A lesão medular traumática é uma patologia incapacitante, ainda sem tratamento eficaz. As terapias celulares representam uma nova estratégia para o tratamento destas lesões. As células-tronco adultas são fontes potenciais para o transplante celular com o objetivo de minimizar a lesão e promover a recuperação de tecidos lesados, como a medula espinhal. O objetivo desta tese foi avaliar a eficácia do transplante de células-tronco adultas na recuperação funcional e regeneração da lesão medular traumática em modelo experimental de lesão medular contusa em ratas fêmeas Wistar. Os principais objetivos foram: a) comparar os efeitos do transplante da fração mononuclear de sangue de cordão umbilical humano e de células-tronco mesenquimais dos vasos da parede do cordão umbilical humano; b) determinar a janela terapêutica deste tipo de intervenção, comparando os implantes de células- tronco realizados 1 hora, 24 horas e 9 dias após a lesão; c) demonstrar a possível diferenciação das células-tronco implantadas, bem como sua integração no tecido lesado. Os resultados obtidos demonstraram que o transplante de células foi mais eficaz para a recuperação funcional da lesão medular em ratas Wistar quando realizado pela via de administração local 1h após a lesão, quando comparado com a administração na cisterna magna e a aplicação 9 dias a lesão. O tratamento com a fração de células mononucleares ou com as células-tronco mesenquimais do sangue do cordão umbilical 24h após a lesão, não apresentou resultado funcional significativo.Observou-se a neuroproteção do tecido medular quando foi realizado o transplante de células-tronco mesenquimais 1h após a lesão medular. As células humanas transplantadas migraram e sobreviveram no local da lesão quando administradas na cisterna magna ou quando administradas diretamente no local da lesão, porém não se diferenciaram em células gliais ou neurônios. Concluímos que o transplante de células-tronco adultas promoveu a recuperação funcional após a lesão medular contusa, principalmente quando realizado 1h após a lesão diretamente no local da lesão. Apesar das células transplantadas sobreviverem na área da lesão, não foi evidenciada diferenciação celular. / Spinal cord injury is a debilitating disease and yet no effective treatment is available. In this framework cell therapy represents a new strategy to treat this condition. Adult stem cells are potential sources for cell transplantation in order to minimize injury and promote the recovery of damaged tissues, such as the spinal cord. The purpose of this Thesis was to evaluate the action of adult stem cells in the regeneration and functional recovery of spinal cord injury in experimental contusion spinal cord injury in female Wistar rats. Main goals were: a) to compare the effects of transplantation of the mononuclear cells of human umbilical cord blood and mesenchymal stem cells of the vessel wall of human umbilical cord; b) to determine the therapeutic window of this type of intervention, comparing the stem cell implants performed 1 hour, 24 hours and 9 days after injury; c) to demonstrate the possible differentiation of cells implanted, as well as their integration into the damaged tissue. Results reported demonstrate that the transplantation of stem cells was more effective for functional recovery of spinal cord injury when performed into the site of the lesion 1 h after injury, as compared with administration in the cisterna magna 9 days after injury. Treatment with mononuclear cells and mesenchymal cells from umbilical cord blood 24 hours after injury, not showed functional outcome. Neuroprotection was observed when mesenchymal stem cells were transplanted 1 hour after spinal cord injury. The transplanted human cells survived and migrated to the site of injury either when administered in the cisterna magna or directly onto the injury site, but did not differentiated into glial cells or neurons. It is suggested that the transplantation of adult stem cells promotes functional recovery after spinal cord injury when performed 1 hour after injury directly at the injury site, however differentiation of transplanted cells was not detected.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Julia de Miranda Moraes.pdf: 2895250 bytes, checksum: e061f736f6922f781b2c671bf4f90f32 (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / The aim of this work was to evaluate the regeneration of equine ulnar nerves submitted to neurotomy, silicone tubing and cell therapy with bone marrow mononuclear cells fraction (MCF) or adipose derived mesenchymal stem cells (ADSC). Fifteen adult horses were divided into three groups with five animals each: control group (CG) with the use of saline solution, group with FCM deposition and group with ADSC deposition. The same surgical procedure was performed in all groups, using both nerves of each animal (right and left), establishing two moments of biopsy: on the 13th week on the right limb (CG1, MCF1 and ADSC1) and on the 26th week on the left limb (CG2, MCF2 and ADSC2). The MCF and ADSC were obtained respectively, from bone marrow and adipose tissue from each animal, both used as an authologous implant. After 13 and 26 weeks, biopsies were performed in all groups and immediately it was made some fragments slide imprints for viewing the nanocrystal fluorescent label. The fragments were fixed in 10% buffered formalin for histological analysis, with HE, luxol fast blue, Masson's trichrome, immunohistochemistry against the antibodies neurofilament (NF), S-100, FGF-2 and GDNF. Microscopically it was observed the presence of axonal growth, connective tissue, inflammatory infiltrate, Schwann cells, neural growth factors, myelin sheath and wallerian degeneration. For histologic analysis, it was established qualitative scores and for immunohistochemistry it was performed quantitative analysis with Image J program. It was observed wallerian degeneration reduction, better fascicular reorganization, new collagen increased, myelin sheath early formation, and NF antibody stronger staining in the experimental groups compared to CG. The ADSC group presented the best results than the other groups, showing ADSCs efficiency compared to MCF and CG for peripheral nerve regeneration. However, it was proved a longer time necessity to occur complete regeneration of peripheral nerve after injury. / Este trabalho teve por objetivo avaliar a regeneração do nervo ulnar de equinos, submetidos à neurotomia, tubulização com tubo de silicone e terapia celular com fração de células mononucleares da medula óssea (FCM) ou células-tronco mesenquimais do tecido adiposo (ADSC). Foram utilizados 15 equinos adultos alocados em três grupos, com cinco animais em cada: grupo controle (GC) com utilização de soro fisiológico; grupo com deposição de FCM; e grupo com deposição de ADSC. Foi realizado o mesmo procedimento cirúrgico em todos os grupos, utilizando-se os dois nervos de cada animal (direito e esquerdo), e estabelecido dois momentos de biopsia: na 13ª semana com biopsia no membro direiro (GC1, FCM1 e ADSC1) e na 26ª semana com biopsia no membro esquerdo (GC2, FCM2 e ADSC2). A FCM e a ADSC foram obtidas respectivamente, da medula óssea e tecido adiposo de cada aninal, ambos utilizados como implantes autólogos. Após 13 e 26 semanas, realizaram-se as biopsias de todos os grupos e imediatamente, faziam-se imprints dos fragmentos para visualização do marcador fluorescente nanocristal. Os fragmentos foram fixados em formol tamponado a 10%, para análise histológica, com as coloraçãoes de HE, luxol fast blue, tricrômio de Masson e imuno-histoquímica com os anticorpos neurofilamento (NF), S-100, FGF-2 e GDNF. Microscopicamente avaliou-se a presença de proliferação axonal, tecido conjuntivo, infiltrado inflamatório, células de Schwann, fatores de crescimento neurais, bainha de mielina, e degeneração walleriana. Para a análise histológica estabeleceram-se escores qualitativos e para a imuno-histoquímica realizou-se análise quantitativa com o programa Image J. Foi observada diminuição da degeneração walleriana, melhor reorganização fascicular, aumento do colágeno novo, início de formação de bainha de mielina, além de maior marcação do anticorpo NF nos grupos experimentais em relação ao GC. O grupo ADSC apresentou melhores resultados em relação aos demais, enfatizando a eficiência das ADSCs em relação à FCM e ao GC para a regeneração nervosa periférica. Porém, há a necessidade de um tempo maior para ocorrer completa regeneração do tecido nervoso periférico após lesão.

A sepse causa uma alta taxa de mortalidade no mundo. A fisiopatologia da doença envolve uma rede complexa de mediadores inflamatórios que promovem a lesão de diversos tecidos, além de diversas alterações hemodinâmicas e disfunção do sistema nervoso autonômico (SNA). Assim sabe-se que o sistema nervoso cumpre um papel importante no controle da inflamação sistêmica mediante a via colinérgica anti-inflamatória (VCA) através do receptor nicotínico de acetilcolina alfa7 (alfa7nAChR). O uso das células-tronco mesenquimais (CTM) tem mostrado efeitos benéficos em diversos ensaios clínicos de doenças inflamatórias. Neste contexto, as células-tronco mesenquimais derivadas da geleia de Wharton do cordão umbilical (CTM-GW) tornam-se promissórias, uma vez que essas células são reconhecidas pela regulação da resposta imunológica, reparação neural, efeito anti-apoptose, assim como a melhora da sobrevida na sepse, em modelos experimentais. Nossa hipótese foi de que as CTM-GW poderiam cumprir um papel neuroimunomodulador através da VCA e atenuar a disfunção de múltiplos órgãos em um modelo animal de sepse de ligadura e punção do ceco (LPC). Inicialmente células da matriz do cordão umbilical foram isoladas e caracterizadas de acordo com o consenso internacional vigente. Ratos Wistar machos adultos foram subdivididos em grupos: 1) sham (operação simulada); 2) LPC; 3) LPC+CTM-GW (injetado 106 CTM-GW via intraperitoneal, i.p. 6 h após LPC) e 4) LPC+MLA+CTM-GW (MLA: Metillicaconitine, antagonista do alfa7nAChR, i.p., 5:30 h após LPC e 106 CTM-GW 6h após). Às 24 horas após LPC, foram avaliadas a função cardiovascular, hemodinâmica assim como os outros parâmetros. Interessantemente, o tratamento com CTM-GW na sepse atenuou a disfunção diastólica e protegeu a sensibilidade baroreflexa. Além disso, as CTM-GW estimularam a atividade autonômica, simpática e parassimpática no coração. Observamos que o tratamento celular induziu uma regulação da expressão do receptor alfa7nAChR e TLR4 no baço e no coração, assim como a redução da relação p-STAT3TYR705 e STAT3 total no baço. Outros efeitos importantes e adicionais foram a diminuição da infiltração de leucócitos e a regulação das citocinas pró-inflamatórias pelas células. O bloqueio da VCA usando MLA confirmou que o receptor alfa7nAChR pode ser um provável alvo, chave da ação das CTM entre vários outros mecanismos envolvidos na resposta imune. Finalmente, as CTM-GW conseguiram reduzir a apoptose no pulmão e no baço independentemente da VAC reforçando o conceito de que as células-tronco tem efeitos diversos além da imuno-regulação. Em conclusão, as CTM-GW na sepse foram capazes de atenuar a lesão cardiopulmonar assim como modular a atividade autonômica, reduzindo a inflamação sistêmica, pelo menos em parte, através da via colinérgica anti-inflamatória. Indubitavelmente todos estes efeitos anteriormente descritos e em associação se demonstraram fundamentais no mecanismo de reparo e proteção tecidual em resposta a sepse. Mais estudos pré-clínicos e futuros testes clínicos precisam ser realizados para maior compreensão destes mecanismos bem como uma possível validação terapêutica / Sepsis induces organ dysfunction due to overexpression of the inflammatory host response, involving cardiorespiratory and autonomic dysregulation, thus increasing the associated morbidity and mortality. The cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) is mediated by nervous system through alpha7 nicotinic acetylcholine receptor (alpha7nAChR). This receptor has an important role in systemic inflammation control. Wharton\'s jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) are known to express genes and secreted factors related to neurological and immunological protection, as well as to improve survival in experimental sepsis. We hypothesized that WJ-MSCs play a modulatory role through the CAP and attenuate sepsis-induced organ injury in a cecal ligation and puncture (CLP) model. Rats were randomly divided into 4 groups: 1) Control (sham-operated); 2) submitted to CLP without treatment; 3) submitted to CLP and treated with 106 WJ-MSCs 6 h later and 4) CLP+MLA+WJ-MSC group (MLA: Methyllycaconitine, alpha7nAChR antagonist). All experiments were performed 24 h post-surgery. Echocardiographic parameters and heart rate variability were assessed. Importantly, treatment with WJ-MSCs attenuated diastolic heart failure and recovered barorreflex sensitivity. Moreover, WJ-MSCs injection increased cardiac sympathetic and cardiovagal activity. In cardiac and splenic tissue, WJ-MSC treatment downregulated TLR4 and alpha7nAChR expression, as well as it reduced p-STAT3/Total STAT3 ratio in the spleen. In addition, WJ-MSC reduced leukocyte infiltration and pro-inflammatory cytokines, which only were abolished by MLA treatment. Finally, WJ-MSC treatment diminished apoptosis in lung and spleen tissue. Together these findings suggest that treatment with WJ-MSCs appears to protect against sepsis-induced organ injury reducing systemic inflammation, at least in part, through cholinergic anti-inflammatory pathway

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é caracterizada pela limitação persistente de trocas gasosas, usualmente progressiva e associada a uma resposta inflamatória crônica exacerbada das vias aéreas a partículas e gases nocivos. Apesar de prevenível e tratável, não se logrou até o presente uma terapêutica eficaz, que resulte na cura da doença. Neste cenário, a terapia celular apresenta-se como uma alternativa terapêutica potencialmente promissora em DPOC, bem como em outras doenças pulmonares degenerativas e de caráter inflamatório. Porém, vários aspectos da terapia celular carecem de um melhor entendimento. Um dos principais desafios ao sucesso da terapia celular são as baixas taxas de sobrevivência das células transplantadas. O Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1 - PAI-1) pode representar um potencial mediador da sobrevivência de células estromais mesenquimais (CTM) pós-transplante, pois tem sido proposto que anticorpos neutralizadores do PAI-1 auxiliam no aumento da sobrevivência de CTM no tecido-alvo da terapia celular. Desta forma, a diminuição dos níveis de PAI-1 possui um potencial terapêutico interessante, ao modular os principais processos envolvidos na criação de um ambiente pouco propício ao \"homing\" celular durante o processo de injúria. A diminuição dos níveis de PAI-1 é promovida, pela sinvastatina, fármaco da família das estatinas. Desta forma, objetivou-se com este trabalho analisar os efeitos da sinvastatina sobre a expressão do PAI-1, bem como sua influência na sobrevivência das células infundidas para terapia celular de enfisema pulmonar em modelo murino. Camundongos da linhagem FVB foram submetidos à instilação intranasal de elastase para indução de enfisema pulmonar e, posteriormente, tratados com CTM do tecido adiposo e sinvastatina. Os resultados mostraram que, quanto aos aspectos morfológicos e funcionais, considerando-se a análise conjunta de ambos os pulmões, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos submetidos à instilação intranasal de elastase e submetidos à terapia celular com CTM tratados ou não com sinvastatina. Quando porém os pulmões foram analisados individualmente constatou-se que não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e os resultados referentes ao lado direito do pulmão dos animais tratados com elastase e que receberam sinvastatina e infusão de CTM. Diferenças anatômicas entre os lados direito e esquerdo do pulmão, levaram a uma maior deposição de células no lado direito, como evidenciado pelos resultados obtidos nos ensaios de bioluminescência. Pode-se, portanto, inferir que a recuperação morfológica no lado direito do pulmão de animais com DPOC/enfisema poderia ser decorrente de um efeito regenerativo parácrino das CTM associadas à sinvastatina. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease - COPD is characterized by the persistent limitation of gas exchange, is usually progressive, and associated to a chronic augmented inflammatory response of the airways to particles and noxious gases. Despite preventable e treatable, an effective, curative therapeutic approach is yet to be achieved. In this context, cell therapy presents itself as a promising therapeutic approach for COPD and other pulmonary inflammatory and degenerative diseases. However, many aspects of cell therapy with stem cells remain unclear. One of the major challenges to the success of cell therapy are the low survival rates of transplanted cells. The Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1) is a potential mediator of the survival of mesenchymal stromal cells (MSC) after transplantation, since PAI-1 neutralizing antibodies have been shown to increase the survival rate of MSC in the target tissue of cell therapy. Thus, the decreased levels of PAI-1 has an interesting therapeutic potential to modulate key processes involved in creating an inhospitable environment, during the process of injury, to the homing of transplanted cells. Decreased levels of PAI-1 are promoted by simvastatin, a drug of the statins family. Thus, the goal of this work was to evaluate the effect of simvastatin in vivo on the expression of PAI-1, as well as its influence on the survival rate of infused cells in mice model of cell therapy for pulmonary COPD/emphysema. FVB mice were submitted pulmonary emphysema induction by means of intranasal instillation of elastase and than treated with adipose-derived mesenchymal stem cells and simvastatin. The results regarding morphological and functional aspects, when considering the analisys of both lungs, presented no statistically significant difference among the groups submitted to intranasal instillation of elastase and cell therapy with MSC, treated or not with simvastatin. However, when the lungs where analyzed individually, it was found that there was no statistically significant difference between the control group and the results regarding the right lung of animals treated with elastase and that received simvastatin and MSC infusion. Anatomical differences between the right and left sides of the lung lead to a higher deposition of cells in the right side, as observed in the bioluminescence assays. Thus, it is possible to infer that the morphological recovery in the right side of the lung of animals with DPOC/emphysema could be due to a regenerative paracrine effect of mesenchymal stem cells associated with simvastatin.

Previous studies have reported that combination of electroacupuncture (EA) and mesenchymal stem/stromal cells (MSC) promoted survival, differentiation and functional recovery in spinal cord-transected rats. In this study, it was examined the therapeutic effects of stem cells from canine exfoliated dental pulp (SCED) combined with EA treatment in dogs with chronic naturally occurred spinal cord injury due to intervertebral disc herniation (IVDH). Dogs were randomly assigned to four experimental groups (n=4 for each group; total of 16 animals): SCED, EA, SCED + EA) and control. Mild increase in the neurological scoring was found in one animal from SCED group (1/4; 2 points gained), one from EA group (1/4; 8 points gained), three from SCED+EA group (3/4; 16 points gained) and one from control group (1/4; 2 points gained). Functional outcome improvements were observed two animals from SCED group (2/4; 3 points gained), two from EA group (2/4; 4 points gained), one from SCED+EA group (1/4; 1 point gained) and two were from control group (2/4; 6 points gained). However no statistical differences were observed. Magnetic resonance imaging (MRI) findings did not suggest improvement comparing pre- and post-treatment within groups, excepted from one animal from SCED group (1/4), and 10 animals from all groups (10/16) presented signs of injury progression in the SCI in post-treatment exam, which could not be associated to the procedures from study, but could be related to the natural evolution of the disease. Limitation such as number of transplanted stem cells, delivery route, injury chronicity and intrinsic variation among naturally spinal cord injured dogs could have influence outcomes negatively. Moreover, canine deciduous exfoliated teeth were easily obtained and SCED were simply isolated, and no mortality followed up 7 month from procedure were observed. / Estudos anteriores demonstraram que a associação da eletroacupuntura e células-tronco mesenquimais/estromais (CTMs) pode promover a sobrevivência e diferenciação das CTMs, assim como recuperação funcional em ratos com transecção da medula espinal. Neste estudo, foram avaliados os efeitos terapêuticos da associação de células-tronco derivadas de polpa de dente decíduo esfoliado de cães (CPDEc) e eletroacupuntura (EAP) em cães com lesão de medula espinhal crônica causada de forma natural por herniação do disco interververtebral. Os cães foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n=4 para cada grupo; total de 16 animais): CPDEc, EAP, CPDEc+EAP e grupo controle. Foram encontradas pequenas melhoras na pontuação do exame neurológico em um animal do grupo CPDEc (1/4; 2 pontos ganhos), um do grupo EAP (1/4; 8 pontos ganhos), três do grupo CPDEc+EAP (3/4; 16 pontos ganhos) e um do grupo controle (1/4; 2 pontos ganhos). Na avaliação funcional, pequenas melhoras também foram observadas em dois animais do grupo CPDEc (2/4; 3 pontos ganhos), dois do grupo EAP (2/3; 4 pontos ganhos), um do grupo CPDEc+EAP (1/4; 1 ponto ganho) e dois do grupo controle (2/4; 6 pontos ganhos). No entanto, não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. Os achados ressonância magnética não sugeriram melhoras comparando os exames pré e pós tratamento entre os grupos, com exceção de um animal do grupo CPDEc (1/4), e 10 animais dentre todos os grupos (10/16) apresentaram sinais de progressão na lesão da medula espinhal, que não puderam ser associados com os procedimentos do estudo, mas podem estar relacionados à progressão natural da doença. Além disso, os dentes decíduos esfoliados foram obtidos facilmente e as CPDEc foram isoladas de forma simples, ademais, não foi observada nenhuma mortalidade foi observada até 7 meses após o procedimento.

Fontes alternativas de células β têm sido estudadas para o tratamento de Diabetes mellitus tipo 1, dentre as quais a mais promissora consiste das células-tronco diferenciadas em células produtoras de insulina (IPCs). Alguns trabalhos demonstram a capacidade de células-tronco embrionárias murinas (mESCs) de formarem estruturas semelhantes a ilhotas pancreáticas, porém, os níveis de produção de insulina são insuficientes para a reversão do diabetes em camundongos diabetizados. Este trabalho visa desenvolver um protocolo adequado para geração de IPCs e contribuir para a identificação e caracterização funcional de novos genes associados à organogênese pancreática. Logo no início da diferenciação das mESCs em IPCs, foi possível verificar o surgimento de células progenitoras, evidenciado pela expressão de marcadores importantes da diferenciação beta-pancreática. Ao final do processo de diferenciação in vitro, ocorreu a formação de agrupamentos (clusters) semelhantes a ilhotas, corando positivamente por ditizona, que é específica para células β-pancreáticas. Para avaliar seu potencial in vivo, estes clusters foram microencapsulados em Biodritina® e transplantados em camundongos diabetizados. Apesar dos níveis de insulina produzidos não serem suficientes para estabelecer a normoglicemia, os animais tratados com IPCs apresentaram melhores condições, quando comparados ao grupo controle, tendo melhor controle glicêmico, ganho de massa corpórea e melhor aparência da pelagem, na ausência de apatia. Além disso, análise dos clusters transplantados nestes animais indicou aumento da expressão de genes relacionados à maturação das células β. Porém, quando estes clusters foram microencapsuladas em Bioprotect® e submetidos à maturação in vivo em animais normais, ocorreu um aumento drástico na expressão de todos os genes analisados, indicando sua maturação completa em células beta. O transplante destas células completamente maturadas em animais diabetizados, tornou-os normoglicêmicos e capazes de responder ao teste de tolerância à glicose (OGTT) de forma semelhante aos animais normais. A segunda parte do trabalho visou analisar genes diferencialmente expressos identificados em estudo anterior do nosso grupo, comparando, através de DNA microarray, mESCs indiferenciadas e diferenciadas em IPCs. Um dos genes diferencialmente expressos é aquele que codifica para a Purkinge cell protein 4 (Pcp4), sendo 3.700 vezes mais expresso em IPCs. Para investigar o possível papel do gene Pcp4 em células β e no processo de diferenciação β-pancreática, adotou-se o enfoque de genômica funcional, superexpressando e inibindo sua expressão em células MIN-6 e mESCs. Apesar da alteração na expressão de Pcp4 em células MIN-6 não ter interferido de forma expressiva na expressão dos genes analisados, quando inibido, modificou o perfil da curva de crescimento celular, aumentando seu tempo de dobramento de forma significativa e diminuindo da viabilidade celular em ensaios de indução de apoptose. Já na diferenciação de mESCs em IPCs, a superexpressão de Pcp4 interferiu de forma positiva apresentando uma tendência a aumentar a expressão dos genes relacionado à diferenciaçãoβ-pancreática. Concluindo, desenvolvemos um novo protocolo de diferenciação de mESCs em IPCs as quais foram capazes de reverter o diabetes em camundongos diabetizados e descrevemos, pela primeira vez, o gene Pcp4 como sendo expresso em células β-pancreáticas, podendo estar relacionado à manutenção da viabilidade celular e maturação destas células. / New cellular sources for type 1 Diabetes mellitus treatment have been previously investigated, the most promising of which seems to be the insulin producing cells (IPCs), obtained by stem cells differentiation. Some reports show that murine embryonic stem cells (mESCs) are able to form islet-like structures, however, their insulin production is insufficient to render diabetic mice normoglycemic. This work aims at developing an adequate protocol for generation of IPCs and searching for new genes which could be involved in the pancreatic organogenesis process. Early on during mESCs differentiation into IPCs, we observed the presence of progenitor cells, which were able to express pancreatic β-cell markers. At the end of the differentiation process, the islet-like clusters positively stained for the insulin-specific dithizone. These clusters were microencapsulated in Biodritin® microcapsules, and then transplanted into diabetized mice. Although the levels of insulin production were insufficient for the animals to achieve normoglycemia, those which received IPCs displayed improved conditions, when compared to the control group, as judged by a better glycemic control, body weight gain and healthy fur appearance, in the absence of apathy. In addition, when these transplantated clusters were retrieved, high levels of expression of the genes related to β-cell maturation were detected. IPCs were also microencapsulated in Bioprotect® and subjected to in vivo maturation in normal animals. A dramatic increase of the analyzed genes expression was observed, indicating complete maturation of the differentiated cells. When these cells were transplanted into diabetized mice, these animals achieved normoglycemia and were able to display glucose tolerance test (OGTT) response very similar to that of normal mice. In the second part of this work, we analyzed upregulated genes described in previous work from our group, comparing undifferentiated mESCs to IPCs using a microarray platform. One of these genes is that coding for the Purkinje cell protein 4 (Pcp4), which is 3,700 more expressed than in undifferentiated mESC cells. We adopted a functional genomics approach to investigate the role played by the Pcp4 gene in β-cells and in β-cell differentiation, by inducing overexpression and knocking down this gene in MIN-6 and mESC cells. Although the differential expression of Pcp4 in MIN-6 was not able to interfere with the expression of the genes analyzed, we observed different cell growth rates, with increased doubling time and decreased cell viability when its expression was knocked down. In addition, overexpression of Pcp4 in mESCs subjected to differentiation into IPCs apparently increases the expression of genes related to β-cell differentiation. In conclusion, we developed a new protocol for ESCs differentiation into IPCs, which is able to revert diabetes in diabetized mice, and we also describe here, for the first time, the Pcp4 gene as being expressed in pancreatic β-cells and possibly being related to maintenance of cell viability and β-cell maturation.

Tesis por compendio / [ES] La lesión medular (LM) es un trastorno neurológico devastador y debilitante que se caracteriza por un grado variable de disfunción motora, sensorial y/o autonómica permanente. El trasplante de células madre neurales (NSC) ofrece una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de la LM al proporcionar neuroprotección y neuroregeneración. Sin embargo, el entorno generado tras la lesión limita el potencial terapéutico de las terapias celulares al dar lugar a una escasa supervivencia y engraftment de las células y a una diferenciación inadecuada. Además, las terapias celulares han mostrado hasta la fecha una recuperación funcional limitada en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se ha postulado el uso de terapias combinatorias para superar estas limitaciones y potenciar los beneficios terapéuticos de las terapias celulares. En esta tesis doctoral, se han estudiado distintas estrategias de combinación con el trasplante de NSC, como el uso de fármacos y biomateriales, con el objetivo de mejorar y potenciar el efecto de la terapia celular en el rescate de la actividad neuronal, en la modulación del proceso inflamatorio, en la supervivencia del trasplante, así como en su integración y diferenciación en el tejido medular. Así, En el capítulo 1 evaluamos la terapia combinada de células madre neurales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-NSCs), células madre mesenquimales (MSCs) y un nanoconjugado de curcumina (PA-C) en un modelo de LM subagudo, proporcionando un mayor grado de neuroprotección en comparación con los tratamientos individuales. En el capítulo 2 desarrollamos una estrategia mínimamente invasiva mediante el uso de un scaffold de ácido hialurónico en forma de semi-luna para el transplante de iPSC-NSCs combinado con PA-C. Así, los análisis histológicos demostraron que el tratamiento combinado de iPSC-NSCs y la PA-C presentaban una mayor preservación de fibras neuronales en la zona de la lesión y una reducción de la extensión de la cicatriz fibrótica. Por último, en el capítulo 3 se describe una estrategia terapéutica que se aproxima más a la traslación clínica mediante el trasplante de progenitores neurales fetales humanos (hfNPCs) condicionados previamente con una forma conjugada del inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS). Así, la combinación de las hfNPCs con el PGA-SS-FAS favoreció la migración del transplante en el tejido medular, la preservación de las interneuronas somatosensoriales Lbx1 inhibitorias y las Tlx3 excitatorias, así como la activación neuronal alrededor del epicentro de la lesión. Así pues, en la presente tesis doctoral se estudia y describe el beneficio aportado por tres estrategias combinatorias, que incrementan los efectos neuroprotectores proporcionados por la terapia celular en el tratamiento de lesiones medulares agudas y sub-agudas. / [CA] La lesió medul·lar (LM) és un trastorn neurològic devastador i debilitant que es caracteritza per un grau variable de disfunció motora, sensorial i/o autonòmica permanent. El trasplantament de cèl·lules mare neurals (NSC) ofereix una eina terapèutica prometedora per al tractament de la LM proporcionant neuroprotecció i neuroregeneració. Tot i això, l'entorn generat després de la lesió limita el potencial terapèutic de les teràpies cel·lulars donant lloc a una escassa supervivència i engraftment de les cèl·lules i a una diferenciació inadequada. A més, les teràpies cel·lulars han mostrat fins ara una recuperació funcional limitada als assajos clínics. Per tant, s'ha postulat l'ús de teràpies combinatòries per superar aquestes limitacions i potenciar els beneficis terapèutics de les teràpies cel·lulars. En aquesta tesi doctoral, s'han estudiat diferents estratègies de combinació amb el trasplantament de NSC, com ara l'ús de fàrmacs i biomaterials, amb l'objectiu de millorar i potenciar l'efecte de la teràpia cel·lular en el rescat de l'activitat neuronal, en la modulació del procés inflamatori, en la supervivència del trasplantament, així com en la seva integració i diferenciació al teixit medul·lar. Així, Al capítol 1 avaluem la teràpia combinada de cèl·llules mare neurals humanes derivades de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC-NSCs), cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i un nanoconjugat de curcumina (PA-C) en un model de LM subagut, proporcionant un major grau de neuroprotecció en comparació dels tractaments individuals. Al capítol 2 desenvolupem una estratègia mínimament invasiva mitjançant l'ús d'un scaffold d'àcid hialurònic en forma de semilluna per al trasplantament d'iPSC-NSC combinat amb PA-C. Així, els anàlisis histològics mostraren que el tractament combinat d'iPSC-NSCs i la PA-C incrementaba la preservació de fibres neuronals a la zona de la lesió i reduïa l'extensió de la cicatriu fibròtica. Finalment, al capítol 3 es descriu una estratègia terapèutica que s'aproxima més a la translació clínica mitjançant el trasplantament de progenitors neurals fetals humans (hfNPCs) condicionats prèviament amb una forma conjugada de l'inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS. Així, la combinació de les hfNPCs amb el PGA-SS-FAS va afavorir la migració del trasplantament al teixit medul·lar, la preservació de les interneurones somatosensorials Lbx1 inhibitòries i les Tlx3 excitatòries, així com l'activació neuronal al voltant de l'epicentre de la lesió. Així doncs, en aquesta tesi doctoral s'estudia i descriu el benefici aportat per tres estratègies combinatòries, que incrementen els efectes neuroprotectors proporcionats per la teràpia cel·lular en el tractament de lesions medul·lars agudes i sub-agudes. / [EN] Spinal cord injury (SCI) is a devastating and debilitating neurological disorder characterized by a variable degree of permanent motor, sensory and/or autonomic dysfunction. Neural stem cell (NSC) transplantation offers a promising therapeutic tool for the treatment of SCI by providing neuroprotection and neuroregeneration. However, the environment generated after injury limits the therapeutic potential of cell therapies by resulting in poor cell survival and engraftment and inadequate differentiation. In addition, cell therapies have shown limited functional recovery in clinical trials to date. Therefore, the use of combinatorial therapies has been postulated to overcome these limitations and enhance the therapeutic benefits of cell therapies. In this doctoral thesis, we have studied different combination strategies with NSC transplantation, such as the use of drugs and biomaterials, with the aim of improving and enhancing the effect of cell therapy in the rescue of neuronal activity, in the modulation of the inflammatory process, in the survival of the transplant, as well as in its integration and differentiation in the medullary tissue. Thus, In Chapter 1 we evaluated the combined therapy of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells (iPSC-NSCs), mesenchymal stem cells (MSCs) and a curcumin nanoconjugate (PA-C) in a subacute LM model, providing a higher degree of neuroprotection compared to single treatments. In Chapter 2, we developed a minimally invasive strategy by using a demilune hyaluronic acid scaffold for combined transplantation of iPSC-NSCs with PA-C. Thus, histological analyses demonstrated that the combined treatment of iPSC-NSCs and PA-C exhibited increased preservation of neuronal fibers in the lesion area and a reduction in the extension of the fibrotic scar. Finally, Chapter 3 describes a therapeutic strategy that more closely approximates clinical translation by transplanting human fetal neural progenitors (hfNPCs) preconditioned with a conjugated form of the Rho/Rock inhibitor fasudil (PGA-SS-FAS). Thus, the combination of hfNPCs with PGA-SS-FAS favored transplant migration within the spinal parenchyma, preservation of endogenous inhibitory Lbx1 and excitatory Tlx3 somatosensory interneurons, as well as endogenous neuronal activation around the lesion epicenter. Thus, this PhD thesis studies and describes the benefit provided by three combinatorial strategies, which increase the neuroprotective effects provided by cell therapy in the treatment of acute and sub-acute spinal cord injury. / This research was funded by Fundació Marató TV3 2017/refs.20172230, 20172231 and 20172110; FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación–Agencia Estatal de Investigación “RTI2018- 095872-B-C21/ERDF”, Agencia Valenciana de Innovación (AVI) INNVAL10/19/047 and TERCEL (RD12/0019/0011) funds from the Instituto de Salud Carlos III of Spain; Science by Women program, Women for Africa Foundation to HE and the grants FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-B-C21 and –C22/ERDF]; RISEUP project FetOpen in H2020 Program: H2020-FETOPEN-2018-2019-2020-01 and by Grants RTI2018-095872-B- C21 and PDI2021-1243590B-I00/ERDF funded by MCIN/AEI//10.13039/501100011033 and by ERDF A way of making Europe). This project was also funded by Project 964562 (RISEUP), H2020 FetOpen program / Bonilla Villamil, P. (2022). Study of Combinatorial Cell Therapy and Neuroprotective Agents for the Treatment of Spinal Cord Injury in Experimental Models [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191500 / Compendio