Les chromosomes linéaires se terminent par des régions particulières, les télomères, qui assurent l'intégrité et la stabilité du génome. Chez les eucaryotes, les télomères déterminent également le potentiel de prolifération de cellules en déclenchant la sénescence réplicative. Ce signal se produit lors du raccourcissement des télomères en l'absence de la télomérase. Chez Saccharomyces cerevisiae, il est probablement médié par le premier télomère de la cellule qui atteint une taille courte critique. Ce télomère raccourci, active ensuite une réponse de dommage à l’ADN. Comment la signalisation est modulée en termes de structure et du contexte télomérique est largement inconnue. Au cours de ma thèse, j’ai cherché à comprendre l'influence de l'environnement chromatinien sur le signal de la sénescence à partir du télomère le plus court. La comparaison de deux souches dans lesquelles le télomère le plus court contient les éléments sous-télomériques naturels ou non, nous montre qu'une région sous-télomérique comprenant un élément X s'oppose à la mise en place de la sénescence. Cet effet n'est probablement pas dû à des différences de réparation par récombinaison homologue dépendante de Rad51 aux deux types de télomères. De plus, la transcription de TERRA est induite dans les deux types de télomères courts, bien que les niveaux soient plus élevés en l'absence d'éléments sous-télomériques naturels. Ensemble, ces résultats démontrent que la transcription à partir d'une région proximale du télomère augmente considérablement lorsque le télomère le plus court atteint une taille critique, indépendamment de la présence d'un sous-télomère natif ou d’un promoteur TERRA dédié. Cette transcription au télomère court est similaire à la transcription trouvée aux cassures double-brin chez d'autres organismes. / Linear chromosomes end with special regions, the telomeres, which ensure the integrity and the stability of the genome. In eukaryotes, telomeres also determine cell proliferation potential by triggering replicative senescence. This occurs upon telomere shortening in the absence of telomerase. In Saccharomyces cerevisiae, it is likely mediated by the first telomere in the cell that reaches a critically short length. This shortened telomere subsequently activates a DNA-damage-like response. How the signaling is modulated in terms of telomeric structure and context is largely unknown. During my thesis, I aimed at understanding the influence of the chromatin environment on the senescence signal starting at the shortest telomere. By comparing two sets of strains in which the shortest telomere either harbors naturally occurring subtelomeric elements or lacks these elements altogether, we show that a subtelomeric region comprising an X element counteracts the establishment of senescence. This effect is likely not due to differential Rad51-mediated homology directed repair activities at both types of telomeres. Furthermore, TERRA transcription is induced at both types of critically short telomeres, although levels are elevated in the absence of natural subtelomeric elements. Together, our results demonstrate that transcription from a telomere-proximal region greatly increases when the shortest telomere reaches a critical length, regardless of the presence of a native subtelomere or a dedicated TERRA promoter. This transcription at short telomere is intriguingly reminiscent of the transcripts found at double-strand breaks in other organisms.

Rtel1 est une hélicase qui a été identifiée comme un facteur essentiel pour maintenir les télomères longs et le génome stable chez la souris. Chez l'homme, des mutations germinales dans RTEL1 ont été trouvées chez les patients atteints du syndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (HHS), une forme grave de la dyskératose congénitale. Cependant, le mécanisme selon lequel cette protéine agit dans les cellules humaines reste en grande partie inconnu. Pour étudier la fonction de RTEL1 sur le métabolisme des télomères nous avons réduit l'expression de RTEL1 par ARN interférent dans plusieurs lignées de cellules humaines et analysé la longueur des télomères par quantitative-FISH. Nos résultats montrent que la dérégulation de RTEL1 induit un raccourcissement des télomères uniquement dans les cellules avec de très longs télomères et surexprimant la télomérase. Nous démontrons également que l'absence de RTEL1 provoque une altération du complexe de shelterin au télomères: l'augmentation des niveaux de TRF2 et la diminution de POT1. La surexpression de la portion OB fold de POT1 peut restaurer le raccourcissement des télomères causé par le knockdown de RTEL1. Ceci indique que RTEL1 peut jouer un rôle important dans la stabilité du 3' sortant et l'accessibilité de la télomérase. Nous constatons également un impact de RTEL1 sur le métabolisme de l'ARN non codant télomérique TERRA. En effet, la diminution de RTEL1 réduit la quantité totale de TERRA présente dans le noyau et en particulier de TERRA associé aux télomères. Nous constatons que ce nombre réduit de TERRA est causé par sa dégradation, donc nous proposons que RTEL1 a un rôle dans la stabilisation de TERRA aux télomères. / Rtel1, regulator of telomere elongation helicase 1, was discovered as an essential factor for telomere length maintenance and genomic stability in mice. In humans, germline mutations in RTEL1 have been found in patients with Hoyeraal-Hreidarsson syndrome (HHS), a severe form of dyskeratosis congenita. However, the precise mechanism of action of the protein in human cells remains largely unknown. To investigate the function of RTEL1 in human telomere metabolism we used a knockdown approach by specific siRNAs and quantitative-FISH to measure telomere length after depletion of RTEL1 in different cancer cell lines. Our results show that down-regulation of RTEL1 induces shortening of telomeres only in cells with very long telomeres and high telomerase activity. We also demonstrate that upon depletion of RTEL1 there is a different stochiometry of shelterin proteins at telomeres: increased levels of TRF2 and decreased levels of POT1. Importantly, the overexpression of the POT1 OB fold can rescue the shortening of telomeres caused by the knockdown of RTEL1 indicating that RTEL1 may play an important role in the stability of the overhang and in its accessibility to telomerase. We also find an affect of RTEL1 on Telomeric non-coding RNA (TERRA) metabolism. Indeed, depletion of RTEL1 in human cell lines reduces the total amount of TERRA present in the nucleus and in particular of telomere-associated TERRA. Moreover, we find that this reduced number of UUAGGG repeats is caused by TERRA degradation, therefore we propose that RTEL1 has a role in stabilizing TERRA at telomeres.

Le rein est un organe considéré comme statique, montrant une capacité régénérative très limitée. Les cellules épithéliales du glomérule, appelées podocytes, sont des cellules hautement différenciées qui possèdent des extensions cytoplasmiques indispensables à leur fonction de filtration du sang. Ces cellules sont particulièrement impactées dans les pathologies rénales chroniques, et il apparaît primordial de développer des stratégies thérapeutiques permettant de restaurer leur fonction. Une des approches thérapeutiques qui semble des plus prometteuses consiste en le remplacement des cellules lésées par des cellules fonctionnelles. Dans cette approche de médecine régénérative, les capacités endogènes de régénération des organes sont exploitées et stimulées afin de permettre un rétablissement des tissus constituant les organes. Bien que les podocytes montrent un potentiel de prolifération et de régénération limité, un moyen unique de stimuler ces cellules consiste en la surexpression de la sous-unité protéique TERT de la télomérase. En effet, la surexpression transitoire de TERT dans le rein adulte induit la dédifférenciation et la prolifération des podocytes, suivi par la régénération de ces cellules. L’objectif de mon travail de thèse était d’identifier les voies de signalisation moléculaires ciblées par TERT lors de la reprogrammation des podocytes en cellules dédifférenciées et prolifératives. Le travail réalisé a permis de mettre en évidence les facteurs moléculaires impliqués dans l’initiation de ce processus ainsi que les effecteurs de la reprogrammation ciblés par TERT. De plus, l’analyse des voies de signalisation dérégulées par TERT montre que l’interaction et le remodelage de la matrice extracellulaire représentent des événements très précoces lors de la reprogrammation. Un autre objectif de ma thèse consistait en l’élucidation des mécanismes cellulaires mis en œuvre lors de la régénération des podocytes suite à la surexpression transitoire de TERT. Aussi, les résultats obtenus grâce à l’emploie d’une approche non biaisée de traçage cellulaire a révélé la présence de cellules progénitrices dans le néphron du rein adulte capables de s’amplifier de manière clonale afin de régénérer les podocytes de manière efficace et rapide. Ces résultats présentent un mécanisme cellulaire encore jamais appréhendé, menant à la régénération efficace des podocytes dans le rein des mammifères adultes. Ces données représentent une véritable percée des connaissances au regard de l’existence et de la fonction des progénitures rénaux, ouvrant la voie à des stratégies thérapeutiques permettant d’améliorer la régénération cellulaire de patients souffrant de maladies rénales chroniques. / In mammals, the kidney is considered a static organ with a limited regenerative capacity. Glomerular epithelial cells, named podocytes, are highly differentiated cells harboring cytoplasmic extensions essential for their function of blood filtration. These cells appear to be the weak link in chronic kidney diseases, rising up the necessity to develop therapeutic strategies to restore their function. One promising therapeutic approach consist in the replacement of impaired cells with fully functional cells. The aim of this regenerative medicine approach is to stimulate the endogenous regenerative capacity to reestablish the functionality of tissues within the organ. Although podocytes display a limited regenerative capacity, transient overexpression of the telomerase protein component TERT appears to be an efficient way to stimulate this capacity in vivo. Indeed, TERT exhibits potent effects on kidney podocytes in steady state conditions resulting in acute cell cycle entry and loss of differentiation. Such reprogramming of kidney podocytes is followed by replenishment of those cells by functional podocytes upon TERT withdrawal. TERT effects on kidney podocytes are independent of its role in telomere synthesis, and rather rely on its ability to modulate signaling pathways. My thesis objective was to identify the molecular mechanisms targeted by TERT non-canonical activity upon initiation and progression of podocyte reprogramming. Analysis of the molecular signaling modulated by TERT show that interaction and remodeling of the extracellular matrix represent early events of the reprogramming process. Those results highlighting TERTtarget genes and pathways upon in vivo cellular change of fate provide precious knowledge for unprecedented therapeutic strategies that aim to target TERT non-canonical activity in kidney cancers and other epithelial cancers more broadly. The second objective of my thesis was to elucidate the cellular mechanisms that support podocytes regeneration upon transient overexpression of TERT. Using podocyte lineage tracing approaches, we found that renewed podocytes observed following a TERT pulse are not derived from initially present podocytes. Using an unbiased lineage tracing approach, we further found that clonal amplification of progenitor cells is the source of podocyte replenishment in this system. Those results unveil a cellular mechanism that have never been apprehended previously, which activation lead to efficient podocyte regeneration in the adult mammalian kidney. Those data represent a real breakthrough in knowledge regarding kidney progenitor cells existence and function, and have profound implications for the development of therapeutic strategies that aim to maintain/enhance regeneration in patients with kidney diseases and in the elderly.

La télomérase est présente dans un nombre limité de cellules, telles que la plupart des cellules cancéreuses où son activité est indispensable pour l’immortalisation de ces dernières. C’est pourquoi cette enzyme a été proposée comme cible prometteuse pour des thérapies anticancéreuses. Ainsi, il est d’un intérêt certain d’identifier les mécanismes par lesquels elle est régulée, notamment via sa sous-unité catalytique, hTERT. Les rétinoïdes sont des inducteurs bien connus de la maturation granulocytaire associée à une répression de hTERT dans les blastes de leucémie aiguë promyélocytaire (LAP). Dans une lignée cellulaire LAP résistant à la maturation induite par les rétinoïdes (NB4-LR1), a précédemment été identifiée une nouvelle voie de répression transcriptionnelle de hTERT en absence de différenciation. De plus, mon laboratoire d’accueil a isolé un variant de la lignée NB4-LR1 résistant à cette répression transcriptionnelle de hTERT, la lignée NB4-LR1SFD. Ensemble, ces lignées cellulaires, qui se comportent différemment face à un traitement à l’ATRA, fournissent un outil unique et puissant pour obtenir plus d’informations sur plusieurs problèmes de la régulation de la biologie moléculaire de la télomérase. Dans cette étude, en utilisant plusieurs approches complémentaires (immunoprécipitation de la chromatine combinée à une technique d’analyse à haut débit du positionnement des nucléosomes et de la méthylation de l’ADN et une approche de FISH), j’ai pu obtenir une vue intégrée des événements épigénétiques qui promeuvent la transition du promoteur de hTERT d’un état silencieux à un état actif et inversement. Cette information sera cruciale pour le développement de stratégies anticancéreuses ciblant l’expression de hTERT. / Telomerase is present in a limited number of cells, most of them cancerous where its activity is crucial for their immortalisation. Thus, that enzyme has been proposed as a promising target for anticancer therapies. Therefore, it is of great interest to identify the mechanisms by which it is regulated, notably through its catalytic subunit hTERT. Retinoids are well-known inducers of granulocytic maturation associated with hTERT repression in acute promyelocytic leukemia (APL) blasts. However, in NB4-LR1, a maturation-resistant APL cell line, was previously identified a new pathway of retinoid-induced hTERT transcriptional repression independent of differentiation. Furthermore, my host lab reported the isolation of a variant of NB4-LR1 cells resistant to this repression: NB4-LR1SFD. These two cell lines, which behave distinctly in response to ATRA treatment, provide a unique and interesting tool to gain further insights into the molecular biology of telomerase regulation. In this thesis project, using several complementary approaches (chromatin immunoprecipitation combined to a high-resolution, single-molecule nucleosome positioning assay and DNA methylation, and a FISH approach) allowed me to shed more light on the integrated epigenetic events that lead to hTERT promoter transition from its silent to its active state and vice versa. The information obtained could be crucial for the development of anticancer strategies targeting hTERT expression.

Les cassures double-brins d’ADN (CDBs) constituent une menace pour la viabilité cellulaire et l’intégrité du génome puisque l’absence de la réparation d’une CDB pourrait conduire à la mort cellulaire. En plus de la réparation par jonction d’extrémités nonhomologues (NHEJ) en phase G1 et de la recombinaison homologue (RH) en phase S et G2, les CDBs peuvent être réparées par l’ajout de télomères par l’action de la télomérase; un phénomène qui s’appelle l’ajout de télomères de novo. Ce phénomène pourrait mettre en danger la stabilité génomique parce qu’il engendre, dans la plupart des cas, une perte du bras chromosomique du fragment non-centromérique. En conséquence, ceci engendre soit une perte de l’hétérozygotie (LOH) dans les cellules diploïdes ou la mort cellulaire dans les cellules haploïdes. Dans le but d’empêcher la formation de télomères de novo, la cellule possède des mécanismes et des voies qui préviennent l’action inappropriée de la télomérase à des CDBs. Une des principales questions dans le domaine est de comprendre comment la cellule inhibe l’ajout de télomères de novo par la télomérase en favorisant la réparation des CDBs par les autres voies (NHEJ et la RH).Dans ce projet, nous utilisons la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur le facteur limitant de la télomérase, l’ARN TLC1 de la levure S. cerevisiae. Nous avons pu montrer que l’ARN TLC1 fait un trafic intranucléaire durant le cycle cellulaire des cellules sauvages. En phase G1/S, l’ARN TLC1 adopte une localisation nucléoplasmique avec les télomères, alors qu’il s’accumule au nucléole en phase G2/M. Nous avons fait l’hypothèse que l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléole en G2/M pourrait réduire la compétition entre la RH, qui est exclusivement nucléoplasmique, et la télomérase pour la réparation des CDBs. Pour tester cette hypothèse, nous avons employé la bléomycine (blm), un composé chimique générant des CDBs, pour traiter des cellules sauvages ou déficientes de la RH par la délétion du gène RAD52. Nous avons observé que l’ARN TLC1 conserve une localisation nucléolaire dans les cellules sauvages traitées par la blm en phase G2/M, alors que dans lescellules délétées de RAD52 exposées à la blm, l’ARN TLC1 se localise maintenant au nucléoplasme et s’associe partiellement aux sites de cassures. De plus, nous avons trouvé que l’accumulation nucléoplasmique de l’ARN TLC1 dans les cellules délétéées de RAD52 traitées à la blm, dépend de la voie de dommage à l’ADN (MRX, ATM/Tel1 et ATR/Mec1) et de la sumoylation par la SUMO E3ligase, Siz1. Plus particulièrement, l’association de la télomérase à des CDBs dépend de son interaction avec Cdc13, une protéine qui recrute la télomérase aux télomères. D’une manière surprenante, nous avons observé une accumulation rapide de Cdc13 à des CDBs en absence de Rad52, bien que nos résultats suggèrent que Rad52 empêche l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléoplasme par l’inhibition de l’accumulation de Cdc13 aux sites de cassures. L’ensemble de nos résultats ont mis en évidence que la télomérase est normalement exclue des sites de la réparation d’ADN. Cependant, en absence d’une voie fonctionnelle de la RH, la télomérase se localise du nucléole au nucléoplasme et s’accumule partiellement à des CDBs d’une manière dépendante de Cdc13 et Siz1. / DNA double-strand breaks (DSB) constitute a threat to genome integrity and cell survival if they are not repaired. In addition to canonical DNA repair systems such as nonhomologous end joining (NHEJ) in G1 and homologous recombination (HR) in S and G2 phases, DSBs can also be repaired by addition of new telomeres by telomerase. This phenomenon is referred to as telomere healing or de novo telomere addition. This process threatens genome stability since it results in chromosome arm loss, which could be lethal in haploid cells and lead to loss of heterozygosity (LOH) in diploid cells. Therefore, cells possess mechanisms that prevent the untimely action of telomerase on DSBs. One of the questions driving this field is to understand how telomere addition by telomerase is inhibited and DSBs repair can be efficiently performed by canonical DSB repair (NHEJ and HR). In this project, we used fluorescent in situ hybridization (FISH) to detect the endogenous TLC1 RNA, which is the limiting component of telomerase of the budding yeast. Using this technique, we found that TLC1 RNA traffics inside the nucleus during the cell cycle of wild-type cells. In G1 and S phases, TLC1 RNA adopts a nucleoplasmic localization, which is related to its function in telomere elongation, while it accumulates in the nucleolus in G2/M. We hypothesize that the nucleolar accumulation of TLC1 RNA in G2/M may reduce the possibility that telomerase interferes with HR to repair DNA DSB, since HR is excluded from the nucleolus and occurs only in the nucleoplasm. To test this hypothesis, we treated wild-type and rad52 (HR deficient cells) with bleomycin, a radiomimetic agent that generates preferentially DSBs. Our results show that after induction of DSB with bleomycin, TLC1 RNA remains nucleolar in wild-type cells in G2/M, but accumulates in the nucleoplasm and colocalizes partially with DSBs sites in rad52 cells, suggesting that RAD52 inhibits the nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA in the presence of DSBs. Nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA after DSB induction requires the DNA damage pathway (MRX, ATM/Tel1 and ATR/Mec1), and the SUMO ligase E3 Siz1. Interestingly, association of TLC1 RNA with DSBs depends on the single-strand telomeric binding protein Cdc13, which rapidly accumulates at sites of DNA damage, while Rad52 suppresses this process by inhibiting Cdc13 accumulation at DSBs. These results suggest that telomerase is normally excluded from sites of DNA repair. In the absence of functional homologous recombination, telomerase leaves the nucleolus and accumulates partially at DSB in the nucleoplasm in a Cdc13- and Siz1-dependent manner.

Les lymphocytes constituent un modèle original de cellules somatiques puisqu’ils sont capables de réactiver la télomérase lorsqu’ils sont stimulés. Nous avons montré que les lymphocytes, en culture prolongée et soumis à des stimulations itératives par la PHA, présentent une diminution progressive de l’activité télomérasique interrompue à chaque stimulation par une augmentation transitoire. Ces variations sont corrélées positivement aux variations de hTERT et de la longueur des télomères. Les foyers γ-H2AX et 53BP1 et leur localisation au niveau des télomères augmentent lors du vieillissement cellulaire. Nous montrons un dysfonctionnement des télomères au cours de la sénescence lymphocytaire in vitro résultant d’une érosion accrue des télomères et d’une diminution de l’expression des protéines qui les coiffent. Le mécanisme des variations précoces de l’expression de hTERT lors de l’activation lymphocytaire restaient à comprendre. Les conséquences du traitement des lymphocytes par différents immunosuppresseurs agissant tous de façon directe ou indirecte sur l’activation de NFAT suggéraient le rôle de NFAT dans la régulation transcriptionnelle de hTERT. Nous avons montré i) 5 éléments de réponse potentiels pour NFAT au niveau du promoteur de hTERT, ii) l’activation in vitro du promoteur de hTERT par NFAT essentiellement via un site consensus localisé dans le coeur du promoteur de hTERT en position -40 et une synergie fonctionnelle entre NFAT et SP1, iii) la liaison directe de NFAT sur le promoteur de hTERT via ce site consensus in vivo. Ainsi, NFAT1 régule la transcription de hTERT et est impliqué dans l’activation de la télomérase lors de la stimulation lymphocytaire / Lymphocytes are an example of somatic cells capable to induce telomerase activity when stimulated. We showed that lymphocytes, during long-term culture and repeated PHA stimulations, present a progressive drop in telomerase activity interrupted at each stimulation by a transitory increase. These variations are positively correlated with hTERT and telomere length variations. γ-H2AX and 53BP1 foci and their localization on telomeres increase with cell aging. We show a telomere dysfunction during in vitro lymphocyte senescence resulting from an excessive telomere shortening and a decrease in shelterin content. The mechanism involved in early variations of hTERT expression during lymphocyte activation remained to be understood. Consequences of lymphocyte treatment with different immunosuppressors, all acting directly or indirectly on NFAT activation, suggested a role for NFAT in the regulation of hTERT transcription. Five putative responsive elements for NFAT were identified in the hTERT promoter. We showed that NFAT activates in vitro the hTERT promoter mainly via a consensus site localized in the promoter core at position -40 and a functional synergy between NFAT and SP1. Furthermore, NFAT1 binds directly to the endogenous hTERT promoter via this consensus site in vivo. Thus, NFAT positively regulates the hTERT transcription and we propose its implication in telomerase activation during lymphocyte stimulation

La télomérase, composée de l‘ARN TR et de la protéine TERT, responsable du maintien de la longueur des télomères est surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses. La dynamique de la régulation post-transcriptionnelle de TERT sur l‘activation de la télomérase a été étudiée dans le modèle de lymphomagenèse induite par l‘herpesvirus oncogène aviaire de la maladie de Marek. L‘augmentation de l‘activité télomérase des TCD4+ lors de l‘apparition des lymphomes résulte d‘une hausse du transcrit constitutif et de celle des transcrits cibles de la voie de dégradation du « non-sense mediated decay » (NMD) alors que l‘activité télomérase basale des TCD4+ non infectés est contrôlée par les isoformes dominantes négatives. La caractérisation de la protéine virale ICP27 de MDV-1, régulateur potentiel de l‘épissage des gènes, qui s‘exprime pendant la phase de réplication lytique du virus a complété cette étude. ICP27 est capable de co-localiser et d‘interagir avec les protéines SR du splicéosome ainsi que de réguler négativement l‘épissage des gènes cellulaire TERT et viral vIL8 de manière similaire à ICP27 de l‘herpesvirus simplex 1. Le modèle naturel de lymphomagenèse induite par MDV-1 a permis d‘établir pour la première fois un lien entre l‘activation de la télomérase in vivo et la régulation de l‘épissage de TERT, à laquelle pourrait participer la protéine virale ICP27. / The telomerase, consisting of an RNA template (TR) and a reverse transcriptase (TERT) maintains telomere length and is highly expressed in the majority of cancer cells. The splicing regulation of TERT was studied in Marek‘s disease (MD), a natural lymphoma induced by MDV-1, the avian MD herpesvirus. Telomerase activation observed in TCD4+ cells at the onset of MD lymphoma was due to an increase of constitutively spliced and « non-sense mediated decay » (NMD) while basal telomerase activity of non infected TCD4+ cells was controlled by dominant negative isoforms. In addition, the viral protein ICP27, a putative regulator of splicing, expressed during MDV-1 lytic infection was characterised. ICP27 co-localized and interacted with spliceosome SR proteins and negatively controlled splicing of TERT and vIL8 viral gene in a way similar to that of ICP27 of herpesvirus simplex 1. The MD model provides the only data on the in vivo regulation of TERT splicing, possibly mediated by ICP27, and telomerase activation during lymphomagenesis induced by a herpesvirus in its natural host.

La télomérase, enzyme qui permet le maintien de la longueur des télomères est activée dans la majorité des cellules cancéreuses. Du fait de son rôle dans l’immortalité cellulaire, elle a été proposée comme cible de nouvelles stratégies anticancéreuses; il est donc fondamental d’identifier les mécanismes de sa régulation. Des travaux récents du laboratoire ont démontré, en utilisant une lignée de leucémie aiguë promyélocytaire résistante à la différenciation par les rétinoïdes (NB4-LR1), que l’acide rétinoïque tout trans (ATRA) induit une répression transcriptionnelle de hTERT, sous-unité catalytique de la télomérase, indépendamment de la différenciation. Cette répression est également associée à la mort des clones résistants. Il a également été montré lors du traitement par l’ATRA de cellules résistantes à cette répression, NB4-LR1SFD, qu’il existait une hyperméthylation de la région distale du promoteur de hTERT associée à la persistance de sa transcription et à la prolifération cellulaire. Ceci nous a conduit à proposer un modèle de régulation de hTERT dans lequel l'induction de modifications épigénétiques de la région distale de son promoteur empêcherait la fixation d'éventuels répresseurs. Des résultats récents suggèrent que WT1, facteur connu pour contribuer à la répression de hTERT, pourrait être un de ces facteurs. WT1 code pour un facteur de transcription à doigt de zinc et a été décrit pour la première fois comme délété dans les tumeurs de Wilms (tumeurs rénales de l’enfant). Cependant le rôle de WT1 dans développement tumoral varie en fonction des modèles cellulaires ; il peut avoir un rôle d’oncogène ou au contraire agir comme un gène suppresseur de tumeur. Dans le but d’élucider les mécanismes de régulation de la télomérase, nous avons donc voulu étudier le rôle de WT1 dans la répression de hTERT. Pour ce travail, nous avons utilisé deux modèles cellulaires :• La Leucémie aigue promyélocytaire (LAP) : leucémie aigue myéloblastique caractérisée par un transcrit de fusion impliquant le récepteur aux rétinoïdes.• Le neuroblastome : tumeur solide extra crânienne la plus fréquente chez l’enfant. Cette maladie est très hétérogène aussi bien au niveau biologique que clinique ; en effet certaines formes peuvent régresser spontanément alors que d’autres, très agressives, sont résistantes à toutes les thérapeutiques actuelles. Cette hétérogénéité clinique est notamment liée à la différenciation de la tumeur et également à la présence ou non de l’amplification de l’oncogène N-Myc qui a un rôle pronostic majeur dans cette maladie. Les voies de signalisations impliquées dans le fort pouvoir tumorigène des neuroblastomes ne sont pas encore clairement identifiées.Nous avons pu montrer dans ces modèles que WT1 réprime hTERT et que cette répression semble fonction de l'état de méthylation de la région distale du promoteur de hTERTLa 2ème partie de mon travail a été d’étudier le rôle de WT1 dans les neuroblastomes. Les résultats de nos travaux montrent que WT1 est plus exprimé dans les tumeurs sans amplification de N-Myc et dont la différenciation est stromale. Cependant la surexpression de WT1 dans des tumeurs sans amplification de N-Myc semble associée à un moins bon pronostic. L’étude de l’expression de WT1 pourrait constituer un outil pronostic intéressant dans ces tumeurs. / Telomerase is expressed and active in most immortalized cells. Whereas telomerase becomes activated during neoplastic transformation, its activity decreases during differentiation of various immortal cells in response to pharmacological agents, including retinoids. We showed using both an Acute Promyelocytic Leukemia (APL) cellular model (NB4 cell model) and Neuroblastoma cells that all-trans-retinoic acid (ATRA) induced a transcriptional repression of the catalytic subunit of telomerase, hTERT, associated with differentiation. This repression also occurred independently of differentiation, as demonstrated during long term treatment of ATRA-induced maturation resistant NB4-LR1, leading to telomere shortening, growth arrest and cell death. Changes in chromatin environment of hTERT promoter and binding of transcriptional factors have been demonstrated in differentiating cells when hTERT is repressed. However, it is not clear whether these changes are directly involved in hTERT repression or only linked to differentiation. A variant cell line was isolated from NB4-LR1 cells, (NB4-LR1SFD), which bypassed the death step because of a re-activated telomerase and resisted to hTERT repression despite the continuous presence of ATRA. Using both NB4-LR1 and NB4-LR1SFD cells, it was shown that the mechanisms of ATRA-induced hTERT repression involved: 1) a switch from c-myc to mad1 binding at the proximal domain of hTERT promoter, 2) epigenetic modifications of the distal domain of hTERT promoter (-600 -250 nucleotides). Indeed, the persistence of hTERT transcription was associated with an hypermethylation of the distal domain in ATRA-treated NB4-LR1SFD. Interestingly, the binding of a known hTERT repressor, WT1, to this distal domain, was defective in NB4-LR1SFD. The first part of my thesis was to investigate the role in hTERT transcriptionnal regulation of both c-myc and WT1, two transcription factors, which bind to the proximal and the distal region of hTERT promoter, respectively. The second part was to determine the role of WT1 in neuroblastoma. Neuroblastoma is the most common extra cranial solid tumor in childhood and the most frequently diagnosed neoplasm during the infancy. A striking feature of this tumor is its clinical heterogeneity. Among tumor progression markers delineated so far, MYCN amplification occurs in about 25% of total neuroblastoma cases and this percentage increases at 30% in advanced stage NEUROBLASTOMA. Despite the fact that MYCN amplification is strongly correlated with neuroblastoma of poor outcome, MYCN status cannot predict all cases of poor survival in neuroblastoma. In addition, neuroblastoma without MYCN amplification (about 70-80% of neuroblastoma) are far to display favorable behavior. WT1 was initially identified as a tumor suppressor gene involved in the development of a pediatric renal tumor (Wilm’s tumor). Here, we describe an inverse correlation between WT1 expression and MYCN amplification and expression. However and most notably, our results show that WT1 gene expression is associated with a poor outcome for patients showing non-MYCN-amplified tumors. Thus WT1 expression may be a prognostic marker for a better risk-stratification and for an optimized therapeutic management of neuroblastoma.

Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures non canoniques d'acides nucléiques formées par des séquences d'ADN ou d'ARN contenant des blocs de guanines. In vivo, ces structures pourraient être impliquées de façon transitoire dans de nombreux processus cellulaires, en particulier au niveau des télomères. Dans ce dernier cas, la formation de G4 aux télomères au moyen de ligands favorisant ces structures pourrait limiter la prolifération de cellules tumorales. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé une méthode de criblage à moyen débit permettant de tester l'effet de diverses molécules sur la stabilisation du G4 télomérique humain. Cette méthode, basée sur la dénaturation thermique de G4 suivie en fluorescence, en présence d'autres structures compétitrices d'ADN, a permis d'identifier plusieurs familles de ligands présentant des affinités et des sélectivités intéressantes, tels que des dérivés macrocycliques de néomycine et des N-méthylbisquinolinium phénanthrolines. Nous avons ensuite caractérisé plus précisément les mécanismes moléculaires expliquant la stabilisation des G4 par divers ligands. L'étude cinétique sur un modèle de G4 tétramoléculaire a permis de mettre en évidence la possibilité d'une accélération importante de la vitesse d'association des G4 par certaines familles de composés. Nous avons également analysé l'inhibition de la télomérase en présence de ces ligands. En utilisant un test d'extension d'amorce par la télomérase, nous avons montré que seuls certains ligands étaient capables d'enrayer l'élongation par la télomérase sur un substrat ne formant pas initialement de G4 intramoléculaire. Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle les effets cellulaires de ces ligands ne sont pas uniquement corrélés à leur effet sur la télomérase, mais aussi à des effets connexes impliquant d'autres protéines télomériques, essentielles au maintien de télomères fonctionnels. Enfin, nous avons transposé cette stratégie de ciblage du télomère pour limiter la prolifération cellulaire, à l'agent pathogène responsable de la Malaria : Plasmodium falciparum. Nous avons montré l'existence d'une extrémité télomérique 3' sortante chez le parasite et son potentiel repliement en G4 dans des conditions physiologiques. Plusieurs molécules stabilisant les G4 télomériques du parasite avec une bonne sélectivité ont été identifiées, et leur impact sur sa prolifération a été testé.

La stabilité de la longueur des télomères est cruciale pour le maintien de l’intégrité du génome. De nombreux problèmes peuvent survenir lors de la perte de l’intégrité des télomères, tels que le vieillissement prématuré ainsi que d’autres maladies incluant, l’insuffisance de la moelle osseuse et les cancers. Certaines cellules, telles que les cellules souches embryonnaires, expriment la télomérase permettant le maintien de la longueur des télomères. Le laboratoire Harrington a démontré que l’absence de la télomérase engendre un défaut de différenciation des mESCs à télomères courts (mESCs Tert -/-) ainsi que des perturbations épigénétiques. Ils ont aussi détecté un rétablissement de l’habilité de différenciation des mESCs Tert -/- dans le contexte d’un « knockout » de Trp53. Nous avons cherché à comprendre comment Trp53 influence la différenciation des mESCs à télomères courts en étudiant l’impact de Cdkn1a (p21) sur leur différenciation. En utilisant CRISPR/Cas9, nous avons généré plusieurs clones Cdkn1a KO afin d’analyser leur capacité à se différencier. Nous avons également étudié l’impact d’un Trp53 KO dans les mESCs Tert -/- sur les marques épigénétiques ainsi que sur la longueur des télomères. Cette étude ne nous permet pas de conclure comment p53 impact la différenciation de ces cellules, même s’il semble apparent que p21 ne soit pas directement impliqué. La poursuite de ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme de différenciation des mESCs et son lien avec l’intégrité des télomères et par conséquent, contribuera à mieux connaître l’impact des télomères dans le vieillissement et ses maladies associées. / Telomere length stability is crucial for the maintenance of genome integrity. Many problems can arise from a loss of telomere integrity, such as premature aging, and other diseases including anemia, bone marrow failure, and cancer. Some cells, such as embryonic stem cells, express telomerase, which allows telomere length maintenance. The Harrington group showed that the absence of telomerase generates a defect in the differentiation of ES cells with eroded telomeres (mESCs Tert -/-) and was accompanied by other epigenetic modifications. They also detected a rescue in differentiation of mESCs Tert -/- that were disrupted or knocked out (KO) for the tumor suppressor p53, encoded by Trp53. We aimed to understand how Trp53 impacts mESCs differentiation by looking at the impact of Cdkn1a (p21) on the differentiation of those cells as well as the impact of p53 KO on epigenetic marks. Using CRISPR/Cas9, we generated several p21 KO clones to analyze their ability to differentiate. We also assessed the impact of a p53 KO in mESCs Tert -/- on epigenetic marks and telomere lengths. This study does not allow us to conclude how p53 impacts differentiation of those cells, even though it appears that p21 is not directly implicated. The continuation of this project will allow a better understanding of the differentiation mechanism in mESCs and its relationship to telomere integrity, and a deeper appreciation of the impact of telomeres in aging and correlated diseases.