Résumé : La compréhension des contraintes qui régissent l'assemblage des machineries supramoléculaires – qu'elles soient solubles ou bien ancrées dans les membranes biologiques – est un enjeu scientifique majeur.Le système de de sécrétion type VI (T6SS) est un organelle bactérien récemment mis en évidence qui a pour particularité de posséder une origine évolutive commune avec le bactériophage T4. En raison de cette origine évolutive commune, certaines sous unités du T6SS et du bactériophage T4 présentent des structures comparables. Cependant, un grand nombre des sous unités du T6SS reste à caractériser. Parmi celles-ci, les protéines SciB et SciC sont retrouvées dans tous les systèmes de sécrétion de type VI suggérant que ces deux protéines participent à la formation du "core-complexe": le complexe minimal requis pour le fonctionnement du T6SS. / The recently identified type VI secretion system has been demonstrated to be involved in most of these processes. The T6SS is a highly complex macromolecular machine that allows Gram-negative bacteria to deliver effector proteins to both prokaryotic and eukaryotic cells in a contact-dependent manner. The T6SS promotes therefore antibacterial competition, virulence towards eukaryotes or even both. The T6SS is composed of a minimal set of 13 subunits, which are currently believed to form the core apparatus. They assemble two distinct sub-complexes: one is a cytosolic contractile structure related to the tail of contractile bacteriophages, whereas the other spans the whole cell envelope. Therefore, the T6SS is generally depicted as an inverted phage tail anchored to the cell envelope through its membrane-associated complex. Contractile tails are currently thought to assemble from four structural elements: the baseplate, the internal tube, the contractile sheath and the tail terminator. The aim of my Ph.D. work was to further characterize the assembly and function of the T6SS phage tail-like complex in enteroaggregative E. coli. In this thesis document, I provide evidence that the internal tube assembles from Hcp hexamers stacked in a head-to-tail manner and that this internal cylinder is used as a template during sheath assembly. I also characterized a sub-complex of three proteins (TssEFG) that forms the baseplate of the T6SS and controls the polymerization of the tube and sheath. Finally, I recently showed that the T6SS functions like a nano-crossbow to kill target cells as the contraction of the T6SS results in prey cell death during interbacterial competition.

La bactérie à Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène humain opportuniste qui peut causer des infections chroniques pouvant conduire à la mort des patients, et plus particulièrement ceux atteints de la mucoviscidose. Il a été montré qu‘un de ses trois systèmes de sécrétion de type VI (SST6) est actif durant les infections chroniques, le SST6-H1. P. aeruginosa est capable d'injecter des toxines de type bactériolytique directement dans le périplasme des autres bactéries à Gram-négatif grâce au SST6-H1, ce qui laisse penser que cette nanomachine pourrait être capitale dans la compétitivité de P. aeruginosa dans les niches polymicrobiennes, comme par exemple un poumon infecté. Cette nanomachine insérée dans l'enveloppe bactérienne est régulée au niveau post-traductionnel par une voie de phosphorylation ressemblant à celles des eucaryotes. Cette voie est constituée par une kinase, PpkA, et une phosphatase, PppA, qui modulent ensemble le niveau de phosphorylation de la protéine Fha1. Nous avons démontré que quatre protéines spécifiques de Pseudomonas appelées TagT, TagS, TagR et TagQ, agissent en amont du couple PpkA/PppA, et sont indispensables pour l'activation du SST6-H1. De plus, elles sont aussi nécessaires lors de compétitions entre P. aeruginosa et d'autres bactéries. Nous avons montré que TagR, connue comme étant une protéine périplasmique, est en fait associée à la membrane externe et cette localisation dépend de TagQ, une lipoprotéine ancrée dans le feuillet interne de la membrane externe. TagT et TagS forment un transporteur de type ABC qui a une activité d'ATPase. L'association de TagR à la membrane externe a été mise en évidence par des études de protéomique à haut débit qui avaient pour but la caractérisation des membranes externe et interne de P. aeruginosa. Grâce à l'analyse des résultats, unmodèle de l'assemblage du SST6-H1 au sein de l'enveloppe a pu être proposé. Ce travail a permis l'identification de plus de 1700 protéines, parmi elles un complexe multi-protéique incluant MagD, une protéine homologue à la macroglobuline humaine. Les résultats obtenus lors de la caractérisation de ce complexe sont aussi présentés dans ce manuscrit. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen that can cause severe infections and death in chronically infected cystic fibrosis (CF) patients. It has been shown that one of its three Type VI Secretion Systems (T6SS), the H1-T6SS, is active during chronic infections in CF patients. P. aeruginosa injects bacteriolytic toxins directly into other Gram-negative bacteria by means of its H1-T6SS, which could be of high importance in its outcome in complex niches such as an infected lung. This trans-envelope nanomachine is posttranslationally regulated by a eukaryotic-like phosphorylation pathway, which includes a kinase-phosphatase pair, PpkA and PppA, respectively. In this work, TagT, TagS, TagR and TagQ, Pseudomonas specific T6SS proteins that are encoded in the same operon as Ppka, PppA and Fha1, were analysed functionally and biochemically. We found that these four proteins are indispensable for the activation of H1-T6SS, by acting upstream of the phosphorylation checkpoint. Moreover, they were also needed for intra- and inter-species fitness mediated by H1-T6SS. We discovered that TagR, a periplasmic protein, associates with the outer membrane (OM) of P. aeruginosa in a TagQ-dependent manner. TagQ is an OM lipoprotein that faces the periplasm. TagT and TagS form a membrane-bound complex, an ABC transporter, with ATPase activity. TagR association with the OM was discovered by shotgun mass spectrometry analyses of the OM and the inner membrane (IM) of P. aeruginosa. In this work, the IM and OM sub-proteomes of P. aeruginosa are also presented, with highlights on T6SS global assembly. Moreover, these two sub-proteomes allowed the identification of a novel envelope-associated complex with macroglobulin-like protein, MagD. The studies concerning this protein and its partners in P. aeruginosa are also presented in this manuscript.

Le système de sécrétion de type VI (SST6) est un complexe multi-protéique permettant l’export d’effecteurs. Ce mécanisme est impliqué à la fois dans la virulence envers les cellules eucaryotes, dans l’activité antibactérienne mais également dans l’acquisition d’ions présents dans ’environnement. Ainsi, le SST6 joue un rôle important dans l’adaptation et la compétition, éléments essentiels dans la colonisation et la persistance au sein d’une niche écologique. Actuellement, très peu d’études portent sur l’importance du SST6 chez des souches environnementales, contrairement aux nombreuses études portant sur des pathogènes tels que Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia thailandensis, Vibrio cholerae ou Escherichia coli. Mon sujet de recherche avait pour objectif de caractériser le ou les rôles du SST6 de la souche environnementale Pseudomonas fluorescens MFE01. Ces travaux ont permis d’appréhender certaines fonctions du SST6 de cette souche. Le génome de MFE01 ne comporte qu’un seul cluster de gènes du SST6 où sont regroupés les gènes codant pour la machinerie du SST6 (le « core-component ») à l’exception des gènes hcp. Les protéines Hcp sont des éléments structuraux du SST6 dont elles forment le tube interne qui permet le transfert des effecteurs. Différents gènes hcp sont disséminés sur le chromosome et parmi ces « hcp » orphelins, hcp2 et hcp3 codent respectivement pour les protéines Hcp2 et Hcp3. Ces deux Hcp sécrétées par le SST6, sont associées à l’activité antibactérienne de MFE01 sur différentes souches pathogènes et environnementales, tels que P. aeruginosa, P. fluorescens MFN1032 et Pectobacterium atrosepticum. La protéine Hcp1, codée par le gène orphelin hcp1, est impliquée dans l’inhibition de mobilité de souche compétitrice. Hcp1 permettrait la sécrétion d’au moins deux toxines qui perturberaient l’assemblage du flagelle. Chez MFE01Δhcp1 et MFE01ΔtssC (TssC est un élément de la gaine contractile du SST6), ces toxines seraient accumulées dans le cytoplasme, inhibant ainsi ’assemblage de leur propre flagelle. La surproduction du régulateur FliA, qui contrôle notamment l’assemblage du filament flagellaire, restaure la mobilité chez ces deux mutants. En parallèle, le SST6 de la souche MFE01 est essentiel à la formation et la maturation de biofilm mais également à la compétition bactérienne en biofilm mixte. Ce système interviendrait dans la communication bactérienne indispensable au comportement social, requis lors de l’élaboration des biofilms. / Type VI secretion system (T6SS) is a multiproteic apparatus that secreted proteinaceous effectors. T6SS participate in a variety of functions, whose eukaryote virulence, antibacterial activity or metal ion uptake. These capacities conferring an advantage in adaptation and competition, crucial to colonization or persistence within ecological niche. As well, only a few studies have focused on the T6SS functions of environmental strains, contrary to numerous studies dealing with pathogens as Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia thailandensis, Vibrio cholerae or Escherichia coli. The purpose of my research project was to characterize the T6SS function(s) of the environmental strain Pseudomonas fluorescens MFE01. This work had led to understand the various functions of T6SS of MFE01 strain. This strain has a single T6SS cluster where all the core component proteins were gathered, except hcp genes. Three orphan hcp genes where found and are scattered in genome. Hcp proteins form the inner tube allowing effectors secretion. Both Hcp2 and Hcp3 proteins were involved in antibacterial activity on pathogens or environmental strains like P. aeruginosa, P. fluorescens or Pectobacterium atrosepticum. Characterization of Hcp1 proteins role constituted a major focus of this project. Hcp1 proteins participate to motility inhibition of competitive strains through T6SS. Hcp1 may be associated with secretion of at least two toxins perturbing the flagellar filament assembly. In MFE01Δhcp1 and MFE01ΔtssC mutants (Tss is a contractile sheath constituent), these toxins may be accumulated into cytoplasm and perturb assembly of their own flagella. Interestingly, overproduction of FliA flagellar regulator, which controls assembly of flagellar filament, restores motility of both mutants. Simultaneously, T6SS of MFE01 strain contributes to maturation and biofilm formation but also in bacterial competition within mixed biofilm. T6SS may be a mean of bacterial communication and thus coordinate a social behavior, primordial for biofilm formation.

Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif, ubiquiste de l'environnement. Ce pathogène opportuniste humain provoque sous sa forme planctonique des infections aiguës dont le facteur de virulence clé est le SST3. P. aeruginosa peut aussi se développer sous forme de biofilm où elle exprime entre autre le SST6-1 et induire des infections chroniques. L'expression ciblée des différents facteurs de virulence est liée à l'intégration de nombreux stimuli environnementaux transduits au moyen de systèmes à deux composants ou encore de messagers secondaires, comme le di-GMPc et l'AMPc, et conduisant à une régulation très fine, conférant une grande capacité d'adaptation à la bactérie. La nature, de même que les mécanismes impliqués dans la transduction du signal, n'ont pas encore été tous identifiés à ce jour. Le but de cette thèse était de décrypter ces mécanismes moléculaires de détection et de transduction du signal gouvernant la réponse adaptative de ce pathogène à son environnement au moyen de différentes approches : chémogénomique, mutagénèse aléatoire et d'étude d'isolat clinique. Lors de cette thèse, nous avons criblé deux chimiothèques commerciales à la recherche de molécules activatrices du SST3 et du SST6-1 et nous avons pu établir un test de criblage à haut débit robuste pour les criblages de plus larges banques de composés. En utilisant une souche avec deux rapporteurs, nous avons réalisé une banque de mutants par transposons et nous avons trouvé des mutants affectés dans leur expression du SST3, candidats intéressants pour identifier de nouveaux régulateurs du système. Enfin, grâce à l'analyse de l'isolat clinique CHA (issu d'un patient atteint de mucoviscidose), nous avons découvert qu'une délétion dans le gène codant pour le régulateur majeur GacS définissait le phénotype agressif de cette souche. / Pseudomonas aeruginosa is a gram negative bacillum present in several places. This opportunistic pathogen has the capacity to infect a wide range of hosts: plants, animals, humans. This bacterium, that shows an impressive adaptability relying on a multifactorial virulence, possesses two lifestyles. These lifestyles are associated with specific virulence patterns of expression. Under its planktonic form, P. aeruginosa can provoke acute infections thanks to the activation of T2 and T3SS or induces chronic infections in cystic fibrosis patients' lungs where it establishes a biofilm (communautary life). The expression of virulence factors is linked to the integration of several environmental cues that are transduced through two-component systems and secondary messengers like c-di-GMP and that lead to a fine tuned regulation. The nature and the mechanisms involved in this signal transduction remain largely unknown. The goal of this thesis was to decipher molecular mechanisms of signal detection and transduction that govern the adaptive pathogen response to host environment using the combination of a chemogenomics, random mutagenesis and study of clinical isolate. During this work, we screened two commercial libraries and set up a robust high throughput screening test to analyse huge molecules libraries. By setting up a double reporter-gene strain, we realized a transposon mutagenesis bank and identified interesting candidates with a down-regulated T3SS. Finally, the study of the particular clinical isolate CHA (from a cystic fibrosis patient), leads to the discovery that a deletion in the gene encoding for the important regulator GacS shapes the aggressive phenotype of this strain.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste extracellulaire. La souche PAO1 de P. aeruginosa possède trois loci codant des Systèmes de Sécrétion de Type VI (T6SS) indépendants, nommés H1 à H3-T6SS. Le premier d'entre eux, H1-T6SS, a été largement décrit dans la littérature scientifique et injecte des toxines à activité antiprocaryote dans d'autres bactéries permettant une défense active contre l'attaque d'un T6SS d'une autre bactérie. Les deux autres T6SS de P. aeruginosa sont probablement des facteurs de virulence de cette bactérie, mais aucun effecteur sécrété, ni cible intracellulaire ou rôle n'ont été proposés jusqu'ici. Dans ce travail de thèse, nous avons mis en évidence que la machinerie H2-T6SS permet l'invasion de cellules non-phagocytaires et participe à la virulence de P. aeruginosa. Cette entrée requière la dynamique du réseau de microtubules, via VgrG2b injectée par la machinerie H2-T6SS dans les cellules épithéliales, et capable de cibler les complexes de gamma-tubulines, centre nucléateur des microtubules. Il s'agit d'un mécanisme d'internalisation tout à fait original et jamais encore décrit. Nous avons également exploré la régulation croisée entre H2 et H3-T6SS. Enfin par une analyse de « RNAseq », nous avons observé entre les souches PAO1 et PA14 de P. aeruginosa une expression différentielle de nombreux gènes, certains codant des facteurs de virulence. Pour près de 30% d'entre eux, l'origine de cette variation reposerait sur une quasi-absence d'expression dans la souche PA14 de qslA, codant un anti-activateur du Quorum-Sensing. Ceci serait une nouvelle explication du phénotype hyper-virulent de la souche PA14 de P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic extracellular pathogen. The PAO1 strain of P. aeruginosa harbors three loci encoding independent Type VI Secretion Systems (T6SS), named H1 to H3-T6SS. H1-T6SS has been widely described in the literature and injects toxins with antiprokaryotic activity in target bacteria, allowing an active defense against the attack of a T6SS from another bacterium. The other two T6SS of P. aeruginosa are likely virulence factors, but no secreted effector or intracellular target or role have been proposed so far.In this work, we demonstrated that the H2-T6SS machinery triggered the invasion of non-phagocytic epithelial cells and is involved in the virulence of P. aeruginosa. This uptake is mediated by the microtubule network dynamics, and via VgrG2b, injected by the H2-T6SS machinery in epithelial cells, to target the gamma-tubulin complex, the microtubule nucleating center. This is an original mechanism of internalization never described before. We also studied the cross-regulation between H2 and H3-T6SS. Finally through a « RNAseq » analysis, we observed differential expression of many genes, including some encoding virulence factors, between PAO1 and PA14 strains of P. aeruginosa. For nearly 30% of them, the origin of this variation is an almost lack of expression in the PA14 strain of qslA, encoding an anti-Quorum Sensing activator. This can be a new explanation of hyper-virulent phenotype of the PA14 strain of P. aeruginosa.