Les Connexines (Cx) et les jonctions gap, permettant la communication directe de cellule -àcellule, sont impliquées dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Le rôle de la Cx32 sur la croissance normale et tumorale de la thyroïde a été étudié chez des souris surexprimant la Cx32 dans la thyroïde (Cx32-T+) ou n’exprimant pas la Cx32 (Cx32- KO). A l’état basal, les souris Cx32-T+ présentent une hypotrophie de la thyroïde. Après activation par la TSH, les souris Cx32-KO développent un goitre plus important que les souris sauvages. Des souris exprimant les oncogènes RET/PTC3 ou E7 dans la thyroïde ont été croisées avec des souris Cx32-KO. L’hypertrophie induite par RET/PTC3 ou E7 et la formation de tumeurs malignes en réponse à RET/PTC3 sont réduites chez les souris déficientes en Cx32. En conclusion, la Cx32 agirait comme régulateur a) négatif de la croissance de la thyroïde activée via la cascade AMPc, et b) positif du développement tumoral induit par les oncogènes RET/PTC3 ou E7. / Connexins (Cx) and gap junctions, allowing direct cell-to-cell communication, are involved in the control of cell proliferation. The role of Cx32 on normal and tumoral growth of the thyroid has been studied in mice overexpressing Cx32 in the thyroid (Cx32-T+) or deleted for Cx32 (Cx32-KO). In basal conditions, Cx32-T+ mice present a thyroid hypertrophy. After activation by TSH, Cx32-KO mice develop a larger goiter than wild type mice. Mice expressing RET/PTC3 or E7 oncogenes in the thyroid have been crossed with Cx32-KO mice. Hypertrophy induced by RET/PTC or E7 and the formation of malignant tumors in response to RET/PTC3 are reduced in mice deleted for the Cx32. In conclusion, Cx32 would act like as a) a negative regulator on the thyroid growth activated through the cAMP cascade, and b) a positive regulator on the tumoral development induced by RET/PTC3 or E7 oncogenes.

Les astrocytes périsynaptiques participent activement, au côté des neurones, dans le traitement de l’information cérébrale. Une propriété essentielle des astrocytes est d’exprimer un niveau élevé de protéines appelées connexines (Cxs), et formant les sous-unités des jonctions communicantes. Étonnamment, bien qu’il ait été suggéré très tôt que la Cx30 astrocytaire soit impliquée dans des processus cognitifs, son rôle exact dans la neurophysiologie demeure cependant encore mal connu. Nous avons récemment révélé que la Cx30, via une fonction non-canal inédite, contrôle la force et la plasticité de la transmission synaptique glutamatergique de l’hippocampe en régulant les niveaux synaptiques de glutamate par le biais du transport astrocytaire du glutamate. Cependant, les mécanismes moléculaire et cellulaire impliqués dans ce contrôle, ainsi que sa régulation dynamique par l’activité neuronale et son impact in vivo dans un contexte physiologique restaient inconnus. Dans le cadre de cette problématique, j’ai démontré durant ma thèse que: 1) La Cx30 induit la maturation morphologique des astrocytes de l’hippocampe par l’intermédiaire de la modulation d’une voie de signalisation dépendante de la laminine et régulant la polarisation cellulaire ; 2) l’expression de la Cx30, sa localisation perisynaptique, ainsi que ses fonctions sont modulées par l’activité neuronale ; 3) Le contrôle de la couverture astrocytaire des synapses du noyau supraoptique de l’hypothalamus par la Cx30 fixe les niveaux plasmatiques de base de la neurohormone ocytocine et ainsi favorise la mise en place de comportements sociaux adaptés. Dans l’ensemble, ces résultats éclairent les régulations des Cxs astrocytaires par l’activité neuronale et leur rôle dans le développement postnatal des réseaux neurogliaux, ainsi que dans le contrôle des interactions structurelles astrocytes-synapses à l’origine de processus comportementaux. / Perisynaptic astrocytes are active partners of neurons in cerebral information processing. A key property of astrocytes is to express high levels of the gap junction forming proteins, the connexins (Cxs). Strikingly, astroglial Cx30 was suggested early on to be involved in cognitive processes; however, its specific role in neurophysiology has yet been unexplored. We recently reveal that Cx30, through an unconventional non-channel function, controls hippocampal glutamatergic synaptic strength and plasticity by directly setting synaptic glutamate levels through astroglial glutamate clearance. Yet the cellular and molecular mechanisms involved in such control, its dynamic regulation by activity and its impact in vivo in a physiological context were unknown. To answer these questions, I demonstrated during my PhD that: 1) Cx30 drives the morphological maturation of hippocampal astrocytes via the modulation of a laminin signaling pathway regulating cell polarization; 2) Cx30 expression, perisynaptic localization and functions are modulated by neuronal activity; 3) Cx30-mediated control of astrocyte synapse coverage in the supraoptic nucleus of the hypothalamus sets basal plasmatic level of the neurohormone oxytocin and hence promotes appropriate oxytocin-based social abilities. Taken together, these data shed new light on astroglial Cxs activity-dependent regulations and roles in the postnatal development of neuroglial networks, as well as in astrocyte-synapse structural interactions mediating behavioral processes.

Les douleurs neuropathiques, caractérisées par une prévalence élevée, résultent de la compression ou lésion de nerfs. Les antidépresseurs figurent parmi les traitements de première intention de cette pathologie, toutefois des besoins médicaux restent insatisfaits par ces molécules. Mon travail de thèse s'est intéressé à la connexine 43 (Cx43) astrocytaire impliquée dans le mécanisme d'action des antidépresseurs ainsi que dans les douleurs neuropathiques. La première partie des travaux, réalisée avec des cultures d'astrocytes corticaux de souris, a permis de préciser le lien entre les antidépresseurs et la Cx43 astrocytaire. Alors que son expression s'est avérée inchangée dans notre modèle, un effet hétérogène des antidépresseurs a été observé sur le couplage intercellulaire des astrocytes. L'ensemble des molécules testées a conduit à l'inhibition de l'ouverture des hémicanaux de Cx43 étudiée dans un contexte inflammatoire, notre étude est la première à rapporter cet effet. De plus, les antidépresseurs prescrits dans les douleurs neuropathiques ont induit l'inhibition du couplage et/ou des hémicanaux. La seconde partie de mes travaux a porté sur la combinaison entre l'amitriptyline et la méfloquine. Ceci repose sur les approches combinatoires proposées par Theranexus, start-up avec qui la thèse a été réalisée. Les deux molécules ont présenté une synergie d'effet sur la réduction du couplage astrocytaire in vitro corrélée a une potentialisation de l'action anti-hyperalgésique de l'amitriptyline in vivo, chez le rat lésé au niveau du nerf sciatique. Ces résultats valident l'implication de la Cx43 astrocytaire dans la réponse antinociceptive des antidépresseurs. / Neuropathic pain, characterised by a marked prevalence, is the consequence of nerve compression or lesion. Antidepressants represent the main treatments of this disease, however, medical needs remain mostly unsatisfied by these molecules. In order to improve this therapeutical approach, my thesis work has focussed on astroglial connexin 43 (Cx43) that has recently been involved in the mechanism of action of antidepressant as well as in neuropathic pain. The first part of my work, performed in primary cultures of mouse cortical astrocytes, has allowed to reinforce the link between antidepressants and Cx43 in astrocytes. Whereas its expression was unchanged in our model, an heterogeneous effect of antidepressants was observed on the intercellular communication of astrocytes. Furthermore, all tested molecules led to the inhibition of Cx43 hemichannel activity in an inflammatory context, our study is the first to report such effect. Interestingly, antidepressants prescribed in neuropathic pain induced inhibition of coupling and/or hemichannels. The second part of my work concerned the combination between amitriptyline and mefloquine. This is based on combinatorial approaches proposed by Theranexus, a start-up partner in this project. The association of the two molecules presented a synergy on astroglial coupling reduction in vitro correlated to a potentiation of the anti-hyperalgesic effect of amitriptyline in vivo, in rats with injured sciatic nerve. These results confirm the implication of the astroglial Cx43 in the antinociceptive response to antidepressants.

Le récepteur atypique ACKR3 et le récepteur CXCR4 sont des récepteurs couplés aux protéines G appartenant à la famille des récepteurs CXC des chimiokines. Ces deux récepteurs sont activés par la chimiokine CXCL12 et sont surexprimés dans de nombreux cancers comme les gliomes, dont ils favorisent la prolifération et le caractère invasif. Le récepteur CXCR4 active des voies de signalisation qui dépendent de la protéine Gi et des β-arrestines et s’associe à plusieurs protéines impliquées dans la transduction du signal, le trafic et la localisation cellulaire du récepteur. Par contre, les mécanismes de signalisation impliqués dans les effets d’ACKR3 restent mal connus. Le récepteur déclenche une signalisation dépendant des β-arrestines, mais son couplage aux protéines G dépend du type cellulaire ou se fait par un mécanisme indirect via son association au récepteur CXCR4. Le récepteur ACKR3 s’associe également au récepteur de l’EGF pour induire la prolifération cellulaire par un mécanisme indépendant de sa stimulation par un agoniste. Ces données illustrent l’intérêt de caractériser de façon systématique l’interactome de ces récepteurs pour comprendre leurs rôles physiologiques et pathologiques. Cette thèse a poursuivi cet objectif grâce à la mise en œuvre d’une approche protéomique combinant la purification des partenaires des deux récepteurs par affinité suivie de leur identification par spectrométrie de masse. J’ai ainsi identifié respectivement 19 et 151 partenaires protéiques potentiels des récepteurs CXCR4 et ACKR3 exprimés dans les cellules HEK-293T. Parmi les protéines recrutées par ACKR3, nous nous sommes focalisés sur la connexine 43 (Cx43, une des protéines constituant les jonctions Gap) du fait de la similitude des effets du récepteur et de la Cx43 dans la pénétration des leucocytes dans le parenchyme cérébral, la migration des interneurones et la progression des gliomes. J’ai confirmé par Western blot et par BRET l’association spécifique de la Cx43 à l’ACKR3 et non pas au CXCR4. De la même façon, j’ai montré une co-localisation de la Cx43 et de l’ACKR3 dans des cellules de gliome humain, ainsi que dans les astrocytes de la zone sous-ventriculaire et les pieds astrocytaires entourant les capillaires cérébraux chez la souris, suggérant que les deux protéines forment un complexe protéique dans un contexte biologique authentique. Des études fonctionnelles ont révélé que l’ACKR3 module les fonctions de la Cx43 par différents mécanismes. L’expression de l’ACKR3 dans les cellules HEK-293T (mimant la surexpression du récepteur dans les tumeurs), induit par elle-même une inhibition de l’activité jonctionnelle de la Cx43. De même, la stimulation du récepteur par un agoniste réduit l’activité jonctionnelle de la Cx43 par un mécanisme impliquant l’activation d’une protéine Gi, la β-arrestine2 et l’internalisation de la Cx43. Cette thèse établit donc pour la première fois un lien fonctionnel entre le système constitué par les chimiokines CXCL11, CXCL12 et leur récepteur ACKR3 d’une part et les jonctions Gap d’autre part qui pourrait jouer un rôle critique dans la progression des gliomes. / The Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) and CXCR4 are two G protein-coupled receptors (GPCR) belonging to the CXC chemokine receptor family. Both receptors are activated upon CXCL12 binding and are over-expressed in various tumours, including glioma, where they have been found to promote proliferation and invasive behaviours. Upon CXCL12 binding, CXCR4 activates canonical GPCR signalling pathways involving Gαi protein and β-arrestins. In addition, CXCR4 was found to interact with several proteins able to modify its signalling, trafficking and localization. In contrast, the cellular pathways underlying ACKR3-dependent effects remain poorly characterized. Several reports show that ACKR3 engages β-arrestin-dependent signalling pathways, but its coupling to G proteins is restricted to either specific cellular populations, including astrocytes, or occurs indirectly via its interaction with CXCR4. ACKR3 also associates with the epidermal growth factor receptor to promote proliferation of tumour cells in an agonist-independent manner. These examples suggest that the extensive characterization of ACKR3 and CXCR4 interactomes might be a key step in understanding or clarifying their roles in physiological and pathological contexts. This thesis addressed this issue employing an affinity purification coupled to high-resolution mass spectrometry proteomic strategy that identified 19 and 151 potential protein partners of CXCR4 and ACKR3 transiently expressed in HEK-293T cells, respectively. Amongst ACKR3 interacting proteins identified, we paid particular attention on the gap junction protein Connexin-43 (Cx43), in line with its overlapping roles with the receptor in the control of leukocyte entry into the brain, interneuron migration and glioma progression. Western blotting and BRET confirmed the specific association of Cx43 with ACKR3 compared to CXCR4. Likewise, Cx43 is co-localized with ACKR3 but not CXCR4 in glioma initiating cell lines, and ACKR3 and Cx43 are co-expressed in astrocytes of the sub-ventricular zone and surrounding blood vessels in adult mouse brain, suggesting that both proteins form a complex in authentic cell or tissue contexts. Further functional studies showed that ACKR3 influences Cx43 trafficking and functionality at multiple levels. Transient expression of ACKR3 in HEK-293T cells to mimic ACKR3 overexpression detected in several cancer types, induces Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) inhibition in an agonist-independent manner. In addition, agonist stimulation of endogenously expressed ACKR3 in primary cultured astrocytes inhibits Cx43-mediated GJIC through a mechanism that requires activation of Gαi protein, and dynamin- and β-arrestin2-dependent Cx43 internalisation. Therefore, this thesis work provides the first functional link between the CXCL11/CXCL12/ACKR3 axis and gap junctions that might underlie their critical role in glioma progression.

Une propriété des astrocytes réside dans leur organisation en réseaux grâce à la présence de jonctions communicantes (CJ) composées par les connexines (Cxs) 43 et 30. A partir de l’observation indiquant que les ARN messagers codant pour la Cx30, mais pas ceux pour la Cx43, sont augmentés suite à une privation de sommeil (PDS), l’objectif de ma thèse a été de déterminer si et comment la Cx30 est impliquée dans la régulation du cycle veille-sommeil. D'abord, mon travail a consisté à analyser les effets de molécules qui perturbent veille-sommeil sur CJ astrocytaire étudiée dans des tranches aigues de cortex de souris. J’ai observé que le modafinil, un psychostimulant, augmentent la CJ. Par contre le GHB (acide γ-Hydroxybutyric), un agent qui induit le sommeil, et deux anesthésiques généraux, le propofol et la kétamine, ont des effets opposés. Ces résultats suggèrent que les réseaux astrocytaires sont régulés de manière différentielle par des drogues qui perturbent veille-sommeil. Et ensuite, ma thèse a consisté à étudier le rôle de la Cx30 en utilisant des souris dont le gène codant pour cette Cx a été invalidé (Cx30 KO). Les Cx30 KOs présentent un déficit dans le maintien de l’éveil lors d’épisodes de forte pression de sommeil: Cx30 KO présentent une augmentation du sommeil à ondes lentes pendant une PDS et elles requièrent un plus grand nombre de stimuli pour rester éveillée lors d’une PDS «douce». Afin d’identifier les causes de ce déficit nous avons observé que: 1) le CJ est augmenté après une PDS et cette augmentation ne s’observe que lorsque la Cx30 est présente 2) le niveau d’expression des ARN messagers de 7 gènes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébral est diminué dans plusieurs régions du cerveau chez Cx30 KO. En résumé, ces résultats suggèrent que la Cx30 joue un rôle important dans la régulation du veille-sommeil, probablement en contribuant à la fonction métabolique des astrocytes, ceci afin de répondre à une demande énergétique accrue lors de situations de forte pression de sommeil. / Astrocytes are organized in networks via gap junction channels constituted by connexin (Cx) 30 and Cx43. Since we observed that the mRNA expression of Cx30, but not Cx43, was enhanced after sleep deprivations (SD) in the mouse cortex and hippocampus, the goal of my thesis was to investigate whether and how Cx30 is involved in sleep homeostasis. First, I investigated the effects of sleep/wake-affecting molecules on gap junctional communication (GJC) of astrocytes in acute slices of the mouse cortex. We found that modafinil, a wakefulness-promoting drug, enhanced astroglial GJC, whereas γ-Hydroxybutyric acid (GHB), a sleep-promoting agent, and two general anesthetics, propofol and ketamine, decreased GJC, suggesting that astroglial networks are bidirectionally regulated by sleep/wake-affecting drugs. Then I addressed the role of Cx30 using Cx30 knockout (KO) mice. Compared to wild type (WT) mice, Cx30 KO exhibited a deficit in maintaining wakefulness during periods of high sleep pressure: they needed more stimuli to be maintained awake during gentle SD and they exhibited an increase in slow wave sleep during instrumental SD. To probe the possible causes of the phenotype, we found that: 1) astroglial GJC was enhanced in WT mice after SD, and such enhancement depended on both neuronal activity and the presence of Cx30; 2) mRNA levels of several genes involved in brain energy metabolism were decreased in multiple brain structures of the Cx30 KO. In summary, these results suggest that astroglial Cx30 plays an important role in sleep homeostasis, possibly by enhancing astroglial metabolic functions to fulfil the high energy demand during periods of elevated sleep pressure.

Le système de conduction ventriculaire (SCV) est responsable de la propagation rapide de l’activité électrique dans le cœur. Il est composé du faisceau de His, des branches droite et gauche, et des fibres de Purkinje. 1) Le développement du SCV a été étudié par l’utilisation de souris transgéniques exprimant la recombinase Cre inductible, insérée par recombinaison homologue au locus du gène de la connexine-40 (Cx40). Ce gène code pour une protéine exprimée dans les trabécules ventriculaires et le SCV. La recombinaison est observée uniquement dans les cellules exprimant la Cx40 et leur descendance. Mes résultats révèlent une restriction progressive du destin des trabécules Cx40-positives en cardiomyocytes conducteurs. Les progéniteurs Cx40-positifs participent à la formation du myocarde contractile et du SCV de E10.5 à E14.5 ; alors qu’ils ne donnent que des cardiomyocytes conducteurs après E16.5. 2) L’analyse du SCV a été étudiée dans un modèle de malformation cardiaque congénitale. Le mutant Tbx1-/-, modèle du syndrome de DiGeorge humain, présente une communication inter-ventriculaire. Des défauts morphologiques du SCV sont détectés chez ces mutants : absence de branche droite et un faisceau de His moins compacté. Ceux-ci sont corrélés avec des défauts de conduction. Le phénotype observé ne résulte pas d’un défaut d’activation du programme génique à l’origine de l’établissement du SCV ; mais semble dû à la présence de la communication inter-ventriculaire qui empêcherait les cellules progénitrices du SCV de rejoindre le sommet du septum inter-ventriculaire. / The ventricular conduction system (VCS) is responsible for the rapid propagation of electrical activity in the heart. The VCS is composed of the His bundle, the left and right bundle branches, and the peripheral Purkinje fibers. 1) The development of the VCS has been studied by using transgenic mice expressing the inducible Cre recombinase, introduced by homologous recombination at the locus of gene of connexin-40 (Cx40). Cx40 encodes for a protein expressing in the ventricular trabeculae and the VCS. The recombination is observed in the cells expressing Cx40 and in their descendants. My results suggest a progressive restriction of the fate of Cx40-positive trabeculae in conductive cardiomyocytes. Cx40-positive progenitors give rise to the formation of the compact myocardium and of the VCS when they are induced between E10.5-E14.5; while they participate only in the cardiomyocytes of VCS after E16.5. 2) The analysis of the VCS has been studied in a model of congenital heart malformation. The mutant Tbx1-/-, model of the DiGeorge syndrome, present a ventricular septal defect. Morphological defects of the VCS are found in Tbx1-/- hearts: an absence of right bundle branch and a non-compacted His bundle; which are correlated with functional defect. The phenotype observed in these mutants does not result from a defect of the activation in the genetic program being at the origin of the establishment in the VCS, but seems to be explain by the presence of a large ventricular septal defect, because it could block the progression of the progenitors of the VCS along the crest of the inter-ventricular septum.

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux. / The nuclear receptor Nr5a2 is expressed in the ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Conditional disruption of Nr5a2 in granulosa cells beginning with primary follicles by means of Nr5a2-floxed and Amhr2-Cre mice (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) results in failure in cumulus expansion, ovulation and luteinization. We hypothesize that Nr5a2 regulates intercellular connections in ovarian follicles through connexin 43 (Cx43), a gap-junctional protein related to cumulus expansion. The first objective of this study was to determine whether the lack of cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO mice is related to the absence of normal cell-to-cell communication in cumulus/granulosa cells of preovulatory follicles. To address this, immature ovaries of Amhr2Cre-cKO and non-transgenic littermates mice were collected (n=3) after superstimulation to induce follicle development and ovulation. Using RT-PCR, the Cx43 mRNA levels were shown to be downregulated prior to and at the time of the ovulatory stimulus (0 h and 2 h) in the Amhr2Cre-cKO group (P<0.01), which may lead to the failure in the acquisition of oocyte developmental competence. On the other hand, by the time of ovulation (12 h), mRNA levels of Cx43 are upregulated in Amhr2Cre-cKO group, which may prevent the cumulus cells to detach one from another. We conclude that Cx43 is one of the downstream genes under Nr5a2 control and its dysregulation can be one reason for the defect in cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO females. To examine the role of Nr5a2 in ovulation and luteinization in different stages of the follicle maturation, we hypothesized that Nr5a2 modulates the events leading to ovulation in a temporal sequence. By crossing Nr5a2-floxed and Cyp19-Cre mice (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), Nr5a2 was disrupted in granulosa cells of antral and preovulatory follicles. No litters were born to Cyp19Cre-cKO females (n=4) during a 6 months breeding trial. Cyp19Cre-cKO enabled the development of a luteal-like structure, and 1-year-old females presented hemorrhagic follicular cysts and hypertrophic ovarian surface epithelium. Both knockout models display lack of cumulus expansion and ovulation. We conclude that Nr5a2 differentially regulates folliculogenesis and ovulation in granulosa cells of small and antral follicles.

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux. / The nuclear receptor Nr5a2 is expressed in the ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Conditional disruption of Nr5a2 in granulosa cells beginning with primary follicles by means of Nr5a2-floxed and Amhr2-Cre mice (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) results in failure in cumulus expansion, ovulation and luteinization. We hypothesize that Nr5a2 regulates intercellular connections in ovarian follicles through connexin 43 (Cx43), a gap-junctional protein related to cumulus expansion. The first objective of this study was to determine whether the lack of cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO mice is related to the absence of normal cell-to-cell communication in cumulus/granulosa cells of preovulatory follicles. To address this, immature ovaries of Amhr2Cre-cKO and non-transgenic littermates mice were collected (n=3) after superstimulation to induce follicle development and ovulation. Using RT-PCR, the Cx43 mRNA levels were shown to be downregulated prior to and at the time of the ovulatory stimulus (0 h and 2 h) in the Amhr2Cre-cKO group (P<0.01), which may lead to the failure in the acquisition of oocyte developmental competence. On the other hand, by the time of ovulation (12 h), mRNA levels of Cx43 are upregulated in Amhr2Cre-cKO group, which may prevent the cumulus cells to detach one from another. We conclude that Cx43 is one of the downstream genes under Nr5a2 control and its dysregulation can be one reason for the defect in cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO females. To examine the role of Nr5a2 in ovulation and luteinization in different stages of the follicle maturation, we hypothesized that Nr5a2 modulates the events leading to ovulation in a temporal sequence. By crossing Nr5a2-floxed and Cyp19-Cre mice (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), Nr5a2 was disrupted in granulosa cells of antral and preovulatory follicles. No litters were born to Cyp19Cre-cKO females (n=4) during a 6 months breeding trial. Cyp19Cre-cKO enabled the development of a luteal-like structure, and 1-year-old females presented hemorrhagic follicular cysts and hypertrophic ovarian surface epithelium. Both knockout models display lack of cumulus expansion and ovulation. We conclude that Nr5a2 differentially regulates folliculogenesis and ovulation in granulosa cells of small and antral follicles.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La connexine 43 (Cx43) est l’unité protéique de base dans la formation des canaux des jonctions gap (JG) responsables des échanges intercellulaires. Toutefois, elle forme aussi des canaux non-jonctionnels à large conductance, nommés hémicanaux (Hc), qui fournissent un accès entre l’intérieure des cellules et le milieu extracellulaire. Bien qu’ils soient beaucoup moins étudiés que les JG, on estime que les Hc restent normalement à l’état fermé, et ce, grâce à la phosphorylation des connexines qui les forment. Suite à un stress ischémique, les Cx43 se déphosphorylent et entraînent ainsi l’ouverture des Hc de Cx43 (HcCx43), un effet qui compromet la survie des cellules. La protéine kinase C (PKC) est l’enzyme de phosphorylation qui possède le plus grand nombre de sites de phosphorylation sur la Cx43 en comparaison avec les autres kinases. Ses fonctions dépendent de la mise en jeu d’un répertoire d’au moins 12 isoformes distinctes. Dans les cardiomyocytes, les isoformes de PKC participent au développement des réponses adaptées ou mésadaptées au stress ischémique. Malgré que la régulation des canaux de Cx43 par la PKC lors d’une ischémie soit bien documentée, il n’existe pas à l’heure actuelle de connaissances sur les effets fonctionnels spécifiques qu’exercent des différentes isoformes de PKC sur les HcCx43, ni sur la valeur thérapeutique de la modulation de ses derniers. Dans ce contexte, nous avons proposé que les HcCx43 sont régulés sélectivement et différentiellement par les différentes isoformes de PKC et que l’inhibition spécifique de ces hémicanaux peut protéger le coeur lors d’un événement ischémique. Le présent travail comporte trois études qui ont été entreprises spécialement dans le but de valider ces hypothèses. Dans la première étude, nous avons profité de l’expertise du laboratoire du Dr Baroudi dans la dissection des isoformes de PKC pour étudier le rôle fonctionnel de chacune d’elles dans la régulation des HcCx43 en utilisant une gamme unique de peptides synthétiques inhibiteurs et activateurs spécifiques des isoformes de PKC, en combinaison avec la technique du patch-clamp. Nous avons démontré, entre autre, que les HcCx43 sont particulièrement inhibés par l’isoforme PKC epsilon, connue pour son effet cardioprotecteur contre les dommages ischémiques lors d’un préconditionnement ischémique. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’effet d’un peptide synthétique mimétique structural de la Cx43 sur la fonction des HcCx43. En plus d’avoir élucidé ces effets sur les propriétés fonctionnelles du canal, nous avons démontré d’une manière directe et indéniable que le peptide Gap26 inhibe et spécifiquement les HcCx43 et que son administration in vitro (cardiomyocytes isolés) et ex vivo (coeur intact) confère à ces modèles expérimentaux une résistance importante contre le stress ischémique. Dans la troisième étude, nous avons investigué pour la première fois in vivo le potentiel de deux peptides uniques mimétiques structuraux de la Cx43, Gap26 et Gap27, dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques lorsqu’ils sont administrés à basse dose sous forme d’un bolus intraveineux unique. Nous avons démontré que l’injection de ces peptides avant ou après la survenue de l’ischémie réduit significativement la taille de l’infarctus qui en résulte.En conclusion, l’ensemble de ces résultats révèlent le rôle bénéfique de l’inhibition des HcCx43 lors d’une ischémie et dévoilent un potentiel thérapeutique prometteux des mimétiques structuraux de Cx43 dans la prévention et le traitement de l’infarctus du myocarde. / Connexin 43 (Cx43) is the basic unit in the composition of Gap junction channels but also of the non-junctional unapposed hemichannels (Hc). Gap junction channels play key roles in cardiac function by allowing conduction of electrical impulses and exchange of biologically important molecules between cells. The unapposed Hc, however, perform functions different from those achieved by Gap junction channels mainly by providing pathways between the cytosol and the extracellular space allowing movement of ions and other small metabolites. Although they are much less studied than Gap junction channels, Hc are believed to remain normally in a closed state and that phosphorylation is an important factor promoting their closure. Under ischemic stress,the amount of non-phosphorylated Cx43 increases resulting in increasing hemichannels opening, an effect that can lead to irreversible tissue injury and cell death. Protein kinase C (PKC) possesses the largest number of phosphorylation sites on Cx43 and exerts significant control on Cx43 channels. Its function depends on the involvement of at least 12 distinct isoformes. Various PKC isoforms exert specific cellular and cardiovascular functions, nonetheless the functional role of PKC isoforms in the modulation of the unapposed Cx43 hemichannels has never been assessed, neither has the therapeutic potential of Cx43Hc modulation in the protection of ischemic heart. In this context, three studies have been performed, they form the body of this thesis. In the first study, a unique set of synthetic PKC isoform-selective activator and inhibitor peptides was utilised. In combination with the patch clamp technique, we have demonstrated that Cx43Hc conductance is strongly inhibited by, among many isoforms, epsilon PKC isoforme, known for its cardioprotective effect against ischemic injury. In the second study, we characterized the effect of a synthetic structural mimetic peptide of Cx43. Using patch clamp technique, we have demonstrated that the peptide Gap26 inhibits directly and specifically Cx43Hc, we also showed that Gap26 can confer resistance to cardiomyocytes (in vitro) and intact heart (ex vivo) against ischemia. In the third study, we investigated for the first time in vivo the capability of a unique pair of structural Cx43 mimetic peptides, Gap26 and Gap27, to protect heart from ischemic injury when administered in single low-dose intravenous boluses. We demonstrated that administration of either one or both peptides, before or after the onset of ischemia renders heart more resistant to ischemia and reduces significantly the size of myocardial infarct. Altogether, our results revealed salvatory effect of Cx43Hc inhibition during ischemia and uncovered therapeutique potentials of the synthetic structural mimetic peptides of Cx43 in ischemic heart disease.