Chronic kidney disease (CKD) is associated with a complex state of immune dysfunction characterised by immune depression, which predisposes CKD patients to infections, and by immune activation resulting in inflammation, which is associated with cardiovascular disease among these patients. It has been suggested that regular moderate exercise may enhance immune function and exert anti-inflammatory effects. However, such effects are still unclear in CKD. Therefore, we investigated the effects of acute and regular (1-month and 6-months) moderate intensity aerobic exercise (walking) on measures of immunity and inflammation in pre-dialysis CKD patients. A single bout of walking exercise induced an overall immune and inflammatory response that was comparable to that observed in healthy individuals, with no indication of harmful effects to patients underlying state of immune dysfunction. Acute exercise induced a normal pattern of mobilisation of immune cells. Concerning immune cell function, acute exercise had no effect on T lymphocyte and monocyte activation, while it actually improved neutrophil responsiveness to a bacterial challenge in the recovery period. In addition, acute exercise induced a systemic anti-inflammatory environment, evidenced by the marked elevation in plasma IL-10 levels after exercise, which was most likely mediated by the observed increase in plasma IL-6 levels. Regular walking exercise exerted anti-inflammatory effects, with no apparent detrimental effects to patients immune and inflammatory status. Regular exercise led to improvements in the systemic inflammatory status (ratio of pro-inflammatory IL-6 to anti-inflammatory IL-10 cytokine levels) that were accompanied, and most likely mediated, by the observed down-regulation of T lymphocyte (only evident at 6-months) and monocyte activation. In addition, a reduction in IL-6 production in PBMC and whole blood cultures was also observed (only assessed at 1-month). Regular exercise had no effect on circulating immune cell numbers and neutrophil degranulation responses. These findings provide compelling evidence that walking exercise is safe from an immune and inflammatory perspective and has the potential to be an effective anti- inflammatory therapy in pre-dialysis CKD patients.

Les lymphocytes T CD4 (LT CD4) jouent un rôle central dans la régulation des réponses immunitaires vis-à-vis des agents infectieux et des vaccins. Cependant, leur différenciation in vivo est encore mal comprise et les caractéristiques des LT CD4 capables de persister à long terme tout en assurant une réponse immunitaire protectrice sont mal définies. L’approfondissement de ces connaissances est indispensable pour le développement de nouveaux vaccins. Pour approcher cette question, nous avons utilisé deux approches expérimentales. La première est un suivi de la différenciation des LT CD4 au cours de la réponse immune primaire chez des sujets vaccinés contre l’hépatite B ; la deuxième est la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des LT CD4 mémoires antigène(Ag)-spécifiques pendant la phase d’état. Cette analyse a été réalisée au sein des LT CD4 spécifiques d’Ag vaccinaux, l’Ag de surface du virus de l’hépatite B (HBs) et la toxine tétanique (TT), ainsi que ceux spécifiques des Ag du cytomégalovirus (CMV). Les LT CD4 Ag-spécifiques ont été mis en évidence par cytométrie de flux après marquage intracytoplasmique du ligand du CD40 (CD40L) exprimé en réponse à une stimulation de courte durée par l’Ag. Des expériences basées sur la stimulation par la toxine du syndrome du choc toxique et le marquage du segment Vbeta2 du récepteur des LT ont démontré la bonne sensibilité et spécificité de cette méthode. Le suivi de la réponse primaire chez 11 donneurs jusqu’à plus d’un an après immunisation par le vaccin anti-hépatite B a permis d’établir un modèle de différenciation des LT CD4 Ag-spécifiques in vivo chez l’homme. Nous avons mis en évidence des LT CD4 spécifiques d’un nombre limité de peptides immunodominants de la protéine HBs suggérant une réponse de type oligoclonale. Grâce à l’utilisation d’un cytomètre neuf couleurs, nous avons mené une analyse détaillée de l’hétérogénéité de la population mémoire HBs-spécifique. L’expression du CCR7 permet de distinguer des cellules de type mémoire centrale (LTCM, CCR7+) et effectrice (LTEM, CCR7-) se distinguant notamment par leur capacité à migrer vers les ganglions lymphatiques ainsi que par leurs propriétés fonctionnelles. Nous avons montré l’existence de ces deux sous-populations au sein des cellules HBs-spécifiques mais par opposition à leur définition initiale, ces LTCM sont capables de produire des cytokines effectrices. La proportion importante de LTCM exprimant le Ki67 témoigne d’une activité proliférative persistante in vivo et suggère la capacité de ces cellules à s’auto-renouveler et éventuellement à alimenter le pool des LTEM. La proportion importante de LTCM exprimant la chaîne alpha du récepteur à l’IL-7 (CD127) suggère que ces cellules sont sensibles aux signaux émanant de l’IL-7, une cytokine dont le rôle dans le maintien de la mémoire lymphocytaire T est connu. Compte tenu de la relevance potentielle de ces caractéristiques uniques pour le développement de vaccins et de l’accumulation de travaux montrant l’avantage sélectif des LTCM à conférer une immunité protectrice, nous avons focalisé la dernière partie de ces recherches sur cette sous-population. Une étude transversale des LTCM spécifiques de plusieurs types d’Ag (éliminés (HBs et TT) ou persistants (CMV)) a été menée. Nos résultats montrent une hétérogénéité, variable selon l’Ag, de la capacité de ces cellules à produire des cytokines effectrices et de leur phénotype de différenciation. Cette donnée nouvelle soulève la possibilité que les LTCM soient hétérogènes dans leur capacité à conférer une immunité protectrice. L’acquisition du marqueur KLRG1 par une fraction des LTCM s’associe à une capacité accrue à produire des cytokines effectrices et à une expression élevée du CD127. La possibilité que ces cellules soient particulièrement aptes à conférer une immunité protectrice et durable est discutée, tout comme les mécanismes menant à leur génération et l’intérêt de ces connaissances pour la conception de nouveaux vaccins.

The C-type lectin CD161 is expressed by a large number of T lymphocytes, with approximately a quarter of both T cell receptor (TCR)αβ+ and TCRγδ+ T cells expressing this marker. Within CD8+ T cells, a large proportion of these are comprised of Mucosal Associated Invariant T (MAIT) cells, a novel innate-like lymphocyte subset characterised by expression of a semi-invariant TCR together with high levels of CD161 (CD161++). These cells display a phenotype reflective of type 17 CD4+ helper T cells (Th17), which are also hallmarked by CD161 expression. Both MAIT and Th17 cells arise from preprogrammed progenitors, identifiable within umbilical cord blood by expression of CD161. Thus, CD161 appears to identify cells of a pre-determined and distinct phenotype. Whether this reflects a common transcriptional programme, developmentally induced within these cells, and further whether this extends to other CD161 positive T cells, was examined here by mRNA microarray analysis. This analysis identified a shared transcriptional signature and common innate-like function of all CD161 expressing T lymphocytes, and independent of TCR expression or lineage. Furthermore, a population of CD8+ T lymphocytes expressing lower levels of CD161 which overlap phenotypically with CD161++CD8+ MAIT cells was identified by both mRNA microarray analysis and mass cytometry (CyTOF); the CD161+CD8+ T cell population. TCR repertoire analysis, flow cytometry and cell culture experiments were utilised to investigate the origin of this subset, and its phenotype and function in both health and disease investigated in depth. This revealed a pre-programmed, tissue-resident memory population with potent effector functions. Both CD161++ MAIT and CD161+CD8+ T cells expressed high levels of the drug efflux pump MDR1, previously described to confer drug resistance to certain malignant cells. The significance of expression of this pump was hence investigated to determine its potential affect on the success of a variety of clinical therapies.

Le Syndrome Néphrotique à Lésions Glomérulaires Minimes (SNLGM) et la glomérulonéphrite extra membraneuse (GEM) sont deux podocytopathies primitives d'origine immunitaire associant des altérations immunes et des atteintes podocytaires à l'origine d'un syndrome néphrotique. Cependant, bien que l'origine dysimmunitaire soit confortée par de nombreux arguments cliniques, les mécanismes impliqués restent obscurs. Initialement identifié dans les lymphocytes T (LT) de patients en phase de poussée de SNLGM, le gène c-mip est également exprimé dans les podocytes de patients atteints de SNLGM et de GEM, alors qu'il est physiologiquement réprimé. Ainsi, les objectifs de ce travail étaient : 1) appréhender le rôle de c-mip dans le LT d'une part à travers l'étude d'un modèle murin transgénique (Tg), et 2) comprendre la fonction de c-mip au niveau du podocyte grâce au modèle expérimental de GEM humaine induit chez le rat.Le modèle murin Tg Lck-cmip surexprime spécifiquement c-mip dans les LT matures périphériques. Cette surexpression est à l'origine d'un phénotype lymphocytaire altéré marqué par une accumulation de LT naïf, et une inhibition de la synthèse de cytokines de type TH1 et TH2, après une activation T spécifique ex vivo. Cette régulation négative est associée à une accumulation des formes inactives des kinases de la famille des Src et un blocage du recrutement des lipids rafts nécessaire à la formation de la synapse immunologique. Ces résultats suggèrent donc que c-mip est un régulateur négatif de l'activation T impliqué dans la signalisation proximale lymphocytaire et pourrait être impliqué dans l'hyporéactivité lymphocytaire observée chez les patients atteints de SNLGM actif.L'étude de la néphrite de Heymann passive, un modèle expérimental de GEM humaine, montre que l'induction podocytaire de c-mip coïncide avec l'apparition de la protéinurie. Cette surexpression est associée d'une part, à une diminution des taux de synaptopodine qui engendre une diminution de l'activité RhoA, à l'origine d'une désorganisation du cytosquelette podocytaire, et d'autre part à une induction de DAPK (death-associated protein kinase) et ILK (Integrin Linked Kinase) impliquées dans des phénomènes pro-apoptotiques. La cyclosporine A en inhibant l'expression de c-mip restaure les taux de DAPK et ILK ainsi que l'activité RhoA. Ainsi dans le podocyte, c-mip semble impliquer dans les troubles de la signalisation podocytaire aboutissant à une protéinurie néphrotique.C-mip semble donc jouer un rôle crucial dans les perturbations podocytaires et lymphocytaires observées chez les patients atteints de podocytopathies primitives et représente à ce titre une cible thérapeutique.Mots clefs :C-mip, Syndrome Néphrotique à Lésions Glomérulaires Minimes, Glomerulonéphrite Extra Membraneuse, signalisation proximale, lymphocyte T, podocyte, cytosquelette / Minimal Change Nephrotic Syndrome (MCNS) and Membranous Nephropathy (MN) are two primitive immune podocytopathies associating immune alterations and podocyte damage ultimately leading to proteinuria. Although the immune origin of the disease is corroborated by numerous clinical data, the mechanisms involved are still unknown. In previous works by the team, the c-mip protein was found expressed in T lymphocytes (TL) from patients with MCNS relapse, and in podocytes from MCNS and MN patients, while it is physiologically repressed. The aims of the present work were: firstly, to investigate the rôle of c-mip in TL by the study of Lck-cmip transgenic mice (Tg); secondly, to understand c-mip function in podocyte using a rat experimental model of human MN (Heymann nephritis).Transgenic mice overexpressed specifically c-mip in peripheral mature TL. This expression led to an altered TL phenotype characterized by accumulation of naïve LT associated with inhibition of TH1's and TH2's cytokines, after T-specific activation ex vivo. This negative regulation was correlated with an increase in the inactive forms of Src kinases and a blockage of the lipid raft clustering required for immunological synapse formation. These results suggest that (i) c-mip is a negative regulator of the proximal signaling events associated with TL activation involved in proximal signaling and (ii) it could be involved in the TL hyporeactivity described in SNLGM patients.In the study based on passive Heymann Nephritis, the experimental model of MN, the results highlight a correlation between podocyte expression of c-mip and proteinuria. This expression is associated, on the one hand, with a decrease in synaptopodin levels, which generate a decrease of RhoA activity resulting in podocyte cytoskeleton disorganization, and on the other hand with DAPK (Death Associated Protein Kinase) and ILK (Integrin Linked Kinase) induction, known to be involved in pro-apoptotic mechanisms. Cyclosporin A inhibited c-mip expression and restored the basal levels of DAPK, ILK and Rhoa activity. These results suggest that in podocyte, c-mip could be involved in proximal signaling alterations leading to nephrotic proteinuria.In conclusion, c-mip could play a crucial rôle in both the lymphocyte and podocyte alterations observed in patients suffering from primitive podocytopathies, strongly suggesting its potential as a therapeutic target in these disorders.Key words :C-mip, MCNS, MN, proximal signaling, Src kinase, T lymphocyte, podocyte, cytoskeleton

L’efficacité de la réponse immunitaire adaptative repose tout particulièrement sur la motilité des lymphocytes T naïfs entre la circulation sanguine et les organes lymphoïdes secondaires, leur permettant ainsi de rencontrer un antigène spécifique. De nombreuses voies de signalisation sont impliquées dans ce phénomène. En particulier, les Rho GTPases y jouent un rôle central, par leur capacité à moduler le cytosquelette d’actine. Nous avons identifié la protéine Fam65b comme nouveau régulateur de la circulation des lymphocytes T. En effet, nous avons montré que la diminution de l’expression de Fam65b dans des LT primaires humains induit une augmentation de leur polarisation, leur adhésion et leur migration in vitro. Afin d’étudier son rôle dans un contexte plus physiologique, nous avons développé au laboratoire une souris Fam65b-/-, dans laquelle l’expression de Fam65b est supprimée dans le lignage T. Les lymphocytes T issus de ces souris présentent un contenu global en F-actine réduit, une plus grande quantité de L-sélectine et d’intégrines actives à leur surface, et une migration moins rapide et moins rectiligne que leurs équivalents WT. Nous n’avons pu observer, avec nos méthodes, aucune différence significative de polarisation, de migration in vitro ou d’entrée dans les organes lymphoïdes secondaires pour les LT Fam65b-/-. Nous avons identifié les Rho GTPases comme médiateurs de ces effets de Fam65b. Nous avons observé, en cytométrie de flux, que les niveaux de RhoA-GTP et de Rac-GTP sont plus élevés dans les LT murins Fam65b-/-, et que cela est aussi vrai pour RhoA-GTP dans les LT humains exprimant de faibles niveaux de Fam65b. Nous avons identifié, dans des expériences in vitro, le mécanisme par lequel Fam65b inhibe l’activité de RhoA, puisqu’il ralentit sa charge en GTP par les protéines GEF. Nous avons montré, par des techniques de biochimie, que l’activation de RhoA en aval d’une stimulation chimiokine est permise par la dissociation de RhoA et de Fam65b, probable conséquence de la phosphorylation de Fam65b. Cette dissociation a aussi été observée pour Fam65b et Rac1, mais les mécanismes mis en jeu restent à déterminer. D’autre part, l’expression de Fam65b est sous le contrôle du facteur de transcription FOXO1, connu pour son rôle dans le contrôle de l’écotaxie (homing) via la régulation de l’expression de molécules permettant l’entrée dans les ganglions lymphatiques. Fam65b, régulateur atypique de l’activité des Rho GTPases, représente donc un lien inédit entre la voie PI3K/FOXO1 et les Rho GTPases. / The motility of naive T lymphocytes between the blood and secondary lymphoid organs is essential to the efficiency of the adaptative immune response, and allows those cells to meet their cognate antigen. Numerous signaling pathways are involved in this phenomenon, such as Rho GTPases, modulators of the actin cytoskeleton. We have identified Fam65b as a new regulator of T lymphocytes recirculation. We have shown that a decrease of Fam65b expression in human primary T cells increases the morphological polarization, the adhesion and the in vitro migration of those cells. Looking for a more physiological model, we developed, in the lab, a Fam65b KO (Knock-Out) mouse, specific to the T lineage. In those animals, T cells showed decreased levels of F-actin, an increase in the display of L-selectin and integrins, and a slower and less straight migration, compared to WT (Wild-Type) T cells. On the other hand, we weren't able to see any significant differences in the morphological polarisation, the in vitro migration or the homing capacity of the Fam65b KO T cells. We have identified Rho GTPases as mediators of the effects of Fam65b. We showed, in flow cytometry, that the amount of RhoA-GTP and Rac-GTP are increased in the Fam65b KO cells. The RhoA-GTP levels are also increased in human primary T cells expressing low levels of Fam65b. We have identified, in in vitro experiments, that Fam65b slows down RhoA loading with GTP by its GEF proteins, thus inhibiting RhoA activity. Moreover, we showed that Fam65b dissociates from RhoA after chemokine stimulation of T cells, thus allowing RhoA activation. The phosphorylation of Fam65b is a probable cause to this phenomenon. Fam65b also dissociates from Rac1 in these conditions, although no mechanism is yet known. Furthermore, the transcription factor FOXO1 controls the expression of Fam65b. FOXO1 is also known to control the homing capacity of T cells, since it controls the expression of molecules involved in the entry of lymphocytes in the lymph nodes. Fam65b, an atypical regulator of Rho GTPases activity, thus represents a new connection between the PI3K/FOXO1 and the Rho GTPases pathways.

L’ATP extracellulaire, à travers l’activation du récepteur P2X7, joue un rôle important dans l’immunité inné comme signal de danger responsable de l’assemblage de l’inflammasome, de la migration des cellules immunitaires et de la mort cellulaire. Bien que le rôle de la voie ATP/P2X7 dans l’immunité adaptative reste sous-estimé, il a été rapporté que le récepteur P2X7 participe aux mécanismes de signalisation impliqués dans l’activation des lymphocytes T, leur prolifération et leur différentiation. Notre laboratoire a récemment montré que les lymphocytes T effecteurs (CD4+ ou CD8+) en fin de réponse immunitaire secondaire, exprimant à la membrane la tyrosine phosphatase de membrane B220, sont totalement résistant à l’activation du récepteur P2X7 à cause d’une perte d’adressage de ce récepteur à la membrane. Le but de ce travail de thèse est d’étudier la sensibilité des lymphocytes T, à différents stades d’activation, aux activités cellulaires induites par l’ATP, notamment le clivage de la molécule de homing CD62L ou L-sélectine, l’ouverture du canal ionique, la formation du pore et l’externalisation de la PS. Mes principaux résultats montrent que les activités cellulaires dépendantes du récepteur P2X7 sont dissociées. Les lymphocytes T au stade effecteur/mémoire sont moins sensibles au clivage de la molécule CD62L que les lymphocytes T au stade naïf et récemment activé. Les lymphocytes naïfs T récemment activé en réponse immunitaire primaire sont les plus sensibles à la formation du pore. De plus, les lymphocytes T récemment activés, aussi bien en réponse immunitaire primaire que secondaire, sont les plus sensibles à l’externalisation de la PS. Enfin, dans les lymphocytes T récemment activé, les activités de pore et d’externalisation de PS, mais pas le clivage de CD62L, sont dépendantes du taux de calcium. / Extracellular ATP through the receptor P2X7 (P2X7R) plays a key role in innate immunity as a danger signal that causes the activation of the inflammasome, enhancement of immune cell migration and cell death. Although the role of the ATP/P2X7R pathway in adaptative immunity remains underestimated, it has been reported that P2X7R regulates signaling events involved in T-cell activation, proliferation, and differentiation into effector lineages. Moreover, we have previously shown that effector T lymphocytes (either CD4+ or CD8+) that express the B220 isoform of CD45 at the plasma membrane at the end of the secondary immune response are totally resistant to ATP stimulation due to loss of P2X7R membrane expression. In the present study, we compared the sensitivity of T lymphocytes to cellular activities trigerred by P2X7R according to their stage of activation. Interestingly, our results showed that P2X7-dependent cellular activities are dissociated. T lymphocytes at effector/memory stage are less sensitive to CD62L shedding than naïve or recently activated T lymphocyte during primary immune response. Naive T lymphocytes recently activated during primary immune response are the most sensitive to pore formation. Furthermore, recently activated T lymphocytes at both primary and secondary immune responses are the most sensitive to PS externalization. Finally, pore formation, PS externalization but not CD62L shedding, are dependent on calcium signaling.

Target cell lysis is the hallmark of immune effector responses of cytotoxic T lymphocytes (CTL), natural killer (NK) cells, and monocytes. The most commonly used assay to measure target cell lysis is the 51Cr release assay and is considered the ‘gold standard’. However, this assay has many disadvantages that limit its use by most laboratories. Thus, several alternative assays have been developed. Some of these alternative assays are more sensitive, easy to perform and do not use radioactive elements. In this study, four of these assays were evaluated for their ability to detect antigen- specific CTL responses in equine blood. Three long-term equine arteritis virus (EAV) carrier stallions, two vaccinated stallions and one naïve stallion were included in this study. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from whole blood collected of these stallions to be used as effector cells. The PBMCs were stimulated with EAV in vitro for 7-10 days to generate antigen-specific effector cells. The granzyme B assay, the Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)/7-Aminoactinomycin D (7AAD) assay and the Lactate dehydrogenase (LDH) assay were performed using these effector cells and autologous equine dermal cells (isolated from each stallion) as target cells. The first two assays (i.e., granzyme B and CFSE/7AAD assays) were difficult to optimize for this study because they work well with non-adherent targets and require immediate flow cytometry analysis. The LDH assay, however detected CTL lysis in one of the two vaccinated stallions at day 99 post vaccination and no response was detected in PBMCs isolated from carrier stallions and control stallion. Based on these findings, the LDH assay is the most suitable assay since it works well with adherent target cells, it produces quantitative data, and is ideal for high-throughput screening.

Chronic inflammation is associated with carcinoma development in several clinical settings, and we sought to investigate the role of T cells in this phenomenon using the DMBA/TPA two-stage chemical carcinogenesis protocol. We demonstrate that, paradoxical to models of immunosurveillance, wild-type (WT) mice have a markedly higher rate of tumor formation relative to strains lacking CD8+ T cells. Adoptive transfers of antibody-coated magnetic bead-enriched peripheral CD8+ T cells into TCRáâ-/- mice confirmed that the increased mean tumor area and progression to carcinoma was attributable to the presence of CD8+ T cells. All analyzed strains of mice in which the CD8 compartment was intact (WT, CD4-/-) showed significant increases in tumor susceptibility. Putative tumor-promoting (T-pro) cells (TCRáâ+CD8+CD44+CD62L- tumor infiltrating lymphocytes, TILs) were directly compared to their phenotypic equivalents in peripheral blood lymphocytes (PBLs). In WT and CD4-deficient mice, CD8+ TILs consistently revealed a markedly higher relative expression, by RT-PCR, of IFNã, TNFá and COX-2, and a striking decrease in expression of perforin. Cytokine-bead analysis (CBA) comparison of CD8+ and CD4+ TIL in tumors from WT mice confirmed the increased expression by the CD8+ TIL of IFNã and TNFá. To our knowledge, this is the first demonstration of increased carcinogenesis attributable to CD8+ TILs, characterized by their high IFNã, TNFá, and COX-2 production and defective perforin production relative to phenotypically equivalent PBLs. These studies may have mechanistic implications for the role of T cells in inflammation-associated carcinogenesis.

Interest in cellular immunotherapy has increased with the recognition of the pivotal role that dendritic cells (DC) play in the adaptive immune system. The preparation of DC to present tumour antigens and subsequent induction of tumour specific T cells have been widely documented. This thesis studied the ability of cord blood (CB) stem cells to differentiate into functional CD34+DC, followed by the optimisation of electroporation of RNA into these cells. Total RNA derived from a leukaemic cell line and a primary human leukaemic sample was electroporated into CD34+DC DC and we were able to generate anti-leukaemic cytotoxic T lymphocytes (CTL). The CTL specifically targeted leukaemia but not normal cells. While the in vitro data showed promising results of the CTL specificity, a NOD-SCID model of human ALL was established to allow the CTL to be tested in vivo. We established a reproducible model of human ALL in NOD-SCID mouse using four primary human ALL samples. The adoptively transferred anti-leukaemic CTL into the ALL bearing NOD-SCID mice showed that ALL engraftment was significantly delayed. However, the addition of total RNA loaded CD34+DC DC did not enhance the in vivo CTL effect. Lastly, by dissecting the CTL response, we found that the polyclonal CTL were targeting survivin, HM1.24 and CT-7 antigens. The CTL clones generated from these polyclonal CTL showed high specificity for leukaemia but not normal cells. In conclusion, these preliminary data support the use of total RNA electroporated CD34+DC as a means of inducing anti-leukaemic CTL, and have demonstrated the efficacy of the CTL in a NOD-SCID model of ALL. This study has also provided insight into the polyclonal CTL response and future studies will likely continue along this path.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2002. / Härtill 4 uppsatser.