A técnica do enxerto de granulação óssea tem demonstrado bons resultados na recuperação do periodonto e na melhora dos parâmetros clínicos dos dentes com comprometimento periodontal. Pouco se sabe porém, a respeito de qual tipo de tratamento de superfície radicular se faz mais condizente com o emprego dessa técnica. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a proliferação de células de granulação óssea sobre fragmentos radiculares com os seguintes tratamentos de superfície: Controle - somente raspagem, EDTA, terapia fotodinâmica (PDT- laser InGaAIP - 30mW, 30s, 45J/cm², 660nm + azul de toluidina), e ácido cítrico com tetraciclina. Todos os grupos teste receberam previamente tratamento com raspagem e alisamento com 20 golpes de cureta. Células de granulação óssea foram cultivadas em quadruplicata sobre os fragmentos por um período de 24, 48 e 72 horas. Após esse período de cultivo os fragmentos foram fixados para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Cinco campos por fragmento foram usados para a visualização e contagem de células aderidas a superfície radicular (centro, campo superior direito e esquerdo e campo inferior direito e esquerdo). A análise da calibração do examinador foi feita através de uma combinação de testes estatísticos como erro casual de Dahlberg, erro sistemático e correlação de Pearson (p<0,05). A análise da amostra foi realizada através do ANOVA de medidas repetidas complementado por Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados demostraram diferenças estatisticamente significantes, quanto ao numero de células, para as superfícies tratadas com terapia fotodinâmica no período de 72 h (p<0,05). Através de nossos resultados concluímos que o tratamento radicular com terapia fotodinâmica favorece a proliferação de células de granulação óssea humanas in vitro. / The osseous granulation graft has been demonstrating good results on the periodontal healing, resulting the improvement of clinical periodontal parameters. There are very few knowledge about what kind of dental surface would be more proper for the application of this technique. The aim of this study was to evaluate the proliferation of osseous granulation cells on human root fragments treated by different techniques as scaling and root planning (control), citric acid plus tetracycline, EDTA and photodynamic therapy (PDT InGaAIP, 45J/cm², 30mW, 30s, 660nm, toluidine blue O). All test groups were previously treated which 20 curette strikes. Osseous granulation cells was culture in quadruplicate on these fragments for 24h, 48h and 72h. After that, all fragments were fixed and prepared for analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). Aiming to counting the cells adhered on the roots, we obtained electron micrographs of 5 areas (center, upper right and left field, lower right and left field). The examiner calibration was analyzed by Dahlberg Casual Error measurement, systematic error test and Pearson correlation test (p<0.05). Statistical analysis was performed by ANOVA, followed by Tukey test, with a 5% level of significance (p<0.05). There were significant differences in cell number after 72h culture in favor of PDT group (p<0,05). We can conclude that the surface treatment of roots which PDT favor the proliferation of osseous granulation cells in vitro.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

Orientador: Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_KarinaSoares_M.pdf: 3290868 bytes, checksum: 62ac845d38c989b1515d635bf2bfa79b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Mosaico pigmentar tipo Ito é uma alteração cutânea frequente, caracterizada por hipopigmentação da pele que, na maioria dos casos, segue o padrão linhas de Blaschko, geralmente associada a anomalias extracutâneas, sobretudo anomalias do Sistema Nervoso Central (SNC). Sugere-se que esse padrão decorre da presença e migração de duas linhagens celulares no período embrionário, com diferente expressão de genes associados à pigmentação, que darão origem à epiderme e ao SNC no feto. Diversos tipos de mosaicismo foram associados ao quadro e acredita-se que os casos em que não houve tal detecção se devam à limitação das células analisadas. Devido à função, origem embrionária e migração celular, possivelmente o mosaicismo seria melhor identificado em melanócitos e queratinócitos, principalmente na presença de alterações no SNC, as alterações poderiam ter envolvimento com o prognóstico neurológico. Neste estudo foi realizada análise citogenética de linfócitos e fibroblastos de 15 indivíduos com mosaico pigmentar do tipo Ito. Os objetivos incluíram padronizar a cultura de células de melanócitos e queratinócitos, visando analisar o cariótipo desses indivíduos nesses tipos celulares. O estudo citogenético nesses tipos celulares, porém, não pode ser realizado devido à dificuldade de se obter metáfases adequadas para análise. Assim, foi desenvolvido protocolo de cultura e análise citogenética em queratinócitos, o qual funcionou adequadamente em indivíduos testes, porém sem resultado semelhante nos sujeitos de pesquisa. A preparação cromossômica a partir de melanócitos, por outro lado, não se mostrou adequada. Na análise de linfócitos e fibroblastos, foram encontradas alterações cromossômicas diferentes em quatro indivíduos (26% da casuística), presentes em ambos os tipos celulares. Não foram observadas divergências nas amostras a partir de pele hipo e normopigmentadas. Essas alterações incluíram um caso de t(X;21) regular, para o qual foram realizados estudos complementares de forma a aprimorar a investigação laboratorial, sendo análise por array-CGH, FISH e estudo de inativação de X. Um caso se tratou de trissomia 18 em mosaico, nesse indivíduo não foi possível a coleta de biópsia, porém foi realizado FISH interfásico em células da mucosa oral. Houve também um caso de r(22) em mosaico, o único que apresentou diferença na proporção de células alteradas em fibroblastos e linfócitos, possivelmente por maior instabilidade in vitro de cromossomos em anel em culturas de longa duração. O último caso alterado se refere a um cromossomo marcador, também em mosaico. Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura prévia. Assim, apenas um caso apresentou alteração cromossômica não em mosaico, representada por uma translocação X/autossomo regular, para a qual as técnicas de estudo utilizadas não detectaram justificativa para o padrão de mosaicismo observado clinicamente / Abstract: Pigmentary mosaicism of Ito type is a skin abnormality often characterized by hypopigmentation of the skin following, in most cases, the Blaschko lines, usually associated with extracutaneous abnormalities, especially abnormalities of the central nervous system (CNS). It is suggested that this pattern arises from the presence and migration of two cell lineages in the embryonic period, with different expression of genes associated with pigmentation, which will give rise to the epidermis and the CNS in the fetus. Several types of mosaicism have been associated with this disorder. In cases in which no mosaicismo was detected, it is believed that this may be secondary to the limitation of the cells analyzed. Due to the function and embryonic cell migration, in individuals with pigmentary mosaicism, a cytogenetic mosaicism possibly would be better identified in melanocytes and keratinocytes, especially in the presence of changes in the CNS. Besides, these changes could prognose the neurological outcome. This study comprehended cytogenetic analysis of lymphocytes and fibroblasts from 15 individuals with pigmentary mosaicism of Ito type. The targets included standardize the cell culture of melanocytes and keratinocytes in order to analyze the karyotype of these individuals in these cell types. The cytogenetic study in these cell types, however, was not possible due to difficulties in obtaining adequate metaphases for analysis. Given this difficulty, another cell type (fibroblasts) was studied. In the end, chromosomal abnormalities in lymphocytes and fibroblasts were identified in four individuals. These included one case of a balanced traslocation X/21, one case of trisomy 18 mosaicism, one case of a ring 22 mosaic and one marker chromosome, also in mosaic. Considering the results of cytogenetic lymphocytes and fibroblasts, additional studies were undertaken to enhance the laboratory investigation of these cases, including array-CGH, FISH and study of X inactivation. The results were compared with previous literature data. In conclusion, we developed protocol for culture and cytogenetic analysis in keratinocytes, which worked well on test subjects, but without similar results in study subjects. The chromosome preparation from melanocytes, however, was not adequate. There were no differences in samples from different area of skin. Only one case showed different proportion of cells altered in fibroblasts and lymphocytes, possibly due to instability of ring chromosomes in long duration cultures. Finally, only one case showed no chromosomal abnormality in mosaic, represented by a regular translocation X/autosome, for which the techniques used to study detected no explanation for the pattern of mosaicism observed clinically / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Um dos principais problemas em Periodontia refere-se à redução microbiana subgengival e tornar a superfície radicular biocompatível, a qual pode ser realizada por raspagem e alisamento radicular, tratamentos químicos, laser em alta intensidade ou terapia fotodinâmica. O objetivo dessa pesquisa foi de comparar os efeitos de raízes humanas tratadas por diferentes técnicas como terapia fotodinâmica, Er:YAG, Nd:YAG, raspagem e alisamento radicular e ácido cítrico + tetraciclina, na proliferação de fibroblastos gengivais (FGH) e células de granulação óssea (GO) humanos. Para tal, foram preparados 45 fragmentos radiculares de 25 dentes extraídos por razões periodontais e que foram divididos em 6 grupos: controle com células (CC), controle com fragmento raspado (CD), laser de Er:YAG (ER - 60mJ, 10pps, varredura, distância focal 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), laser de Nd:YAG (ND - 0,5W, contato, 15Hz, 10s, 1640nm), terapia fotodinâmica (PDT - laser de InGaAIP - 30mW, distância focal &#x2264;1mm, 45J/cm2, 30s, 660nm + azul de toluidina O), e ácido cítrico com tetraciclina (AC). As células foram cultivadas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino, 1% de solução antibiótica e 0,5% de anfotericina B. Foram plaqueadas 2 x 103 células, na sexta passagem, em placas de 96 poços. Após 24h o meio foi substituído por meio condicionado pelos fragmentos tratados, com exceção do grupo controle de células (CC), que recebeu meio convencional. A viabilidade celular foi medida através do teste do MTT nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. Os dados em forma de densidade óptica e porcentagem de crescimento foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA a três critérios complementado pelo teste de Tukey a um nível de significância de 5% (p<0,05). Não houve diferenças entre os grupos controle CC e CD (p>0,05). Para as células FGH em relação ao controle, houve maior estímulo após 48 e 72h no grupo PDT, após 72h no grupo ND, e após72 e 96h no grupo AC (p<0,05). Para as células GO, em relação ao controle, houve maior crescimento apenas no período de 72h para o grupo ND (p<0,05). Ao comparar os grupos experimentais e ambos os tipos celulares, após transformação em porcentagem de crescimento, houve diferença estatisticamente significante para o grupo ER nos períodos de 72 e 96h para as células FGH (p<0,05). Concluiu-se que todos os tratamentos, com exceção da raspagem e alisamento radicular, estimularam a proliferação de fibroblastos gengivais humanos e somente o tratamento com Nd:YAG estimulou a proliferação de células de granulação óssea humana. / One of the main problems in Periodontics is how to eliminate the subgingival bacteria and to convert the root surface in a biocompatible environment. These results can be achieved by scaling and root planning, chemical treatment, high energy lasers or photodynamic therapy. The aim of this study was to compare the effects of human root fragments treated by different techniques as photodynamic therapy, Er:YAG, Nd:YAG, scaling and root planning and citric acid plus tetracycline on proliferation of human gingival fibroblasts (HGF) and human osseous granulation cells (OG). Forty-five root fragments from 25 human teeth extracted by periodontal indication were divided in six groups: control with cells (CC), scaled fragment control (SC), Er:YAG laser (ER - 60mJ, 10pps, scanning, focal distance 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), Nd:YAG laser (ND 0.5W, contact, 15Hz, 10s, 1640nm), fhotodynamic therapy (PDT InGaAIP, 30mW, 45J/cm2,30s, 660nm, toluidine blue O), citric acid plus tetracycline (CA). The cells were grown in DMEM medium with 10% of bovine fetal serum, 1% of antibiotic solution and 0.5% amphotericin B. In 96-weIl plates 2 x 103 cells in the sixth passage were plated. After 24h the medium was replaced by medium conditioned by the treated fragments with exception of cell control group (CC) which received regular medium. Cell viability was measured by MTT test at 24, 48, 72 and 96h. Data was described in optic density and percentage of growth and was analyzed by ANOVA test complemented by Tukeys test at a significance level of 5% (p<0.05). There was no statistical differences between control groups CC and SC (p>0.05). For HGF cells in relation to control, there was a higher growth after 48h and 72h at PDT group, after 72h at ND group, after 72h and 96h at CA group (p<0.05). For OG cells in relation to control, there was a higher growth only at 72h-period at ND group (p<0.05). After transformation in percentage of growth and comparison among experimental groups and both cell types, there was a statistical significant difference at ER group at 72h and 96h-period (p<0.05). It was concluded that all treatments but scaling and root planning stimulated the proliferation of human gingival fibroblasts and only the Nd:YAG treatment stimulated the proliferation of human osseous granulation cells.

Orientadores: Albina Messias De Almeida Milani Altemani, Elizabeth Ferreira Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:06:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Montalli_VictorAngeloMartins_D.pdf: 4723030 bytes, checksum: 1764455ec3666d02c7e74ee7c326caed (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As lesões salivares tumorais compostas por dupla população celular (epitelial e mioepitelial) são consideradas originárias do ducto intercalado e estas lesões são subdivididas em diversas entidades que apresentam sobreposição morfológica, com delimitações entre elas nem sempre nítidas. Entre as neoplasias benignas estão o adenoma pleomórfico (AP) e o adenoma de células basais (ACB). Recentemente foi descrita uma nova entidade tumoral benigna, com composição epitelial e mioepitelial, denominada de lesão do ducto intercalado (LDI). Diante disso, o nosso primeiro objetivo foi analisar os perfis morfológicos e imuno-histoquímicos de LDIs e ACBs classificados em tubulares (ACB-T) e não tubulares (ACB-NT) para verificar se as LDIs e ACB-Ts representam entidades distintas. Ainda, dado o papel crítico da célula mioepitelial na morfogênese das lesões tumorais salivares histogeneticamente relacionadas ao ducto intercalado, nosso segundo objetivo foi avaliar in vitro a influência de fatores do microambiente tumoral (proteínas da matriz extracelular e fatores de crescimento) sobre a morfologia, viabilidade e proliferação de células mioepiteliais advindas de AP. Para a análise morfológica e imuno-histoquímica, foram estudados oito casos de LDIs, nove ACBs-T e 19 ACBs-NT. Todos os ACB-T continham áreas LDI-like, enquanto nos ACB-NT estas eram raras e escassas. As células luminais das LDIs e ACBs-T exibiram positividade para CK7, lisozima, S100 e DOG1. No grupo ACB-NT, poucas células luminais mostraram tal expressão, sendo principalmente positivas para CK14. As células mioepiteliais das LDIs, ACB-T e ACB-NT foram positivas para CK14, calponina, AML e p63, mas essas eram mais numerosas nos ACBs. No estudo in vitro, a morfologia e diferenciação das células mioepiteliais foram avaliadas qualitativamente por imunofluorescência indireta (expressão da vimentina e AML, respectivamente). As células mioepiteliais exibiram morfologia poliédrica em todas as matrizes, independentemente da suplementação do fator de crescimento. AML foi imunoexpressa de forma heterogênea nas células mioepiteliais, porém houve aumento da expressão desta proteína quando acrescentado o TGF- ?1, independentemente do tipo de matriz usada. TGF- ?1 também aumentou significantemente a viabilidade das células mioepiteliais cultivadas na matriz fibronectina. Conclusões: as LDI, ACB-T e ACB-NT formam um continuum de lesões onde as LDIs estão estreitamente relacionadas com o ACB-T, visto que em ambos o imunofenótipo das células luminais e mioepiteliais é semelhante àquele observado nos ductos intercalados. A principal diferença entre LDI e ACB-T é a quantidade de células mioepiteliais, que é maior no último. Além disso, nossos resultados indicam que pelo menos alguns ACBs podem surgir via LDI. Os estudos em cultura de células sugerem que as diferentes matrizes celulares não influenciam a morfologia e diferenciação da célula mioepitelial. Dentre os fatores de crescimento estudados apenas TGF- ?1 associou-se com aumento da expressão de AML (diferenciação celular) e aumentou significantemente a viabilidade celular associado à matriz fibronectina / Abstract: Salivary tumor lesions composed of dual cell population (epithelial and myoepithelial) are considered to originate from the intercalated duct. These lesions are subdivided into several entities that share morphological features. Among the benign tumors are pleomorphic adenomas (PA) and basal cell adenoma (BCA). Recently, a new entity was described that is a benign tumor with epithelial and myoepithelial composition, called intercalated duct lesion (IDL). Our first objective was to analyze the morphological and immunohistochemical profiles of IDLs and BCAs classified into tubular (T-BCA) and non-tubular subtypes (NT-BCA), to determine whether or not IDL and tubular BCA represent distinct entities. Also, given the critical role of myoepithelial cells in the morphogenesis of the salivary tumor lesions histogenetically related to the intercalated duct, our second objective was to evaluate in vitro the influence of tumor microenvironment factors (extracellular matrix proteins and growth factors) on the morphology, viability and proliferation of myoepithelial cells arisen from PA . Eight IDLs, nine tubular BCAs and 19 non-tubular BCAs were studied by immunohistochemical technique. All tubular BCAs contained IDL-like areas, which represented 20-70% of the tumor. In non-tubular BCA, IDL-like areas were occasional and small (<5%). One patient presented IDLs, tubular BCAs and IDL/tubular BCA combined lesions. Luminal ductal cells of IDLs and tubular BCAs exhibited positivity for CK7, lysozyme, S100 and DOG1. In the non-tubular BCA group, few luminal cells exhibited such immunoprofile; they were mainly CK14-positive. Basal/myoepithelial cells of IDLs, tubular BCAs and non-tubular BCAs were positive for CK14, calponin, ?-SMA and p63; they were more numerous in BCA lesions. The in vitro study analyzed morphology and differentiation of myoepithelial cells by vimentin and SMA expressions, respectively, which were qualitatively assessed using indirect immunofluorescence. Myoepithelial cells showed polyhedral morphology in all extra cellular matrixes regardless of the supplementation of growth factors. These cells expressed SMA heterogeneously but when TGF- ?1 was added such expression increased. This modification did not show relationship with the type of extracellular matix. The viability of myoepithelial cells cultured on fibronectin matrix increased significantly with addition of TGF - ?1. Conclusions: IDL, tubular BCA and non-tubular BCA form a continuum of lesions in which IDLs are related closely to tubular BCA. In both, the immunoprofile of luminal and myoepithelial cells recapitulates the normal intercalated duct. The difference between the adenoma-like subset of IDLs and tubular BCA rests mainly on the larger numbers of myoepithelial cells in the latter. Our findings indicate that at least some BCAs can arise via IDLs. The cell culture studies suggest that the different matrixes do not influence the morphology and differentiation of myoepithelial cells. Among the growth factors studied, only TGF - ?1 was associated with an increased expression of SMA (cell differentiation) and a significant increase of the cellular viability associated with the fibronectin matrix / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T14:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreoliRisso_MarilisaFerruda_M.pdf: 14754073 bytes, checksum: 6e3b6aa9d09a03a1f2873ad414c83bdf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Lesões cartilaginosas raramente curam-se espontaneamente. As atuais opções terapêuticas cirúrgicas e não são limitadas ao alívio dos sintomas, mando a necessidade de futura substituição total de joelho. Terapia baseada em células tronco adultas representa uma alternativa promissora para os procedimentos existentes. As células-tronco mesenquimais (MSC) apresentam alta plasticidade celular e podem ser obtidas de diversas fontes teciduais, opção que exige grande aporte celular expondo a necessidade de criopreservação, processo vantajoso. Contudo, protocolos convencionais estão diretamente associados a possíveis danos e mortalidade celular, sendo desencadeados por formação de cristais de gelo intracelular, toxicidade do crioprotetor adotado e desidratação celular. Este projeto tem como objetivo investigar a interferência da criopreservação com dimetilsufóxido (Me2SO-) (DMSO) na capacidade de MSCs em diferenciação em linhagens mesodermais e arranjo de fibras de colágeno produzidas na diferenciação condrogência. MSCs foram obtidas de tecido adiposo (ADSC). Em quarta passagem foram caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciadas em linhagem mesodermais. Diferenciação comprovada por análise morfológica e expressão gênica por de RT-PCR. Genes escolhidos ADIPOQ, FABP4 e PPARG linhagem adipogênica, AGCAN, SOX9, COL1A1 e COL2A1 linhagem condrogênica e OC, OPN e COL1A1 linhagem osteogênica. Diferenciação condrogênica realizada pela técnica de micromassa. Arquitetura das fibras colágenas observada por microscopia de Geração de Segundo Harmônico (SHG) de MSCs e images analisadas pelos algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) e Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM). ADSCs criopreservadas em taxa controlada de congelamente com solução criprotetora de soro fetal bovino e 10% de DMSO, mesmos ensaios realizados após descongelamento. Células descongeladas submetidas aos mesmos protocolos de caracterização. Características morfológicas obtidas por SHG expressão gênica das células frescas e criopreservadas analisadas estatisticamente. Amostras de ADSC, fresca e criopreservadas, foram capazes de se diferenciar em linhagens mesodermais. Perfil de expressão gênica da linhagem adipogênica foi semelhante ao esperado para tal processo de diferenciação, em ambas amostras, criopreservadas e frescas, estas últimas com maior expressão (p=ns). Na diferenciação para linhagem osteogênica também houve o perfil de expressão esperado para os genes estudas, sendo mais expresso no grupo criopreservado (p=ns). Apesar do fato da expressão do gene COL2A1 de linhagem condrogênica ter sido maior no grupo criopreservado, quando o perfil de expressão gênica do grupo fresco foi analisado, este mostrou-se mais consistente com o perfil esperado normal. Análise das imagens de SHG demonstraram que a arquitetura das fibras colágenas foi mais organizada (p=ns) e uniforme (p>0,0001) nas amostras frescas. O grupo criopreservado demonstrou maior entropia (p=ns) e contraste (p=0,0167), demonstrando haver maior tendência direcional das fibras de colágeno nas amostras frescas. Os resultados de expressão gênica sugerem que a criopreservação pode interferir de forma positiva na diferenciação osteogênica e negativamente nas linhagens adipogênica e condrogênica. A arquitetura da rede tridimensional de colágeno foi modulada negativamente pelo processo de criopreservação, dados esses confirmados por análise das imagens obtidas por SHG, o que poderia interferir com as propriedades físico/mecânicas características do tecido colagenoso, importante na manutenção da cartilagem articular baseada em terapia celular. O uso das imagens de SHG tornou-se uma importante ferramenta na melhor avaliação das fibras colágenas / Abstract: Cartilage defects rarely heal spontaneously. Current surgical and non-surgical therapeutic interventions are limited to symptom relief and future total knee replacement continues to be necessary. Adult stem cell based therapy could represent a promising alternative to this procedure. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have great capacity of differentiation and can easily be obtained from various sources. Cryopreservation offers many advantages for practitioners engaged in cell-based therapies. However, conventional slow freezing, despite using cryoprotectant solution, has always been associated with damage and mortality due to intracellular ice formation, cryoprotectant toxicity, and dehydration. The aim of this work is to investigate whether the Dimethyl Sulfoxide (Me2SO-) (DMSO) cryopreservation process interferes with the MSCs capacity of differentiation to mesodermal lineages and/or with collagen fiber network architecture, produced by chondrogenic cells, comparing fresh and thawed MSCs. MSCs were obtained from adipocyte tissue (ADSCs). At the fourth passage cells were characterized as ADSCs by flow cytometry analysis and differentiation to mesodermic lineages was confirmed by morphology (light optical microscopy) and gene expression analysis (RT-PCR). The following genes were chosen ADIPOQ, FABP4 and PPARG for adipogenic lineage, AGCAN, SOX9, COL2A1 and COL1A1 for chondrogenic and OC, OPN and COL1A1 for osteogenic lineage. Chondrogenic differentiation was carried out by micromass technique. Collagen fibers architecture was observed by Second Harmonic Generation (SHG) microscopy. Images were analyzed by Fast Fourier Transform (FFT) and Gray Level Cooccurrence Matrix (GLCM) algorithms. ADSCs were cryopreserved in a controlledrate freezing device with bovine serum fetal and 10% DMSO as cryoprotectant solution. Thawed cells were submitted to the same characterization protocols. SGH morphologic features and gene expression results from thawed and fresh cells were statistically analyzed. Both, thawed and fresh ADSCs were able to differentiate into mesodermal lineages. Gene expression profile of adipogenic lineage was similar to that expected for the differentiation process in both, thawed and fresh cells, with greater expression in fresh ones (p=ns). Osteogenic lineage also demonstrated the expected gene expression profile, being more expressed in the thawed group (p=ns). Despite the fact that COL2A1 gene expression in chondrogenic lineage was greater in the thawed group, when the gene expression profile was analyzed the fresh group was more consistent with the expected normal profile. SHG images results demonstrated that collagen fibers architecture was more organized (p=ns) and uniform (p<0, 0001) in fresh samples. The thawed group showed more entropy (p=ns) and contrast (p=0, 0167) demonstrating that a directional trend in the collagen fibers was only observed in the fresh group. Gene expression results suggested that cryopreservation could interfere in a positive manner with osteogenic differentiation, and negatively on adipogenic and chondrogenic lineages. Collagen network tridimensional architecture was negatively modulated by cryopreservation, confirmed by SHG analysis, which could interfere with the desirable collagen mechanical properties, important for the maintenance of articular cartilage in cell based therapy. SHG analysis has become an important tool for better evaluate collagen fibers / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T19:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_AnaPauladeLima_D.pdf: 1915868 bytes, checksum: d146b07dfcd99b2676c519233cddf2f2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Diabetes Mellitus tipo II (DMT2) é uma doença caracterizada pela diminuição da sensibilidade à insulina e consequente prejuízo na homeostasia glicêmica. Estudos recentes mostraram que a melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal, melhora a tolerância à glicose e a resistência à insulina, diminui a expressão de proteínas ligadas à gliconeogênese hepática (G6Pase e PEPCK) e reduz a apoptose de células beta pancreáticas in vivo. Entretanto, ainda não estava claro se a melatonina conseguia, de fato, reverter in situ as ações lipotóxicas dos ácidos graxos saturados em células beta pancreáticas e na musculatura esquelética, e se podia diminuir a expressão dos genes reguladores da gliconeogênese hepática. Para responder a esse questionamento, utilizamos culturas celulares de insulinoma (MIN6), de músculo esquelético (miotubos de L6) e de hepatoma (HepG2). Os resultados mostraram que a melatonina reverte a resistência à insulina gerada por palmitato em miotubos de L6, mas somente em passagens baixas, não diminui a apoptose em MIN6 e não altera a expressão do G6pc, o gene que codifica a G6Pase, em HepG2 / Abstract: Type II Diabetes Mellitus (T2DM) is characterized by decrease of insulin sensitivity, resulting impairment glucose homeostasis. Recent studies have shown that melatonin, a hormone produced by the pineal gland, improves glucose tolerance and insulin resistance, reduce the expression of hepatic gluconeogenesis proteins (G6Pase and PEPCK) and diminish pancreatic beta cell apoptosis in vivo. However, it was unclear if melatonin could reverse the lipotoxic actions of saturated fatty acid in pancreatic beta cells and skeletal muscle, and if melatonin could decrease the expression of regulatory genes of hepatic gluconeogenesis in situ. To answer this question, we used cell cultures of insulinoma (MIN6), skeletal muscle (L6 myotubes) and hepatoma (HepG2). The results showed that melatonin reverses palmitate insulin resistance in L6 myotubes, but only at low passages, melatonin does not decrease apoptosis in MIN6 and does not alter the expression of G6pc, the encoding gene of G6Pase, in culture cell of HepG2 / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Resumo: As células-tronco mesenquimais extraídas da medula óssea ou tecido adiposo são utilizadas em abordagens terapêuticas, em vista das suas propriedades anti-inflamatórias, imunomoduladoras e regenerativas. Estas células são consideradas uma nova alternativa para o tratamento de enfermidades em diversas espécies, incluindo as dos equinos. Dessa forma, com o intuito de investigar a possível utilização das células estromais de mini-horses em tratamentos de cavalos, nesse estudo foi realizada a colheita, isolamento, expansão, caracterização imunofenotípica e diferenciação em duas linhagens mesenquimais: osteogênica e adipogênica de células estromais de mini-horses (Equus ferus caballus), objetivando a formação de um banco celular. Foi ainda realizada a análise transcricional comparativa dessas células, com as células estromais oriundas de cavalos (Equus caballus), produzidas e caracterizadas nas mesmas condições. Os parâmetros analisados foram o perfil de genes relacionados à angiogênese, regulação negativa da proliferação de células T, regulação negativa da ativação de células T, proliferação negativa de linfócitos reguladores, regulação negativa da proliferação de células mononucleares, regulação negativa da adesão célula-célula de leucócitos, regulação negativa da proliferação de leucócitos, regulação negativa da adesão célula-leucócito, regulação negativa da ativação de linfócitos. Também foram pesquisados os principais genes up e down regulados comparando mini-horses aos cavalo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells extracted from bone marrow or adipose tissue are used in therapeutic approaches in view of their anti-inflammatory, immunomodulatory and regenerative properties. These cells are considered a new alternative for the treatment of diseases in several species. In order to investigate the possible use of mini-horses stromal cells in horse treatments, in this study was performed the collection, isolation, expansion, immunophenotypic characterization and differentiation in two mesenchymal lines were performed: osteogenic and adipogenic stromal cell mini-horses (Equus ferus caballus), aiming the formation of a cellular bank. We also performed the comparative transcriptional analysis of these cells, with stromal cells from horses (Equus caballus), produced and characterized under the same conditions. The parameters analyzed were the profile of genes related to angiogenesis, negative regulation of T cell proliferation, negative regulation of T cell activation, negative proliferation of regulatory lymphocytes, negative regulation of mononuclear cell proliferation, negative regulation of cell-cell adhesion leukocytes, negative regulation of leukocyte proliferation, negative regulation of cell-leukocyte adhesion, negative regulation of lymphocyte activation. We also searched the top 10 genes up and down regulated comparing mini-horses to horses. For cell bank formation tests were performed that demonstrated the characteristics of stromal cells in the cells obtained ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Mário Tanomaru Filho / Abstract: Tricalcium silicate cements associated with radiopacifiers are used as repair materials. Publication 1: Evaluation of tricalcium silicate-based cements (TCS) associated with zirconium oxide (ZrO2), calcium tungstate (CaWO4) or niobium oxide (Nb2O5) radiopacifiers compared to MTA Repair HP (MTA HP). Publication 2: Evaluation of tricalcium silicate-based cements (TCS) associated with zirconium oxide (ZrO2) radiopacifier with 10% or 20% of Biosilicate (TCS ZrO2 + 10% Biosilicate and TCS ZrO2 + 20% Biosilicate) compared to Biodentine. Setting Time (ST) and radiopacity were evaluated based on ISO 6876/2002 standard. Solubility was evaluated according to the method proposed by Carvalho-Júnior et al. (2007) modified. pH was measured at 3, 12 and 24 hours and 7, 14 and 21 days after immersion in distilled water. Cellular cytotoxicity and bioactivity were evaluated by methyltetrazolium (MTT), neutral red (NR), alkaline phosphatase (ALP), alizarin red (ARS) and real time PCR (qPCR) (Publication 1) assays in different periods of contact with eluates of the materials in Saos-2 cells. Antibacterial activity was evaluated by direct contact on Enterococcus faecalis in the planktonic form. For the physico-chemical and ARS tests, the data were submitted to ANOVA and Tukey tests; for MTT, NR and ALP tests the data were analyzed by the Two-Way ANOVA and Bonferroni tests; the antibacterial activity, were submitted to Kruskall-Wallis and Dunn tests (α = 0.05). Publication 1: TCS + CaWO4 presented... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Cimentos de silicato tricálcico com radiopacificadores são utilizados como materiais reparadores. Publicação 1: Avaliação de cimento à base de silicato tricálcico (STC) associado aos radiopacificadores óxido de zircônio (ZrO2), tungstato de cálcio (CaWO4) ou óxido de nióbio (Nb2O5) em comparação ao MTA Repair HP (MTA HP). Publicação 2: Avaliação de material à base de silicato tricálcico (STC) e radiopacificador óxido de zircônio (ZrO2) e 10% ou 20% de Biosilicato (STC ZrO2 + 10% de Biosilicato e STC ZrO2 + 20% de Biosilicato) em comparação ao Biodentine. Tempo de presa e a radiopacidade foram avaliados seguindo ISO 6876/2002. A solubilidade foi avaliada de acordo com o método proposto por Carvalho-Júnior et al. (2007) modificado. pH foi avaliado 3, 12 e 24 horas, 7, 14 e 21 dias após imersão em água destilada. A citotoxidade e bioatividade celular foram avaliadas pelos testes metiltetrazólio (MTT), vermelho neutro (VN), atividade de fosfatase alcalina (ALP), ensaio de vermelho de alizarina (ARS) e PCR em tempo real (qPCR) (Publicação1), em diferentes períodos de contato com eluídos dos materiais em células Saos-2. Atividade antimicrobiana dos materiais foi avaliada por meio do teste de contato direto com Enterococcus faecalis na forma planctônica. Para os testes físicoquímicos e ARS, os dados foram submetidos aos testes ANOVA e Tukey; para os ensaios do MTT, VN e ALP e qPCR os dados foram analisados aos testes Two Way ANOVA e Bonferroni; os dados da atividade antimicrobiana f... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre