post-synaptique, telles que Homer, Shank et GKAP, régulent la diffusion de ces derniers, contrôlent leur nombre et leur organisation à la post-synapse. Mon travail de thèse a consisté à étudier la co-organisation nanoscopique des récepteurs AMPA, NMDA et mGluR5 à la post-synapse. Dans un premier temps, grâce au développement de différents outils méthodologiques, j’ai caractérisé les propriétés individuelles d’organisation et de dynamique des récepteurs glutamatergiques, ainsi que leurs propriétés de co-organisation au sein de la post-synapse. Dans un second temps, j’ai cherché à explorer l’impact d’une modification structurelle de la densité post-synaptique sur leur nano-organisation. L’utilisation d’un modèle de troubles du spectre autistique, basé sur la variation d’expression de la protéine d’échafaudage Shank3, a permis d’étudier la désorganisation fonctionnelle des récepteurs au glutamate induite par une perturbation structurelle de la densité post-synaptique. Mes travaux démontrent une organisation clusterisée des récepteurs AMPA et NMDA à la post-synapse, et une distribution homogène des mGluR5 à leur périphérie. Les nanodomaines des AMPARs et des NMDARs ne sont pas co-localisés mais co-organisés, avec une tendance pour les NMDARs à occuper une place centrale dans la post-synapse. Les propriétés individuelles d’organisation des récepteurs AMPA ne sont pas affectées par une variation d’expression de la protéine Shank3, alors que les NMDARs et les mGluR5 voient leurs pools synaptiques affectés dans ce modèle de troubles du spectre autistique. Ces résultats apportent de nouveaux éléments de compréhension des bases moléculaires de la transmission synaptique glutamatergique en conditions physiologique et pathologique, et proposent une nouvelle vision de l’utilisation du glutamate par les synapses. / AMPA, NMDA and mGluR5 receptors are responsible of the majority of excitatory currents in glutamatergic synaptic transmission. Controlling the organization and the mobility of these receptors in the synapse, via a combination of lateral diffusion and endo/exocytosis, is essential for the regulation of synaptic transmission intensity. The proteins of the post-synaptic density, such as Homer, Shank and GKAP, regulate the diffusion of these receptors and control their number and organization at the post-synapse. My PhD work consisted of studying the nanoscale organization of AMPA, NMDA and mGluR5 receptors at the post-synapse. As a first step, thanks to the development of different methodological tools, I characterized the organization and dynamic properties of glutamatergic receptors, together with their co-organization within the post-synapse. As a second step, I explored the impact of structural modification of the post-synaptic density on the nano-organization of these receptors. The use of a model of autism spectrum disorder, based on a variation of the scaffold protein Shank3, enabled the study of functional disorganization of glutamate receptors induced by a structural disturbance of the post-synaptic density. This work shows a clustered organization of AMPA and NMDA receptors at the post-synapse, and a homogenous distribution of mGluR5 at their periphery. The AMPARs and NMDARs nanodomains are not co-localized but co-organized, with a tendency for the NMDARs to occupy a central place at the post-synapse. The individual organizational properties of AMPA receptors are not affected by the variation of Shank3 expression, whereas NMDARs and mGluR5 see their synaptic pool affected in this model of autism spectrum disorder. These results provide new evidence on the molecular bases of glutamatergic synaptic transmission in physiological and pathological conditions and propose a new vision of the use of glutamate by synapses.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Heidelberg, Univ., Diss., 2007. / Online publiziert: 2008.

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative associée à une perte progressive des fonctions mnésiques et cognitives, qui font suite à des dysfonctions synaptiques. Ces dysfonctions sont en partie dues à la présence d’oligomères solubles du peptide amyloïde β (Aβo). Chez l’homme ces oligomères sont déjà présents durant la phase asymptomatique de la maladie et semblent expliquer la perte synaptique et les dysfonctions caractéristiques de la maladie. Cependant, les mécanismes clés qui initient ce dysfonctionnement et cette perte synaptique restent inconnus. Il est actuellement admis que la synapse compte un 3ème partenaire qui joue un rôle majeur dans l'intégrité structurale et fonctionnelle de la synapse, l’astrocyte. Grâce à leurs prolongements, les astrocytes peuvent enrober la plupart des synapses et contribuer activement aux changements morphologiques et fonctionnels observés durant l'activité synaptique. Cependant leur implication a été peu étudiée dans le contexte de la maladie d'Alzheimer.Le but de ces travaux de thèse, était d’étudier de quelle manière Aβo modifie l’activité calcique astrocytaire et quelles peuvent en être les répercussions sur l’activité synaptique. Ainsi, nous avons mis en évidence sur tranche aigue d’hippocampes de souris, une hyperactivité calcique généralisée, au sein du réseau astrocytaire et au niveau des prolongements fins astrocytaires. Cette hyperactivité s’est révélée être dépendante d’un canal membranaire récemment identifié au niveau astrocytaire, le canal TRPA1. Cette hyperactivité calcique dépendante de TRPA1, se manifeste également très précocement, avant l’apparition de plaques amyloïdes, dans un modèle de souris transgénique pour la maladie d’Alzheimer. Au niveau neuronal, nous avons observé une augmentation de la transmission synaptique basale en présence d’Aβo. De manière intéressante, l’inhibition pharmacologique de TRPA1 permet de bloquer l’hyperactivité calcique induite par Aβo et de rétablir l’activité synaptique précédemment perturbée par l’Aβo. Dans leur ensemble, nos résultats suggèrent que les astrocytes soient une cible privilégiée d’Aβo lors des phases asymptomatiques de la maladie d’Alzheimer, et que le blocage de l’hyperactivité calcique astrocytaire puisse garantir l’intégrité synaptique en présence d’Aβo. / Alzheimer’s disease is a neurodegenerative disorder associated with a progressive loss of cognitive functions following synaptic dysfunctions. These synaptic alterations are mainly due to oligomeric forms of amyloid β peptide (Aβo). In humans, these oligomers are already present during the silent phase of the disease and seem to explain synaptic loss and synaptic dysfunctions. However, key mechanisms that initiate synaptic loss and synaptic dysfunctions remain unknown. It is now well established that there is a third component of the synapse, playing major role in morphological and functional synaptic integrity, the astrocyte. Thanks to their processes, astrocytes can enwrap most of synapses and actively participate to morphological and functional changes observed during synaptic activity. Still, their involvement in Alzheimer’s disease is under-investigated.The aim of these thesis works, was to evaluate how Aβo modify astrocytic calcium activity and what could be the repercussions on synaptic activity. We have observed on mice hippocampal acute brain slices a global calcic hyperactivity, within the astrocytic network and inside fine processes. This hyperactivity was dependent on a recently identified astrocytic channel, the TRPA1 channel. This TRPA1-dependent calcic hyperactivity shows up also very early, before amyloid plaques formation, in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. On the neuronal side, glutamatergic synaptic transmission was increased by Aβo. Interestingly, pharmacological inhibition of TRPA1 could block astrocytic calcium hyperactivity and restore glutamatergic synaptic activity previously disturbed by Aβo. Overall, our data suggests that the astrocyte is a frontline target of Aβo during the prodromal phase of Alzheimer’s disease, and that blockade of astrocytic calcium hyperactivity could preserve synaptic integrity even when Aβo is applied.

Les astrocytes périsynaptiques participent activement, au côté des neurones, dans le traitement de l’information cérébrale. Une propriété essentielle des astrocytes est d’exprimer un niveau élevé de protéines appelées connexines (Cxs), et formant les sous-unités des jonctions communicantes. Étonnamment, bien qu’il ait été suggéré très tôt que la Cx30 astrocytaire soit impliquée dans des processus cognitifs, son rôle exact dans la neurophysiologie demeure cependant encore mal connu. Nous avons récemment révélé que la Cx30, via une fonction non-canal inédite, contrôle la force et la plasticité de la transmission synaptique glutamatergique de l’hippocampe en régulant les niveaux synaptiques de glutamate par le biais du transport astrocytaire du glutamate. Cependant, les mécanismes moléculaire et cellulaire impliqués dans ce contrôle, ainsi que sa régulation dynamique par l’activité neuronale et son impact in vivo dans un contexte physiologique restaient inconnus. Dans le cadre de cette problématique, j’ai démontré durant ma thèse que: 1) La Cx30 induit la maturation morphologique des astrocytes de l’hippocampe par l’intermédiaire de la modulation d’une voie de signalisation dépendante de la laminine et régulant la polarisation cellulaire ; 2) l’expression de la Cx30, sa localisation perisynaptique, ainsi que ses fonctions sont modulées par l’activité neuronale ; 3) Le contrôle de la couverture astrocytaire des synapses du noyau supraoptique de l’hypothalamus par la Cx30 fixe les niveaux plasmatiques de base de la neurohormone ocytocine et ainsi favorise la mise en place de comportements sociaux adaptés. Dans l’ensemble, ces résultats éclairent les régulations des Cxs astrocytaires par l’activité neuronale et leur rôle dans le développement postnatal des réseaux neurogliaux, ainsi que dans le contrôle des interactions structurelles astrocytes-synapses à l’origine de processus comportementaux. / Perisynaptic astrocytes are active partners of neurons in cerebral information processing. A key property of astrocytes is to express high levels of the gap junction forming proteins, the connexins (Cxs). Strikingly, astroglial Cx30 was suggested early on to be involved in cognitive processes; however, its specific role in neurophysiology has yet been unexplored. We recently reveal that Cx30, through an unconventional non-channel function, controls hippocampal glutamatergic synaptic strength and plasticity by directly setting synaptic glutamate levels through astroglial glutamate clearance. Yet the cellular and molecular mechanisms involved in such control, its dynamic regulation by activity and its impact in vivo in a physiological context were unknown. To answer these questions, I demonstrated during my PhD that: 1) Cx30 drives the morphological maturation of hippocampal astrocytes via the modulation of a laminin signaling pathway regulating cell polarization; 2) Cx30 expression, perisynaptic localization and functions are modulated by neuronal activity; 3) Cx30-mediated control of astrocyte synapse coverage in the supraoptic nucleus of the hypothalamus sets basal plasmatic level of the neurohormone oxytocin and hence promotes appropriate oxytocin-based social abilities. Taken together, these data shed new light on astroglial Cxs activity-dependent regulations and roles in the postnatal development of neuroglial networks, as well as in astrocyte-synapse structural interactions mediating behavioral processes.

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In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo. / Thema dieser Arbeit war die elektrophysiologische Untersuchung synaptischer Transmission, untersucht an einer Modellsynapse in Invertebraten, der neuromuskulären Synapse von Drosophila- Larven des dritten Larvalstadiums. Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde die synaptische Funktion an der neuromuskulären Synapse von Nullmutanten für verschiedene synaptische Proteine charakterisiert (das synapse associated protein of 47 kDa (Sap-47156), Synapsin (Syn97), eine bis dahin uncharakterisierte Drosophila SR-Proteinkinase (SRPK3), und eine Mutante mit einem starken neurodegenerativen Phänotyp (Loe)). Intrazelluläre Ableitungen wurden von Muskel 6 und 7 des Hautmuskelschlauches durchgeführt, um die Amplitude und Frequenz der spontanen Freisetzung von Neurotransmitter aus einzelnen synaptischen Vesikeln (miniature excitatory junction potentials oder mEJPs) zu messen. Außerdem wurden Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) bei verschiedenen Frequenzen und verschiedenen Kalziumkonzentrationen gemessen, um zu erforschen, ob die synaptische Transmission in den genannten Mutanten verändert ist. Zusätzlich wurde die Struktur und die Morphology der präsynaptischen Boutons immunhistochemisch untersucht. Dabei wurden monoklonal Antikörper gegen verschiedene Proteine der synaptischen Vesikel (SAP-47, CSP und Synapsin) und gegen das Aktive Zone Protein Bruchpilot benutzt. Die synaptische Physiologie war in den genannten Nullmutanten für synaptische Proteine nicht verändert, im Vergleich zu den wildtypischen Kontrollen, während Löchrig-Mutanten Defekte der synaptischen Übertragung zeigten, die im Einklang standen mit einem Defekt des Recyclings synaptischer Vesikel. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die elektrophysiologische Charakterisierung von heterolog exprimierten Licht-aktivierbaren Proteinen an der neuromuskulären Synapse von Drosophila. Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein Licht gesteuerter Ionenkanal und eine Licht-aktivierbare Adenylatcyclase (PAC) wurden mit Hilfe des UAS-Gal4-Systems an der larvalen, neuromuskulären Synapse exprimiert. Wenn ChR2-exprimierende Larven mit kurzen (100ms) Lichtpulsen beleuchtet wurden, konnten einzelne EJPs von den Muskeln 15, 16 und 17 abgeleitet werden. Längere Lichtpulse (10 Sekunden) führten zu einer Serie von EJPs mit einer Frequenz von ca. 25 Hz. Larven, die PAC exprimierten zeigten, in Präparationen in denen die Motoneurone vom Ventralganglion gelöst wurden, nach einminütiger Belichtung mit Blaulicht einen signifikanten Anstieg der mEJP-Frequenz. Auch die EJPs waren in einer Umgebung mit geringer Kalziumkonzentration (0,2 mM) signifikant erhöht, wenn PAC durch Blaulicht stimuliert wurde. Wurden die Motoneurone intakt gelassen, führte die Stimulation der PAC durch Blaulicht zu EJPs in den Muskeln 6 und 7, die im Einklang standen mit RP3 Motoneuronaktivität. Beide Proteine (ChR2 und PAC) erwiesen sich daher als nützliche, zuverlässige Werkzeuge, um die neurale Aktivität in vivo zu manipulieren.