Les intégrines sont des cibles thérapeutiques pertinentes en oncologie. Dans cette thèse, nous avons exploré le rôle de l’intégrine α5β1 dans les gliomes et les tumeurs du colon. Nous nous sommes particulièrement focalisés sur la voie intégrine-protéine p53 et son implication dans la résistance aux thérapies. Dans les gliomes, l’intégrine α5β1 est surexprimée dans les glioblastomes et participe à un mauvais pronostic de survie des patients. Nous avons démontré que l’intégrine confère une résistance à la chimiothérapie par le Temozolomide en régulant négativement l’activité de la protéine suppresseur de tumeurs p53. L’activation directe de p53 par un agent non-génotoxique, la Nutlin-3a, entraine une inhibition de l’expression de l’intégrine suggérant ainsi une réaction croisée négative entre intégrine α5β1 et p53. L’association de la Nutlin-3a avec un antagoniste de l’intégrine α5β1 entraine une mort des cellules par apoptose. Nous avons confirmé l’existence d’une réaction croisée négative entre intégrine α5β1 et protéine p53 dans les tumeurs du colon où l’intégrine représente également une cible thérapeutique. / Integrins seem to be attractive anti-cancer targets. In this work we investigated the role of integrin α5β1 in glioma brain tumors and colon cancer. We were particularly interested in the role of integrin α5β1/p53 pathway in resistance to therapy. We first focused on gliomas and found that α5β1 integrin was overexpressed in aggressive malignant glioma tumors. Moreover, we showed that α5β1 integrin upregulation was associated with a shorter patient survival. We also demonstrated that α5β1 integrin expression in glioblastomas participates to the resistance to the chemotherapeutic agent Temozolomide, through a negative regulation of the tumor suppressor p53. A direct p53-activation by the non-genotoxic agent Nutlin-3a down-regulated α5 integrin subunit and thus sensitized glioblastoma cells to Nutlin-3a. Furthermore, we demonstrated that the inhibition of α5β1 integrin with a concomitant p53-activation enhanced the effects of p53-based therapy. We also confirmed the existence of a negative cross-talk between α5β1 integrin and p53 in colon cancer.

Les gliomes malins de l’enfant (GME), de pronostic sombre, se distinguent des gliomes malins de l’adulte (GMA) sur le plan biologique mais aussi clinique, avec des taux de réponse au témozolomide (chimiothérapie alkylante de référence chez l’adulte) moindres. L’efficacité du temozolomide est réduite par l’action de l’enzyme de réparation de l’ADN, l’O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), dont l’expression est fréquemment inhibée par méthylation du promoteur de son gène dans les GMA. En première partie, la mise au point d’une nouvelle technique de PCR spécifique de méthylation a montré une fréquence plus faible dans les GME (15%) vs les GMA (45%, p<0,001). En deuxième partie, l’hypoxie intra-tumorale et la dérégulation en amont de l’axe mTOR-HIF-1α, connus pour être impliqués dans la chimio-résistance, ont été étudiés dans les GME et ciblés par l’association rapamycin-irinotecan dans une étude in vitro, pour laquelle des lignées dérivées de GME ont été développées. / Pediatric malignant glioma (PMGs), are associated with a very dismal prognosis. They are distinct from their adult counterparts (AMGs), biologically but also clinically, with a lower response to temozolomide (the current reference alkylating chemotherapy) compared to AMGs. Temozolomide efficacy is reduced by the activity of the DNA repair enzyme, O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), whose expression is frequently silenced by promoter methylation. First, the development of a new methylation-specific PCR showed a lower frequency of MGMT methylation in PMGs (15%) vs AMGs (45%, p<0,001). Secondly, intra-tumor hypoxia and the upstream deregulation of mTOR-HIF-1α axis, well-known to be involved in chemo-resistance and the up-regulation of MGMT expression, were studied in a PMG cohort. The targeting of this axis was then studied in vitro using a therapy combining rapamycin and irinotecan. For this, pediatric patient-derived malignant glioma cell lines were developed.

Comme nous l’indiquions dans le But du Travail, le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes afin de voir s’il était possible de proposer la gastrine et/ou la galectine 1 comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cas du mélanome. Notre stratégie de recherche est basée sur le principe (démontré sur le plan expérimental par de nombreuses études) selon lequel les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose, et sont dès lors protégées contre les effets pro-apoptotiques de la chimiothérapie et de la radiothérapie qui représentent la quasi totalité de l’arsenal thérapeutique dont disposent les oncologues pour combattre les cancers. Diverses études expérimentales ont démontré que le fait de réduire le taux de migration de cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose conférait à celles-ci une sensibilité accrue aux agents pro-apoptotiques. Nos résultats démontrent que la gastrine modifie de manière très significative les propriétés migratoires des cellules de mélanomes, sans toutefois modifier leur sensibilité à des agents pro-apoptotiques. Au contraire, la gastrine protègerait les cellules de mélanomes contre l’apoptose. Nous démontrons également dans notre travail, in vivo, un rôle pro-angiogénique pour la gastrine au sein de xénogreffes de mélanomes humains. Signalons que notre travail est le premier à démontrer un rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes, tout au moins sur le plan expérimental. Tout comme nous l’avons observé pour la gastrine, la galectine 1 semble également conférer aux cellules de mélanomes un certain degré de résistance aux agressions chimiothérapiques. Cette fois, le fait de diminuer le taux d’expression de la galectine 1 au sein de cellules du mélanome murin expérimental B16F10 (qui exprime des quantités importantes de galectine 1) renforce l’effet thérapeutique du témozolomide qui est une molécule cytotoxique. Cet effet semble survenir, tout au moins partiellement, suite à une diminution du taux d’expression de la protéine Hsp70 (suite à la diminution du taux d’expression de la galectine 1), avec pour conséquence une augmentation de la mort cellulaire par perméabilisation de la membrane des lysosomes. Nous proposons une nouvelle approche thérapeutique pour combattre les mélanomes en faisant appel à la technique des petits ARN interférants (siRNA), dirigés dans le cas présent contre la galectine 1.

Os gliomas são tumores que surgem a partir de células da glia e são considerados os mais comuns do sistema nervoso central. São subdivididos em quatro grupos: astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (grau IV ou GBM). Entre esses, o GBM é o tumor mais agressivo e mais freqüente. Apesar de ser encontrado em qualquer faixa etária, esse tumor é raro em crianças. Atualmente a cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ) tem sido utilizado como protocolo de tratamento padrão para a maioria dos pacientes e mesmo assim a sobrevida se mantem extremamente baixa. Além disso, grande parte dos pacientes não respondem ao tratamento com TMZ indicando a necessidade de agentes quimioterápicos alternativos. A zebularina (ZB) é um agente inibidor de DNA metiltransferases (iDNMTs) estável, pouco tóxico, que promove radiosensibilização e tem mostrado efeitos promissores em diversos tipos de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito dos efeitos da ZB em glioblastoma. Os objetivos deste trabalho foram analisar a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT em 5 amostras de substâncias brancas (SB), 6 linhagens de GBM e 33 amostras de gliomas (13 grau I, 2 grau II e 18 grau IV), correlacionar a expressão desses genes com os diferentes graus de gliomas e analisar os efeitos da ZB combinada ou não com TMZ em linhagens de GBM irradiadas e não irradiadas. Para análise da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo Real. Os ensaios de proliferação celular, clonogênico, radiação e apoptose foram realizados em 3 linhagens de GBM (U251, SF188 e T98G) e uma de fibroblastos (MRC5). Também foi realizado o ensaio de proliferação celular em 5 culturas primárias de GBM tratadas com zebularina. Os genes DNMT3A e MGMT mostraram expressão maior nas amostras de SB comparando-se com gliomas e linhagens de GBM. O gene DNMT3B foi mais expresso nas linhagens de GBM comparando-se com as SB. O gene DNMT1 não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas. Os ensaios de proliferação celular mostraram diminuição na proliferação com doses a partir de 50-100µM de ZB e de 250-500µM de TMZ nas linhagens e a partir de 50µM de ZB para as culturas primárias de GBM. As combinações de ZB com TMZ não mostraram sinergia na grande maioria das doses testadas. A ZB aumenta a apoptose nas 3 linhagens com doses a partir de 100µM. A ZB e TMZ mostraram diminuição na formação de colônias com as doses de 100µM e 10µM nas linhagens U251 e SF188 não irradiadas e irradiadas com 2, 4 e 6 Gy. A linhagem T98G expressa o gene MGMT, mostrou resistência a 10µM de TMZ e respondeu ao tratamento com 100µM de ZB. Também foi observado que 10µM de TMZ é mais citotóxico do que 100µM de ZB em fibroblastos não irradiados e irradiados (2Gy). Os resultados obtidos neste estudo mostram que a ZB pode representar um alvo terapêutico interessante para o estudo em glioblastoma. / Gliomas arise from glial cells and are the most common central nervous system tumors. They are divided in four groups: pilocytic astrocytoma (grade I), difuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and glioblastoma (grade IV or GBM). GBM is the most frequent and aggressive glioma. This type of tumor can occur in any age but its rare in children. Actually, surgery, radiotherapy and temozolomide (TMZ) adjuvant/concomitant chemotherapy has been the standard treatment protocol but the survival is extremely poor. In addition most patients do not respond to TMZ indicating the need for alternative chemotherapeutic agents. Zebularine (ZB) is a DNA metiltransferase inhibitor (DNMTi) stable, slight toxic that has been showed promise effects in cancer including radiosensitivity but little is known about ZB in glioblastoma. The objectives of this study were analyze DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT gene expression profile in 5 samples of normal brain, 6 GBM cell lines and 33 glioma samples (13 grade I, 2 grade II e 18 grade IV), correlate with different gliomas grades and analyze the effects of ZB isolate and in combination with TMZ in irradiated and non irradiated GBM cell lines. Gene expression assays was made using Real Time PCR. Proliferation, clonogenic, radiation and apoptosis assays were realized in three GBM cell lines (U251, SF88, T98G) and one fibroblast cell line (MRC5). We also made proliferation assays in 5 primary cultures of samples of GMB. MGMT and DNMT3A genes showed higher expression in normal brain compared to gliomas and GBM cell lines. DNMT3B gene showed higher expression in GBM cell lines compared with normal brain and DNMT1 showed no significant differences among samples analyzed. We observed decrease of cell proliferation from 50-100µM of ZB and 250-500µM of TMZ on GBM cell lines and from 50µM of ZB for primary GBM samples. It was not observed synergy in the most combinations doses of ZB and TMZ (Calcusyn software). It was observed that 100µM of ZB and 10µM of TMZ decrease colony formation on U251 and SF188 cell lines non irradiated and irradiated with 2, 4, and 6Gy. T98G that express MGMT, did not respond to TMZ but showed response to ZB. It was also observed that 10µM of TMZ is more cytotoxic than 100µM of ZB in fibroblast cell line non irradiated and irradiated with 2Gy. ZB increase apoptosis from 100µM on the three GBM cell lines. Results obtained in this study can indicate that ZB may be an interestig therapeutic target for future studies in glioblastoma.

Introdução: O glioblastoma multiforme é a neoplasia maligna primária mais prevalente do sistema nervoso central. Enquanto apresenta aumento em sua incidência, mantém a perspectiva de sobrevida global aproximada de 14 meses. Objetivos: O presente estudo objetiva avaliar a expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR-128a em neuroesferas (NE) e células aderidas (CA), a partir das linhagens celulares (T98G e U343) submetidas ao tratamento com temozolomida (TMZ) e com radiação ionizante (RI) isolados e em associação (TMZ+RI). Material e métodos: As linhagens celulares T98G e U343 foram tratadas com TMZ, RI e TMZ+RI. A verificação da expressão dos genes e miRNAs foi realizada utilizando o método de PCR em tempo real. Resultados: Observamos: a) o aumento na expressão do IDH1 após RI (4-fold) e TMZ+RI (5-fold) nas NE (T98G); o aumento na expressão do IDH2 (20-fold) nas NE (T98G), após TMZ, e do IDH2 (3-fold) nas CA (U343) submetidas à TMZ+RI; b) a redução na expressão do EGFR após TMZ; o aumento dessa expressão nas NE (T98G), após RI (2-fold) e TMZ+RI (3-fold), e a sua diminuição nas CA (U343) submetidas à TMZ e TMZ+RI; c) a redução na expressão PTEN nas NE (T98G), após TMZ e RI, e sua expressão nas NE (3-fold) frente à TMZ+RI; d) aumento na expressão de MGMT nas NE (T98G) nos grupos RI (10-fold) e TMZ+RI (25-fold). Quanto a expressão de miRNAs, foram identificados os seguintes resultados: a) as CA (U343) expressaram: miR-181b após TMZ (60-fold), RI (20-fold) e TMZ+RI (40- fold); e miR-128a após TMZ (500-fold), RI (200-fold) e TMZ+RI (600-fold); b) as NE (T98G) após TMZ+RI expressaram: miR-181b (30-fold), miR-149 (40-fold), miR-145 (300-fold) e miR-128a (40-fold); c) as NE (U343) após RI hiperexpressaram miR-149 e miR-145 (ambos em 4000-fold). Conclusão: A RI apresentou-se como fator independente e determinante para a radiorresistência das NE, entretanto não observamos ação de complementariedade de regulação dos oncomiRs observados sobre a expressão dos genes estudados. Esta é a primeira análise na literatura que correlaciona a expressão de genes e de miRNAs através das intervenções TMZ, RI e TMZ+RI sobre células aderidas e neurosferas. / Introduction: Glioblastoma multiforme is the most prevalent primary malignant neoplasm of the central nervous system. It has increased its incidence, while the overall survival remains over 14 months. Objectives: This study aims to evaluate the expression of the following genes EGFR, PTEN, MGMT and IDH1/2 and microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in adhered cells (AC) and neurospheres (NS) from cell lines (T98G and U343) which were submitted to temozolomide (TMZ) and ionizing radiation (IR), isolated and associated (TMZ + IR). Methods: The cell lines T98G and U343 were treated with TMZ, IR and TMZ+IR. The analysis of gene expression and miRNAs was performed using the PCR in real time. Results: This study demonstrated: a) an improvement in the expression of IDH1 after IR (4-fold) and TMZ + IR (5-fold) in the NS (T98G); increased expression of IDH2 (20-fold) in the NS (T98G) after TMZ and IDH2 (3-fold) in AC (U343) submitted to TMZ + IR; b) reduction in EGFR expression after TMZ; increase this expression in NS (T98G) after IR (2-fold) and TMZ + IR (3-fold), and a decrease in AC (U343) submitted to TMZ and TMZ + IR; c) reduction in PTEN expression in NS (T98G) after TMZ and IR, and its improvement in NS (3-fold) when compared to TMZ + IR; d) increase in the expression of MGMT in NS (T98G) in IR groups (10-fold) and TMZ + IR (25-fold). It was also identified the expression of miRNAs results as: a) AC (U343) expressed more miR-181b after TMZ (60-fold), IR (20-fold) and TMZ + IR (40-fold); and miR- 128a improved after TMZ (500-fold), IR (200-fold) and TMZ + IR (600-fold); b) NS (T98G) after TMZ + IR expressed: miR-181b (30-fold); miR-149 (40-fold); miR-145 (300-fold) and miR-128a (40-fold); c) NS (U343) after IR huge expressed miR-149 and miR-145 (both in 4000-fold). Conclusion: IR was an independent and determining radio resistance factor in NS. However, we observed no complementarity action of oncomiRs regulation. This is the first study in the literature correlating gene expression, and miRNAs through TMZ, IR and IR + TMZ interventions in AC and NS.

Os gliomas compreendem mais de 70% de todos os tumores cerebrais primários. Mesmo com tratamento agressivo, a média de sobrevivência relatada para estes tumores é geralmente menor do que 1 ano após o diagnóstico. A quimioterapia baseada em agentes alquilantes, como a temozolomida (TMZ), tem mostrado, em média, uma modesta resposta e pequeno aumento da sobrevida. As principais lesões causadas pela TMZ são os aductos N7-metil-G e N3-metil-A, que são processados pelo reparo por excisão de base (BER), compreendendo mais de 80% das lesões induzidas no DNA pela TMZ. Há evidência de que a resistência a este quimioterápico pode ser causada em parte por um eficiente processo de reparo via BER, mas poucos estudos têm focalizado essa abordagem. Metoxiamina (MX) é um inibidor do reparo via BER que tem sido atualmente investigado como um possível aliado no combate a vários tipos de tumores, aumentando os efeitos citotóxicos de drogas, tais como a TMZ. No presente trabalho, foram avaliadas as respostas celulares de células de glioblastoma (GBM) ao tratamento com a TMZ, associada ou não à MX. Foram analisados parâmetros como citotoxicidade (24 h, Kit XTT), sobrevivência celular (120 h, Kit XTT) e clonogênica (10 dias após o tratamento), danos no DNA pelo Ensaio Cometa (2, 6, 12 e 24 h), a indução de apoptose (24, 48 e 72 h) e alterações na expressão gênica e transcricional (24, 48 e 72h) de genes envolvidos na via de reparo por BER. Sob tratamento das linhagens de GBM (U87, U343, U251, U138 e T98G) a diferentes concentrações de TMZ (100 a 1000 M), o efeito citotóxico foi observado em células analisadas após 120 h, sendo que a linhagem T98G foi a mais resistente ao tratamento com TMZ e foi a única a apresentar diferenças significativas entre o tratamento sozinho e combinado (p 0,05). Assim, foi selecionada a linhagem T98G para os demais experimentos e estudar as possíveis vias implicadas na resistência a essa droga. A sobrevivência clonogênica das células T98G foi reduzida, sob tratamento com a TMZ (100 a 800 M), com diferença significativas para as concentrações superiores a 400 M. Observou-se que o efeito da TMZ foi acentuado quando associada ao inibidor, com diferenças significativas para todas as concentrações testadas. A droga induziu uma maior porcentagem de danos no DNA (Ensaio Cometa) para ambos os tratamentos (400 e 600 M) e nos tempos de 2 e 6 h, com diferenças significativas entre os tratamentos (TMZ e TMZ+MX), somente na concentração de 600 M/2 h. Entretanto esses danos se equipararam nos tempos seguintes. A indução de apoptose analisada nas células T98G mostrou a freqüência máxima de 24,2% no tempo de 72h, na concentração de 600 M de TMZ, enquanto que uma maior indução de apoptose (47,7%) foi observada para a mesma concentração no tratamento combinado (TMZ + MX), resultando em diferenças significativas. A análise de expressão gênica realizada para os genes APE1, FEN1 e XRCC1, mostraram que houve uma menor indução dos genes APE1 e FEN1 no tratamento combinado. A expressão da proteína APE1 (analisada por Western blot) foi menos intensa em todos os tempos de tratamento combinado (TMZ + MX), possivelmente pelo bloqueio dos sítios AP causado pelo inibidor MX. A proteína FEN1 mostrou-se menos expressa na comparação dos tratamentos, nos tempos de 48 e 72 h, indicando uma inibição de proteínas da via BER downstream à remoção de sítios AP por APE1, possivelmente pela ligação de MX. PCNA teve sua expressão protéica aumentada no tratamento combinado, nos tempos de 24 h, e principalmente em 48 h, sugerindo uma indução devida a um aumento de danos no DNA. Portanto, os resultados dos ensaios realizados com a associação da TMZ à MX demonstraram a influência do tratamento combinado sobre a expressão de proteínas envolvidas no reparo via BER, o que contribuiu para uma redução da capacidade proliferativa das células T98G em decorrência da maior indução de danos por aductos DNA-MX não reparados, resultando também em aumento de morte celular apoptótica. Esses dados mostram que a modulação do reparo via BER pode constituir uma estratégia promissora para aumentar a eficácia do tratamento com a TMZ, o que poderá futuramente embasar a escolha de procedimentos terapêuticos que resultem numa maior eficácia do tratamento de gliomas com agentes alquilantes. / Gliomas represent more than 70% of primary brain tumors. Even following an aggressive therapies, the mean survival rate of patients with these tumors is less than one year after diagnosis. Chemotherapy based on alkyklating agents, such as temozolomide (TMZ) has been reported to increase the survival rate. N7-metyl-G and N3-metyl-A adducts comprise more than 80% of the DNA lesions induced by TMZ and are processed by the base excision repair process (BER). There is evidence in the literature suggesting that the resistance to TMZ could be caused, in part, by an efficient repair by BER pathway, although few studies have focused on this subject. Metoxiamine (MX) is an effective BER inhibitor, which has been investigated as a conceivable treatment for different kinds of tumor, due to its synergistic effect with antitumoral drugs, such as TMZ. In the present study, the cellular responses to TMZ treatment associated or not with MX were evaluated in giloblastoma (GBM) cell lines. Several parameters were analyzed, such as cytotoxicity (24 h), cellular survival (120 h) and clonogenic efficiency (10 days after treatment), DNA damage and repair kinetics (after 2, 6, 12 and 24 h of recovery time), apoptosis induction (24, 48 and 72 h) and alterations in gene expression (24, 48 e 72h) for genes playing role in BER pathway. The treatment with TMZ 100 -1000 M (during 24 h) was cytotoxic for all GBM cell lines tested (U87, U343, U251, U138 and T98G), as analyzed after 120 h, with the T98G cell line being be the most resistant to TMZ; besides, T98G was the only one to present significant differences (p 0,05) in survival rates measured between TMZ treatment and TMZ combined with MX. Thus, T98G cells were selected for the subsequent experiments and for the study of the pathways implicated in TMZ resistance. The clonogenic efficiency of T98G cells was reduced under TMZ treatment (100 - 800 M) with significant differences for treatments above 400 M. In addition, the combined treatment TMZ plus MX significantly increased the cytotoxic effects, even for the lowest concentration. The comet assay showed higher percentage of DNA damage for both treatment modalities (TMZ and TMZ+MX) at 2 and 6 h of recovery, with significant differences between treatments for 2 h. Following 12 and 24 h of recovery, the amount of DNA damage reached the control levels, indicating the repair of DNA breaks. Apoptosis induction in T98G cells showed the highest frequency (24.2%) at 72h for 600 M TMZ, while the highest apoptosis induction (47.7%) was observed for the same concentration combined to MX. Quantitative gene expression analysis performed for three genes, APE1, FEN1 and XRCC1, showed a reduced expression of APE1 and FEN1 for the combined treatment. Western blot analysis demonstrated that APE1 was less expressed for all kind of treatments, probably due to AP-sites blockade caused by the inhibitor MX. In addition, FEN1 showed low levels of expression at 48h and 72h, indicating the inhibition of BER pathway downstream to the AP removal by APE1. On the other hand, PCNA expression was higher for the combined treatment (24h and mainly 48h), suggesting its induction probably due to increased DNA damage. Therefore, the present results demonstrated that the association of TMZ with MX interfered with the expression of proteins involved in BER, thus, reducing the clonogenic efficiency of T98G cells, probably as a consequence of the high production of unrepaired DNA-MX adducts, leading to cell death, including apoptosis. These data show that the modulation of BER is a promising strategy for magnifying the therapeutic impact of TMZ, and in the next future, this strategy may embrace the option to establish novel and efficient therapy protocols for the treatment of gliomas with alkylating agents.

Whilst progress has been made in reducing mortality in some cancers, mortality rates remain high in many cancers and there is a need to develop novel therapeutic strategies. In this thesis, various pharmacological strategies designed to enhance the activity of existing therapeutic drugs were evaluated. Cancer cells are dependent upon aerobic glycolysis (the Warburg effect) and glutamine uptake. Using clinically approved tyrosine kinase inhibitors and Bortezomib, significant enhancement of chemosensitivity was observed when used in combination with inhibitors of lactate dehydrogenase (Gossypol) and pyruvate kinase dehydrogenase (Dichloroacetate). In contrast, depletion of glutamine from media had to be extensive in order to induce cell death and cell death only occurred after prolonged exposure to glutamine-deprived conditions. This suggests that glutamine depletion strategies alone are unlikely to be successful but may be useful in combination with other agents targeting glutamine addiction in cancer cells. Finally, Temozolomide (TMZ) is an important drug in the treatment of glioblastomas but its activity is reduced by resistance mechanisms including O6 methyl guanine methyltransferase (MGMT) and mismatch repair (MMR). This thesis has identified analogues of TMZ (EA02-45, EA02-59, EA02-64 and EA02-65) that are MGMT and MMR independent in terms of inducing cell kill in vitro. These compounds are promising leads for future development. In conclusion, this thesis has demonstrated that interfering with the metabolic phenotype of cancer can enhance the activity of existing drugs and identified novel analogues of TMZ that circumvent drug resistance mechanisms that hamper the efficacy of TMZ.

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Introdução: O glioblastoma multiforme é a neoplasia maligna primária mais prevalente do sistema nervoso central. Enquanto apresenta aumento em sua incidência, mantém a perspectiva de sobrevida global aproximada de 14 meses. Objetivos: O presente estudo objetiva avaliar a expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR-128a em neuroesferas (NE) e células aderidas (CA), a partir das linhagens celulares (T98G e U343) submetidas ao tratamento com temozolomida (TMZ) e com radiação ionizante (RI) isolados e em associação (TMZ+RI). Material e métodos: As linhagens celulares T98G e U343 foram tratadas com TMZ, RI e TMZ+RI. A verificação da expressão dos genes e miRNAs foi realizada utilizando o método de PCR em tempo real. Resultados: Observamos: a) o aumento na expressão do IDH1 após RI (4-fold) e TMZ+RI (5-fold) nas NE (T98G); o aumento na expressão do IDH2 (20-fold) nas NE (T98G), após TMZ, e do IDH2 (3-fold) nas CA (U343) submetidas à TMZ+RI; b) a redução na expressão do EGFR após TMZ; o aumento dessa expressão nas NE (T98G), após RI (2-fold) e TMZ+RI (3-fold), e a sua diminuição nas CA (U343) submetidas à TMZ e TMZ+RI; c) a redução na expressão PTEN nas NE (T98G), após TMZ e RI, e sua expressão nas NE (3-fold) frente à TMZ+RI; d) aumento na expressão de MGMT nas NE (T98G) nos grupos RI (10-fold) e TMZ+RI (25-fold). Quanto a expressão de miRNAs, foram identificados os seguintes resultados: a) as CA (U343) expressaram: miR-181b após TMZ (60-fold), RI (20-fold) e TMZ+RI (40- fold); e miR-128a após TMZ (500-fold), RI (200-fold) e TMZ+RI (600-fold); b) as NE (T98G) após TMZ+RI expressaram: miR-181b (30-fold), miR-149 (40-fold), miR-145 (300-fold) e miR-128a (40-fold); c) as NE (U343) após RI hiperexpressaram miR-149 e miR-145 (ambos em 4000-fold). Conclusão: A RI apresentou-se como fator independente e determinante para a radiorresistência das NE, entretanto não observamos ação de complementariedade de regulação dos oncomiRs observados sobre a expressão dos genes estudados. Esta é a primeira análise na literatura que correlaciona a expressão de genes e de miRNAs através das intervenções TMZ, RI e TMZ+RI sobre células aderidas e neurosferas. / Introduction: Glioblastoma multiforme is the most prevalent primary malignant neoplasm of the central nervous system. It has increased its incidence, while the overall survival remains over 14 months. Objectives: This study aims to evaluate the expression of the following genes EGFR, PTEN, MGMT and IDH1/2 and microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in adhered cells (AC) and neurospheres (NS) from cell lines (T98G and U343) which were submitted to temozolomide (TMZ) and ionizing radiation (IR), isolated and associated (TMZ + IR). Methods: The cell lines T98G and U343 were treated with TMZ, IR and TMZ+IR. The analysis of gene expression and miRNAs was performed using the PCR in real time. Results: This study demonstrated: a) an improvement in the expression of IDH1 after IR (4-fold) and TMZ + IR (5-fold) in the NS (T98G); increased expression of IDH2 (20-fold) in the NS (T98G) after TMZ and IDH2 (3-fold) in AC (U343) submitted to TMZ + IR; b) reduction in EGFR expression after TMZ; increase this expression in NS (T98G) after IR (2-fold) and TMZ + IR (3-fold), and a decrease in AC (U343) submitted to TMZ and TMZ + IR; c) reduction in PTEN expression in NS (T98G) after TMZ and IR, and its improvement in NS (3-fold) when compared to TMZ + IR; d) increase in the expression of MGMT in NS (T98G) in IR groups (10-fold) and TMZ + IR (25-fold). It was also identified the expression of miRNAs results as: a) AC (U343) expressed more miR-181b after TMZ (60-fold), IR (20-fold) and TMZ + IR (40-fold); and miR- 128a improved after TMZ (500-fold), IR (200-fold) and TMZ + IR (600-fold); b) NS (T98G) after TMZ + IR expressed: miR-181b (30-fold); miR-149 (40-fold); miR-145 (300-fold) and miR-128a (40-fold); c) NS (U343) after IR huge expressed miR-149 and miR-145 (both in 4000-fold). Conclusion: IR was an independent and determining radio resistance factor in NS. However, we observed no complementarity action of oncomiRs regulation. This is the first study in the literature correlating gene expression, and miRNAs through TMZ, IR and IR + TMZ interventions in AC and NS.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Carlan da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / A relação entre a presença do Citomegalovírus Humano (HCMV) e diversos tipos de tumores tem sido alvo de investigação por décadas, e em especial, em Glioblastoma Multiforme (GBM). O GBM é o mais maligno tumor do Sistema Nervoso Central (SNC), com baixa sobrevida mesmo após o tratamento. Nosso grupo e outros demonstraram a presença do HCMV neste tipo de tumor restrita a uma pequena quantidade de células, além disso, vários mecanismos de aumento de malignidade tumoral mediados pelo HCMV já foram demonstrados in vitro e in vivo. As principais drogas utilizadas durante o tratamento quimioterápico, Temozolamida (TMZ) e Carmustina (BCNU), levam a adição de adutos no DNA, criando erros durante a replicação celular. Estudos demonstram que o HCMV pode modular vias de reparo de DNA em fibroblastos, entretanto, o possível efeito durante a quimioterapia não é conhecido. Com isto, neste trabalho avaliou-se a infecção viral de linhagens celulares de GBM bem como a resposta das mesmas ao tratamento com TMZ e BCNU. Demonstrou-se que linhagens de GBM U87MG, A172, U251MG e TP365MG são suscetíveis a infecção por HCMV, mas não igualmente permissíveis as linhagens virais laboratoriais (AD169) e clínica (TB40), provavelmente refletindo a infectividade do vírus nos tumores. Observou-se também uma diminuição na viabilidade celular nas linhagens TP365MG e U251MG infectadas com HCMV, de maneira dependente da multiplicidade de infecção (MOI). Na presença concomitante de drogas e vírus também ocorre a diminuição de viabilidade MOI dependente, especificamente em TP365MG tratada com BCNU. Em suma, os resultados indicam que a permissibilidade do HCMV em células de GBM é determinada por fatores celulares/hospedeiro e não por fatores virais. Por fim, o vírus também não aumenta a resistência ao tratamento por TMZ e BCNU em linhagens U251MG e TP365MG, entretanto, devido a heterogeneidade tumoral mais estudos são necessários em outros tipos celulares, especialmente em células tronco tumorais, levando a um melhor entendimento do possível efeito do vírus durante o tratamento quimioterápico / The relationship between the Human Cytomegalovirus (HCMV) and different types of tumors has been investigated for many decades, especially in Glioblastoma Multiforme (GBM). GBM is the most malignant tumor of the Nervous Central System (SNC), with a low overall survival even after treatment. We and others demonstrated the presence of HCMV in this type of tumor, restricted to a small number of cells, and various studies showed that the virus can increase cell malignancy both in vitro and in vivo. The chemotherapeutic agents Temozolomide (TMZ) and Carmustine (BCNU) used in GBM treatment lead to insertion of adducts in the DNA, creating errors during replication. It is well known that HCMV can modulate DNA repair pathways in fibroblasts, however, the possible effect of the virus during chemotherapy is not known. In this work we analyzed viral infection in GBM cell lines and their response to the TMZ and BCNU. We demonstrated that A172, U251MG and TP365MG GBM cell lines are susceptible to HCMV infection, but not equally permissive to both laboratory (AD169) and clinical strains (TB40), likely reflecting infection in the tumor. Additionally, we show a decrease in cell viability in TP365MG and U251MG infected with HCMV, in a MOI dependent manner. In infected and treated with chemotherapeutic drugs cells, there is also a reduction in cell viability MOI dependent in TP365MG treated with BCNU. Overall our results indicate that HCMV permissiveness in GBM cells is determined by host/cellular rather than viral factors and that the virus does not increase cell resistance to chemotherapeutic drugs in U251MG and TP365MG. Due to the tumor heterogeneity, more studies need to be performed in other tumor cells, especially in cancer stem cells, to lead to a better understanding of the possible effect of the virus during chemotherapy.