Les extrémités des chromosomes contiennent des répétitions de séquences d’ADN appelées télomères qui empêchent l’activation inopportune de la réponse aux dommages de l'ADN afin de préserver l'intégrité génomique. Les télomères raccourcissent à chaque cycle de réplication d’ADN et la télomérase a pour fonction de contrebalancer cette érosion en allongeant les télomères. Les cellules somatiques n’expriment pas la télomérase, donc leur durée de vie est normalement limitée par ce raccourcissement progressif des télomères qui conduit à l'activation de la voie p53 entraînant un arrêt de la croissance cellulaire. En revanche, les cellules cancéreuses acquièrent l'immortalité cellulaire principalement en réactivant la télomérase ou en utilisant des méthodes alternatives d'allongement des télomères basées sur la recombinaison d’ADN. Auparavant, dans notre laboratoire, un criblage CRISPR à l'échelle du génome a été réalisé dans la lignée cellulaire pré-B NALM-6 traitée avec la molécule BIBR1532, un inhibiteur de la télomérase. Ces résultats suggéraient que cinq sous-unités du complexe de remodelage de la chromatine INO80, lorsque supprimées indépendamment, réduisaient la prolifération des cellules ayant un raccourcissement des télomères induit par le BIBR1532. Mon objectif était d'étudier cette interaction génétique afin de comprendre les processus biologiques impliqués dans cette létalité synthétique. Après l'élimination des gènes codant à la fois pour la sous-unité enzymatique de la télomérase humaine (hTERT) ainsi que les sous-unités spécifiques du complexe INO80 humain, nous avons constaté que les cellules double-négatives avaient une capacité proliférative réduite, ce qui démontre que l’interaction génétique mesurée par criblage CRISPR est bel et bien spécifique. Étant donné le rôle du facteur de transcription p53 dans la réponse cellulaire au raccourcissement télomérique, nous avons exploré l’importance de cette voie de signalisation pour l’interaction entre le complexe INO80 humain et la télomérase. Après l’activation de p53 avec un traitement avec la molécule nutlin-3a, les niveaux d'expression de plusieurs cibles de p53 tels que MDM2 et CDKN1A ont augmenté dans les cellules ayant une délétion du gène NFRKB, codant pour une sous-unité du complexe INO80 humain. Les cellules ayant une délétion du gène UCHL5, codant pour le partenaire d’interaction de NFRKB, ont également montré une augmentation de l’expression de MDM2 lorsque traitées avec nutlin-3a. Enfin, la perte de télomérase (hTERT) modifie les niveaux d'expression des composants de la 2 voie p53 CDKN1A, BAX et MDM2. En conclusion, la suppression des gènes codant pour des sous-unités du complexe INO80 telles que NFRKB ou UCHL5 est nuisible aux cellules ayant une délétion de la télomérase. Le complexe INO80 humain peut être impliqué dans l'inhibition de la voie p53, en réponse à l'activation de p53 soit par des télomères courts ou avec un traitement avec nutlin-3a. Des recherches plus approfondies sur cette interaction génétique pourraient mener au développement de nouvelles thérapies combinatoires afin d’inhiber la croissance des cellules cancéreuses. / The ends of chromosomes contain telomeric repeats that prevent the DNA damage response from being activated in order to preserve genomic integrity. Telomerase functions to alleviate incomplete DNA replication at telomeres, and to repair those telomeres damaged by various means including oxidative damage. The lifespan of telomerase negative somatic cells is normally restricted by gradual telomere shortening which can lead to the activation of the p53 pathway resulting in cellular growth arrest. Cancer cells often elongate their telomeres in order to acquire cellular immortality predominantly by reactivating telomerase or by using recombination-based, alternative telomere lengthening methods. Previously in our lab, a genome-wide CRISPR screen was conducted in the pre-B cell line NALM-6 treated with a small molecule inhibitor of telomerase, BIBR1532. These previous results suggested that five subunits of the INO80 chromatin-remodeling complex, when independently deleted, reduced cellular proliferation in cells with BIBR1532 induced telomere shortening. My goal was to investigate this genetic interaction in order to understand the biological processes implicated in this synthetic lethal relationship. After the knockout of the genes encoding both the enzymatic subunit of human telomerase (hTERT) and specific subunits of the human INO80 complex, I found that the proliferative capacity of NALM-6 cells was reduced. This result indicates the genetic interaction identified by CRISPR screening is in fact specific. In addition, after p53 stimulation with nutlin-3a treatment, expression levels of the p53 pathway component MDM2 were altered after the knockout of the genes encoding specific subunits of the human INO80 complex, NFRKB and UCHL5, individually. CDKN1A expression was also altered after nutlin-3a treatment and NFRKB knockout. Finally, the loss of telomerase (hTERT) alters the expression levels of the p53 pathway components CDKN1A, BAX and MDM2. In conclusion, the deletion of the genes encoding specific subunits of the INO80 complex, including NFRKB and UCHL5, is harmful to cells after hTERT knockout. The human INO80 complex may be involved in inhibiting the p53 pathway, in response to p53 activation by short telomeres or nutlin-3a treatment. Further investigation into this synthetic lethal relationship may shed light on new combinatorial therapeutics in cancer.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.