This diploma thesis is focused on the analysis of toxins and their extraction from sandyloamy soil. Particularly, saxitoxin and trichothecene mycotoxins deoxynivalenol, HT-2 and T-2 toxins are in the centre of interest of this work. Their occurrence, toxic properties and influence on living organisms are described in theoretical part of this thesis. In next chapters, currently published extraction methods for individual toxins and analytical approaches for their quantitative evaluation are summarized. In experimental part of this thesis, optimized process of sample pretreatment based on extraction of toxins from soil using 1mM HCOONH4 in 84% acetonitrile was proposed as the best option. Simultaneous determination of toxins was performed by liquid chromatography on a CN column (3.0 x 150 mm, 3 Îm, 100 ) in gradient elution mode. Mass spectrometer with electrospray as ion source and linear ion trap as analyzer was used as detector. Recovery of designed method was over 80% for trichothecene mycotoxins and 51% for saxitoxin.

En France, la récente apparition et implantation de l’espèce Fusarium langsethiae sur les orges de brasserie est devenue une source d’inquiétude. Ce champignon étant connu comme producteur de toxines T-2 et HT-2 cela pose le problème de la présence éventuelle de ces mycotoxines dans la bière. Des études ont proposé la levure Geotrichum candidum comme possible outil de contrôle du niveau de contamination par ces molécules. Par contre, le mécanisme d’action est encore inconnu. L’objectif de ce travail était de comprendre l’interaction entre F. langsethiae et G. candidum pour évaluer l’effet sur le développement de F. langsethiae et sur sa production de la toxine T-2. Nous avons évalué l’interaction entre ces micro-organismes en utilisant des cultures séquentielles et des co-cultures. Dans ce dernier cas la différentiation des deux micro-organismes a été faite par DOPE-FISH et par quantification de l’ADN. Les résultats ont montré que la croissance de F. langsethiae n’est pas inhibée dans un milieu pré-fermenté par G. candidum. Par contre, la présence d’un agent actif thermorésistant produit lors du développement de G. candidum affecte la concentration de la toxine T-2. Uneréduction supérieure à 90% est observée en comparaison au témoin. Dans les co-cultures on obtient le même pourcentage de réduction de la concentration de la toxine par rapport au témoin. Dans ce cas les deux micro-organismes se développent mais en moindre quantité que dans leur culture pure, F. langsethiae semblant plus inhibé que G. candidum. / F. langsethiae has been recently installed and detected in French barley used for malting. This species is known as a T-2 and HT-2 mycotoxin producer and for this reason, the possible presence of these mycotoxins in beer is a concern. G. candidum has been suggested to have a control activity in this issue, however the mechanisms is not yet described. The aim of this work was to understand the interaction between F. langsethiae and G. candidum to identify any effect in F. langsethiae growth and the T-2 toxin production. In this work, the interaction was evaluated using sequential cultures and co-cultures. Differentiation of these microorganisms in co-culture was achieved using DOPE-FISH and DNA quantification. Results showed that in the medium prefermented by G. candidum F. langsethiae growth was not inhibited but a thermoresistant active agent affected the T-2 toxin concentration during F. langsethiae development. A reduction over 90% of the T-2 toxin was observed in comparison to the concentration detected in the control. For mixed cultures the same toxin concentration reduction was observed while both microorganisms grew but at a lesser extent compared to pure cultures. In this case the growth of F. langsethiae was more affected than the one of G. candidum.

Darbo objektas: tyrimams mėginiai imti iš sandėlių X ir XX, esančių Vilkaviškio rajone, iš viso paimta 30 miežių ir 30 kviečių mėginių. Darbo tikslas: nustatyti Fusarium spp. kitimą grūduose ir fuzariotoksinų dinamiką sandėliavimo metu bei įvertinti profilaktinių priemonių efektyvumą prieš Fusarium spp. plitimą grūduose. Tyrimo uždaviniai:nustatyti sandėliavimo metu grūdų (kviečių ir miežių) užsikrėtimą mikromicetais;įvertinti fuzariotoksinų (deoksinivalenolio, zearalenono, T–2 toksino) paplitimą grūduose sandėliavimo metu; įvertinti profilaktinių priemonių efektyvumą X ir XX ūkiuose prieš Fusarium spp. plitimą grūduose. Rezultatai ir aptarimas. Atlikus kiekybinį kviečių ir miežių užterštumą mikromicetų pradais, buvo nustatyta, kad didžiausias „Ūla“ veislės miežių užterštumas buvo nustatytas 2013 metų kovo mėnesį 113±10,4*103 KSV/g. Veislėje “Luokė” didžiausias užterštumas mikromicetų pradais buvo nustatytas 2012 metų kovo mėnesį –109±19,9*103 KSV/g. Didžiausias kviečių veislės „Triso“ užkrėstumas taip pat buvo nustatytas 2012 metų kovo mėnesį – 204±7,8*103 KSV/g, veislės „Munk“ didžiausias užterštumas buvo nustatytas taip pat 2012 metų kovo mėn. 128±10,8*103KSV/g. Lyginant sandėliuose X ir XX laikomus miežius „Ūla“ ir „Luokė“ Fusarium spp. paplitimas buvo: miežių „Ūla“ didžiausias vidinis užkrėstumas mikromicetų pradais siekė 80±0,0 proc. veislės „Luokė“ taip pat 80±0,0 proc. Didžiausias išorinis fuzarioze užkrėstumas veislėje “Ūla” siekė 73±0,44 proc. (sausio mėn. 2012 m.)... [toliau žr. visą tekstą] / The Object of the work: testing samples taken from granaries located in the X and XX Vilkaviškis district, taken 30 wheat and 30 barley samples. The aim of the work: changes in the grain and dynamics of fusariotoxins while granaring and to evaluate effectiveness of preventive measures against spreading of Fusarium spp. in grain. Reasearch objects:to assess fungi contamination in grain (wheat and barley) while granaring; to evaluate prevalence of fusariotoxins (deoxynivalenol, zearalenone, T–2 toxin ) in the grain while granaring;to evaluate effectiveness of preventive measures in X farms against spreading of Fusarium spp. in the grain. The results and their discussion: carried out quantitative wheat and barley contamination with fungi rudiment, found that ultimate „Ūla“ species barley contamination determined in 2013 March 113±10,4*103 KSV/g. Ultimate „Luokė“ species barley contamination with fungi rudiment determined 2012 March 109±19,9*103 KSV/g. Ultimate contamination of wheat species „Triso“ as well was determined 2012 March 204±7,8*103 KSV/g, mean while ultimate contamination of species „Munk“ was determined 2012 March 128±10,8*103KSV/g. Compared spreading in barley of Fusarium spp. in granaries X and XX species „Ūla“ and „Luokė“ prevalence found: ultimate contamination with fungi rudiment in barley „Ūla“ range 80±0,0 %, species „Luokė“ 80±0,0 %. Ultimate external contamination of fusariosis in species „Ūla“ range 73±0,44 % (2012 January) and 73±3,33 % (2012... [to full text]

This master thesis deals with a monitoring of a content of the trichothecene mycotoxins deoxynivalenol, nivalenol, T-2 toxin and HT-2 toxin in malting barley using the LC-MS/MS method. The theoretical part describes general characteristics of mycotoxins and their significant producer filamentous fungus of Fusarium species. Further, important trichothecene mycotoxins and mycotoxins generally which are commonly found in malting barley were also characterized. In the theoretical part of the thesis possibilities for a determination of the mycotoxins by the chromatographic methods were presented too; the immunochemical methods were also mentioned. In the experimental section an analysis of the B type trichothecenes was optimized by LC/APCI-MS/MS and of the A type trichothecenes by LC/ESI-MS/MS. When analyzing 57 samples of different barley varieties the deoxynivalenol reached the highest values (up to 945,2 µg.kg-1), namely in the case of the Sebastian variety with corn as the fore-crop. The highest values of nivalenol, T-2 toxin and HT-2 toxin (138,4 µg.kg-1; 21,8 µg.kg-1 and 68,7 µg.kg-1 respectively) were found in the Prestige variety of barley with winter wheat as the fore-crop. Subsequently a second set of four experimental samples of the Sebastian variety of barley and malt produced from the variety with corn as the fore-crop were analysed. In this group three samples were artificially infected with the filamentous fungi of Fusarium species; the fourth sample was not artificially infected and served as a control sample. Even in the case of the artificially infected samples the deoxynivalenol reached the highest values. The master thesis was implemented in the Research Institute of Brewing and Malting, Plc. in Brno.

Depuis les 15 dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle majeur de l’architecture nucléaire dans la régulation de l’expression des gènes et ceci dans une grande diversité de processus biologiques. Bien que la réponse immunitaire soit un de ces processus, peu de données existent sur l’organisation spatiale du génome dans les cellules immunitaires et son impact sur la régulation des gènes dans le contexte d’une réponse à l’infection bactérienne. En utilisant le porc comme organisme modèle, nous avons concentré notre étude sur les macrophages dérivés de monocytes, premières lignes de défense contre les pathogènes. Les cellules immunitaires étant les cibles des mycotoxines, nous nous sommes également intéressés aux effets de la toxine T-2 sur les macrophages et leur réponse induite par les récepteurs TLR. Un effet cytotoxique de la T-2 à une dose de 10 nM, ainsi que des effets inhibiteurs sur certaines réponses liées aux récepteurs TLR ont été mis en évidence. Nous avons ensuite examiné si les changements dans l'expression des gènes dus à l'activation impliquent un repositionnement dans l'espace nucléaire. Une analyse du transcriptome a permis d’identifier les gènes différentiellement exprimés dans les macrophages activés par le mélange LPS-IFNγ et de mettre en évidence des réseaux de gènes impliqués lors de l’activation. Les 4 gènes les plus sur-exprimés (IL1β, IL8, CXCL10 et TNFα) et les 4 gènes les plus sous-exprimés (VIM, LGALS3, TUBA3 et IGF2) ont été sélectionnés pour analyser leur comportement dans l'espace nucléaire au cours de l’activation des macrophages en utilisant la technique FISH 3D. Parmi les 4 gènes sur-exprimés, 3 présentent des modifications de leur position durant le processus d'activation alors que les 4 gènes sous-exprimés ne montent pas de variation de leur position. L'analyse de la position des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques (TC) a été étendue à un second type de cellules immunitaires : les neutrophiles. Des résultats similaires ont été obtenus. Les analyses ont été ensuite complétées par l'étude des 4 gènes sur-exprimés dans un type cellulaire indépendant de la réponse immunitaire (fibroblastes). Nos données suggèrent que les relocalisations dans l'espace nucléaire des gènes différentiellement exprimés dans les cellules immunitaires activées sont gène spécifique, type cellulaire spécifique et concernent essentiellement ceux qui sont sur-exprimés. / For the past 15 years, numerous studies have highlighted the role of nuclear architecture in regulating gene expression in a variety of biological processes. Although the immune response is one of these processes, few data exist on the spatial organization of the genome in immune cells and its impact on gene regulation in the context of a response to bacterial infection. Using pigs as a model organism, we focused our study on monocytederived macrophages, the first lines of defence against pathogens. As immune cells are the targets of mycotoxins, we also studied the effects of T-2 toxin on macrophages and on their responses induced by TLRs. A cytotoxic effect of T-2 at a dose of 10 nM, and an inhibitory effect on some responses related to TLRs have been demonstrated. We then examined whether changes in gene expression due to activation involve a repositioning within the nuclear space. A transcriptome analysis allowed us to identify differentially expressed genes in macrophages activated by LPS-IFNγ and to analyze gene networks involved during activation. The top 4 up-regulated genes (IL1 beta, IL-8, CXCL10 and TNF) and the top 4 down-regulated ones (VIM LGALS3, TUBA3 and IGF2) have been selected to analyze their behaviour in nuclear space during macrophages activation using 3D FISH technique. Among the 4 up-regulated genes, 3 show changes in their position during the activation process while the 4 down-regulated ones did not reposition. The analysis of gene behaviours towards their chromosome territories (CT) was extended to neutrophils and similar results were obtained. The analyses were then completed by the study of the 4 up-regulated genes in a non immune cell type (fibroblast). Our data suggest that relocation in the nuclear space of genes differentially expressed in activated immune cells is gene and cell type specific and mostly concerns those that are up-regulated.

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires des moisissures qui peuvent naturellement contaminer de nombreux supports (céréales, fruits, papiers peints, compost). Dans ces travaux de thèse, nous avons focalisé notre intérêt sur deux mycotoxines produites principalement par les champignons du genre Fusarium, appartenant toutes deux au même groupe des trichothécènes, le déoxynivalénol (DON) et la toxine T-2 (T-2). Les objectifs de cette thèse ont été de déterminer les effets de ces deux toxines sur la mise en place des réponses immunitaires au sein de la muqueuse respiratoire et intestinale. L’ensemble de ces études a été réalisé chez le porc, espèce cible de ces contaminants et animal modèle pour l’Homme. Les résultats de ces travaux ont montré que ces deux toxines affectent la réponse immunitaire. Au niveau du tractus respiratoire, une faible dose de toxine T-2 altère l’activation des macrophages alvéolaires lorsqu’ils sont stimulés par les agonistes des TLRs -4, -2/6 (lipopolysaccharides et acides lipoteichoïques, respectivement) en diminuant la synthèse du composé antimicrobien NO et des cytokines pro-inflammatoires IL-1β et TNF-α. Cette immunosuppression pourrait alors conduire à une susceptibilité plus accrue des porcs à des infections opportunistes. Au niveau du tractus intestinal, à l’état basal, nous avons mis en évidence que le DON comme la toxine T-2 induit une forte réponse inflammatoire innée associée à la stimulation de la voie IL-17 en inhibant le développement des cellules T régulatrices. Des études mécanistiques ont permis de déterminer que les cytokines associées à la voie IL-17 suite à une exposition aux trichothécènes, sont produites par une des sous-populations de cellules T innées, les cellules Tγδ productrices d’IL-17. La troisième partie de ce travail a porté sur l’utilisation de la souche Lactobacillus sobrius DSM 16698T dans le but de lutter contre les effets immunomodulateurs générés lors d’une exposition aux trichothécènes. Les résultats de ce travail ont montré que cette souche bactérienne est capable de réduire les effets inflammatoires IL-17 et de rétablir les paramètres impliqués dans les fonctions de la barrière intestinale, suite à une exposition ex vivo et in vivo au DON. En revanche, cette souche a peu d’effet contre la toxine T-2. L’ensemble de ce travail de thèse suggère donc qu’une exposition à de faibles doses de trichothécènes pourrait accroître la susceptibilité des animaux aux perturbations de nature infectieuse ou inflammatoire. / Mycotoxins are fungi secondary metabolites that can contaminate a lot of environments worldwild such as cereals, fruits, wallpapers, and compost heaps. Throughout this phD work, we focused on two mycotoxins mainly produced by Fusarium species, both belonging to the trichothecenes group: the deoxynivalenol (DON) and the T-2 toxin (T-2). The aims of this study were to determine the effects of these two toxins on the immune response implementation in respiratory and intestinal mucosa. Studies were performed on swine being a target species of these contaminants and a model species for Humans. The results of these works proved that these two mycotoxins can affect the immune response. In the respiratory tract, a low dose of T-2 toxin alters the activation of the alveolar macrophages when they are stimulated by the agonists of TLRs -4 and -2/6 (lipopolysaccharides and lipoteichoic acids, respectively). This alteration is due to the decrease of the synthesis of the anti-microbial compound NO and the pro-inflammatory cytokines such as IL-1β and TNF-α. This immunosuppression can induce the emergence of opportunist infections in pig. In the intestinal tract, in background level, we demonstrated that DON as well as T-2 toxin induces a strong inflammatory immune response associated with stimulation of IL-17 pathway by inhibiting of the development of regulatory T cells. Mechanistic studies were used to determine the production origin of the cytokin associated to the IL-17 pathway. This cytokine is produced by one of the subpopulations of Tregs, the Tγδ cells IL-17 producing when exposed to trichothecenes. The third part of this work was about the use of Lactobacillus sobrius DSM 16698T strain to counteract the immunomodulatory effects induced after trichothecen exposure. The results of this study showed that this bacterial strain is able to reduce IL-17 inflammatory effect and is also able to re-etablish the parameters involved in the intestinal barrier functions in ex vivo and in vivo response to DON. Nevertheless, this strain is less effective against the T-2 toxin. Taken together, results of this phD suggest that an exposure to low doses of trichothecens could be intensify the susceptibility of animal to infectious or inflammatory disease.