Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Camila Franca de Paula Orlando.pdf: 1812062 bytes, checksum: 8b3001c0be3ec49195d2cf8246dbc1ee (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The regeneration of peripheral nerves after injury has been target in researches for new technologies that lead to good results, so as to get completely restoration of nerve function. For such, many techniques have been developed using synthetic materials associated to exogenous factors that enhance the regeneration process, as mononuclear cells of bone marrow. Thus, the development of this study aimed to evaluate the peripheral nerve regeneration capacity after surgical induction of an acute lesion on tibial nerve in New Zealand rabbits, with the association of tubulization technique to the inoculation of mononuclear cells collected from autologous bone marrow. First chapter showed a detailed literature review about nerve injuries, mechanisms of regeneration and main surgical techniques for nerve repair. Moreover, it described about cell therapy, especially mononuclear cells for peripheral nerve regeneration. Mononuclear cells were removed from the bone marrow through punction of the humeral tubercule and were purified to be inoculated at the site of injury. In Chapter two, the rabbits were clinically evaluated, after 60 days, about the functional recovery after surgical neurectomy. For that, twenty four New Zealand rabbits were allocated in two groups with twelve animals each, designated mononuclear cell group (MCG) and saline solution group (SSG). In both groups, the rabbits were submitted to tibial nerve section and reparation through the tubulization technique, using silicone hollow tube. Later, mononuclear cells and saline solution were put within the tube in MCG and GSS, respectively. The gait evaluation was performed and also planimetry of the footprint of the pelvic member, which was printed on paper with water-based ink applied to the foot surface before (M0) and after 7 (M7), 15 (M15), 30 (M30), 45 (M45) and 60 (M60) days after the surgical procedure.The results showed that there was not functional recovery of the tibial nerve in both groups, without difference between them, at different times and at the moments between groups, except when they were compared with M0. In chapter three, the aim of the study was to verify histologically if the mononuclear cells of the bone marrow, associated with the tubulization technique, helped in regeneration of the tibial nerve of rabbits. After 60 days of surgery of surgery, the animals were euthanised and samples of the nerves were collected and fixed in 10% buffered formalin solution and Karnovisky solution, for the analysis by optical microscopy and electron microscopy. In optical microscopy the presence and intensity of inflammatory infiltration, hemosiderin granules, granulomas, blood vessels, cell density and collagen were evaluated. The electron microscopy performed descriptive analysis of the nucleus of Schwann cells and the conformation of myelin sheath. Furthermore, morphometric analysis of the cellular elements was performed using the program Image J. Results suggested that the mononuclear cells of the autologous bone marrow did not lead to benefits for the regeneration of the tibial nerve in rabbits. NOTE: Essay 4 chapters. Presented summary of the 1st chapter / A restauração de nervos periféricos após lesões ou doenças congênitas vem sendo alvo de pesquisas sobre novas tecnologias que tragam bons resultados, chegando-se ao ponto de recuperar totalmente a atividade funcional de um nervo. Para isso, ter se estudado o uso de materiais sintéticos associados com inoculação exógena de fatores que auxiliam no processo de regeneração, assim como células mononucleares de medula óssea. Com o desenvolvimento deste estudo objetivou-se avaliar a capacidade de regeneração nervosa periférica após defeito agudo do nervo tibial de coelhos da raça Nova Zelândia, corrigido mediante a técnica de tubulização, associada ou não à inoculação de células mononucleares autólogas de medula óssea no sitio da lesão. No primeiro capítulo realizou-se uma revisão de literatura ampla e detalhada acerca das lesões de nervos periféricos, os mecanismos de regeneração e as técnicas cirúrgicas empregadas na reparação de nervos periféricos. Além disso, relatou-se sobre a terapia celular bem como a utilização das células mononucleares na terapia de regeneração de nervos periféricos. No capítulo dois avaliou-se clinicamente se houve recuperação funcional nos coelhos após 60 dias da neurectomia cirúrgica. Foram utilizados para isto, 24 coelhos da raça Nova Zelândia, alocados em dois grupos com 12 animais cada, denominados grupo células mononucleares (GCM) e grupo solução salina (GSS). Os coelhos foram submetidos à secção do nervo tibial direito e reparação por meio da técnica de tubulização utilizando tubo oco de silicone, para então, receberem no interior do tubo células mononucleares autólogas de medula óssea no GCM e solução salina no GSS. Foram realizadas avaliações da marcha e planimetria da pegada do membro pélvico, antes (M0) e após o 7º (M7), 15º (M15), 30º (M30), 45º (M45) e 60º (M60) dias de procedimento cirúrgico. Os resultados mostraram que não houve a recuperação funcional do nervo em ambos os grupos, sem diferença entre eles nos diferentes momentos e entre os momentos dentre dos grupos, exceto quando comparado com M0. No capítulo três o objetivo foi utilizar análises histológicas e morfométricas para verificar se as células mononucleares autólogas de medula óssea associadas à técnica de tubulização auxiliam na regeneração do nervo tibial de coelhos. As células mononucleares foram retiradas da medula óssea por meio da punção no tubérculo umeral e purificadas para serem inoculadas como mencionado no capítulo dois. Após 60 dias do procedimento cirúrgico, os animais foram submetidos à eutanásia e as amostras do nervo foram colhidas e fixadas em formalina tamponada a 10% e solução de Karnovisky, para análise por microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão. Na microscopia óptica foram avaliadas a presença e intensidade de infiltrado inflamatório, grânulos de hemossiderina, granulomas, vasos sanguíneos, densidade celular e colágeno. Na microscopia eletrônica foram realizadas análises descritivas do núcleo das células de Schwann e a conformação da bainha de mielina. Além disso, foi realizada análise morfométrica dos elementos celulares empregando o programa Image J. Os resultados sugeriram que as células mononucleares não trouxeram benefícios na regeneração do tecido nervoso, porém, podem ter se diferenciado no tecido de sustentação trazendo benefícios para a regeneração nervosa. OBS: Dissertação com 4 capítulos. Apresentado resumo do 1º capítulo.

Apesar do desenvolvimento da tecnologia envolvendo o campo da regeneração em nervos periféricos, ainda não existe uma técnica para recuperação do tecido nervoso que apresente resultados totalmente satisfatórios, fato que desperta o interesse de vários pesquisadores em todo mundo e representa um desafio para os cirurgiões que realizam procedimentos reconstrutivos e estéticos. Embora o enxerto autólogo de nervo seja a melhor alternativa para a recuperação de nervos periféricos lesados, as técnicas que envolvem o reparo tubular têm alcançado excelentes resultados através da utilização de materiais sintéticos e biológicos, sob a forma de tubos, no reparo de extensos segmentos nervosos. Hoje, através dos avanços da engenharia tecidual, novos materiais estão em desenvolvimento, com o objetivo de aliar características microscópicas às técnicas cirúrgicas existentes. O colágeno, que é sabidamente um elemento promotor da proliferação celular e do reparo tecidual, tem sido amplamente utilizado em estudos de regeneração nervosa. Da mesma maneira, o ácido poli-láctico-poli-glicólico (PLGA), um copolímero sintético, tem apresentado algumas características favoráveis ao processo de regeneração, como biocompatibilidade e propriedades mecânicas adequadas. Com o propósito de facilitar a regeneração nervosa quando ocorre perda tecidual, uma técnica já difundida pode ser destacada: o enxerto de veia invertida, em que a veia jugular externa é utilizada ao avesso, funcionando como um tubo, criando um microambiente para a regeneração nervosa, através da exposição de elementos fundamentais da camada mais externa do vaso (túnica adventícia). Neste trabalho, agregamos como diferencial a utilização de dois tipos de membranas, especialmente desenvolvidas para fins odontológicos, que visam neoformação óssea, em um estudo que visa à regeneração de um nervo periférico misto, o nervo isquiático. As membranas de colágeno e PLGA foram colocadas na região do enxerto, sob a forma de tubo, com o objetivo de recuperar um segmento de 10 mm do nervo referido. E, por fim, aliamos a utilização de um segmento de 5 mm da veia jugular externa como tecido de preenchimento dos tubos feitos com as membranas, na tentativa de verificar a eficácia das moléculas biológicas presentes neste vaso, porém agora sendo utilizadas diretamente dentro do enxerto. Após um período de 6 semanas, o grupo que apresentou o melhor resultado foi aquele em que foi utilizada a membrana de colágeno, na forma de tubo, preenchida com a veia jugular externa. Nesse grupo, o diâmetro médio das fibras mielínicas apresentou um valor médio de 5,8 µm e espessura média da bainha de mielina de 1,65 µm. Para o período de 12 semanas, entre os grupos analisados, o maior valor médio encontrado para o diâmetro foi de 5,64 µm e 1,31 µm para a espessura, sendo que este resultado foi apresentado pelo grupo em que se utilizou a membrana de PLGA sem preenchimento com a veia jugular. Embora os valores não sejam muito inferiores, nos dois períodos, ficaram abaixo dos valores encontrados nos grupos controle normais. Em suma, acreditamos que as membranas de colágeno e PLGA, associadas à técnica de tubulização, apresentam grande potencial para serem utilizadas na regeneração de nervos periféricos. / Despite the development of technology involved in peripheral nerve regeneration, there is no technique that presents a recovery of the nervous tissue with completely satisfactory results. This fact arouses interest of several researchers around the word. Although the autologous nerve grafting is the current gold standard for the repair of large nerve gaps, over the past decades the development of artificial nerve conduits has therefore been of great interest due to the excellent results achieved. Through the advances in tissue engineering, new materials, synthetic and biological, have been used for construct nerve guides. The collagen is one of the oldest natural polymers used as a biomaterial, and it is known as a promoter of cell proliferation and of tissue repair. In the same way, the synthetic copolymer, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), have been used for nerve regeneration, and it have shown some favorable characteristics to nerve repair such as stability, biocompatibility, and mechanical properties. With the purpose of facilitating the regeneration in large nerve gaps, the inside-out vein graft is a widespread technique, where the vein works as a conduit, and it provides a good microenvironment for axon regeneration through the exposition of some primordial elements of its adventitial layer. In this work, we join as a differential the use of two materials, specially developed for dental purposes, which are normally used to facilitate the osteogenesis, in a nerve regeneration study. We performed the surgical procedures in the sciatic nerve, with two types of membranes (PLGA and collagen), which were used as tubes, in order to promote the regeneration of this nerve. The collagen and PLGA membranes were used with the objective of a recovery in a 10-mm sciatic nerve gap model. These tubular implants were filled with a 5 mm segment of the jugular vein in order to verify the effectiveness of some biological molecules of the adventitia layer in the nerve regeneration. After 6 and 12 weeks the graft and the distal stump were observed under light microscopy. In each studied period, the diameters of the myelin fibers, and the thickness of the myelin sheaths of the regenerated axons were measured. After 6 weeks, the group which presented the best result was the group with the collagen membrane tube filled with the external jugular vein. In this group the diameter of the myelin fibers presented an average value of 5.8 µm and an average value of the thickness of the myelin sheaths of 1.65 µm. After 12 weeks, between all the groups, the best results were found in the group where the PLGA membrane unfilled with the external jugular vein was used as a nerve guide, which presented the average diameter of 5.64 µm, and the average thickness of 1.31 µm. Although the average values werent much lower than the values found in the controls, they were beneath than the normal groups. These results proved that the collagen and the PLGA membranes have a great potential to be used as artificial nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.

As qualidades biofísicas do U.S.P. levaram-nos a estimar o efeito do mesmo sobre a regeneração de um nervo periférico. Este estudo foi levado a efeito sobre a axotomia experimental do nervo ciático de ratos. Para tal finalidade estimulamos por 12 dias consecutivos, durante 20 minutos o coto proximal dos nervos axotomizados. A morfologia foi avaliada comparativamente entre cortes semifinos corados pelo azul de toluidina e cortes ultra finos à microscopia eletrônica, dos cotos proximais de nervos estimulados e não estimulados. A avaliação morfométrica das estruturas, baseou-se na contagem diferencial das fibras; da espessura da bainha de mielina e da área dos axônios das fibras tipo A, mediante o emprego de um software especializado ( Image Tool). Os achados morfológicos e a análise estatística dos dados morfométricos são altamente sugestivos de que o U.S.P. estimula a regeneração de nervos periféricos. / The biophysical qualities of pulsed ultrasound led us to appraise it¢s effect on the regeneration of a peripheral nerve. In this study our intention was to evaluate the effects of pulsed ultrasound on the axotomy of the ciatic nerve in rats. The proximal stump of the nerve was stimulated on 12 consecutive days with pulsed ultrasound and the effects of the sonication were evaluated through morphologic and morphometric techniques. Our findings suggest that sonication leads to a rapid regeneration of the nerve after axotomization. These affirmations are based on the counting of different types of fibre components in mixed nerves and the morphologic recovery of the same in comparasion with nerves of animals submitted to sham operation.

As lesões dos nervos periféricos, que inervam os músculos esqueléticos, evoluem para perdas da propriocepção e alterações na morfologia e função das fibras musculares, causando um impacto negativo na qualidade de vidas dos indivíduos. Tais lesões implicam em alteração na expressão de genes específicos do músculo, como por exemplo, na MyoD e Miogenina, atuantes na ativação de células satélites e reguladores da massa muscular A técnica cirúrgica de tubulização é um recurso empregado na prática clínica para tratamento de músculos que sofreram desnervação. O objetivo do presente estudo foi analisar se a técnica de tubulização com o preenchimento de gordura altera a expressão de Myod e Miogenina, a morfometria do músculo sóleo de ratos e localização da Myod e Miogenina. Para isso, 57 ratos Wistar foram separados em grupos: controle inicial (GCI); final 45 (GCF45), final 150 (GCF150), desnervado 45 dias (GD45), desnervado 150 dias (GCD150) e grupos experimentais com veia vazia 45 dias (GESP45) e 150 dias (GESP150) e com veia preenchida de gordura 45 dias (GEG45) e 150 dias (GEG150). Para os procedimentos cirúrgicos de desnervação e reinervação e coleta do músculo os animais foram profundamente anestesiados. Após os devidos tempos experimentais, os animais foram sacrificados, o músculo sóleo foi dissecado, envolvido em meio de criopreservação e estocado a -80°C. A quantificação de mRNA do MyoD e Miogenina foi realizada por amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real (RealTimePCR) e a localização da produção de Myod e Miogenina foi realizada por microscopia confocal a laser e imunofluorescência. A morfometria foi realizada em lâminas coradas com HE, observadas em microscópio ótico e calculadas pelo software Image Pro-Plus 6.2. Os resultados do presente estudo mostraram que houve aumento da expressão do Myod e Miogenina nos grupos experimentais 45 dias quando comparados ao grupo controle inicial e um decréscimo da expressão de Myod e Miogenina para os grupos experimentais com 150 dias. A área da secção transversa nos grupos experimentais com 45 dias (GESP45 e GEG45) não apresentaram diferença estatística, quando comparado com grupo desnervado 45 dias (GCD45), enquanto que o grupo experimental com preenchimento de gordura 150 dias (GEG150) obteve os melhores resultados na medida da área da secção transversal do músculo sóleo. As lâminas observadas no microscópio confocal mostram a MyoD e Miogen localizadas no mionúcleo. Concluiu-se que o uso da gordura na técnica de tubulização do nervo ciático de ratos, interfere na regeneração do músculo sóleo. / Peripheral nerve injuries can result in the loss of propioception, morphological and functional alterations of muscle fibers which causes a negative impact on the quality of life. These injuries elicit an alteration on the expression of muscle specific genes, like MyoD and Myogenin, involved in the satellite cell activation and muscle mass regulation. The vein graft tubulization is a well known technique for treatment of denervated muscle. The aim of this work was to investigate if vein graf tubulization filled with fat tissue changes the expression and localization of MyoD and Myogenin and to study if it can modify the morphometry of soleus muscle. Fifty seven Wistar rats were divided in initial control group (ICG), final control group 45 days and 150 days (FCG45; FCG150), denervated 45 days and 150 days (D45; D150) and experimental groups with vein graft 45 days and 150 days (VG45; VG150). and vein graft filled with fat tissue 45 days and 150 days (VF45; VF150). For denervation and reinervation procedures and muscle biopsy the animals were submitted to anaesthesia and after the experimental time they were euthanized. Soleus muscle was dissected, involved in criopreservation medium and stored at -80oC. It was performed RealTime polymerase chain reaction (RealTimePCR) for MyoD and Myogenin mRNA quantification. The localization of its production was analysed by laser confocal microscopy and immunofluorescence staining. The morphometric analysis were done by Hematoxilin-Eosin staining and examined at optical microscopy using the Image ProPlus 6.2 software. There was an upregulation on the expression of MyoD and Myogenin for the experimental groups at 45 days when compared to the initial control group. On the other hand, we found a downregulation on the MyoD and Myogenin expression in the same groups with 150 days. The area of transversal section in the 45 days experimental groups (VF45, VG45) did not show statistical difference compared with denervated group with 45 days (D45). Moreover, the group filled with fat tissue at 150 days (VF150) presented the best results in the transversal section area of soleus muscle. In addition, the slides analysed under confocal microscopy showed the localization of MyoD and Myogenin in the mionuclei. In conclusion, the application of vein graft filled fat tissue improves the soleus muscle regeneration.

Apesar do desenvolvimento da tecnologia envolvendo o campo da regeneração em nervos periféricos, ainda não existe uma técnica para recuperação do tecido nervoso que apresente resultados totalmente satisfatórios, fato que desperta o interesse de vários pesquisadores em todo mundo e representa um desafio para os cirurgiões que realizam procedimentos reconstrutivos e estéticos. Embora o enxerto autólogo de nervo seja a melhor alternativa para a recuperação de nervos periféricos lesados, as técnicas que envolvem o reparo tubular têm alcançado excelentes resultados através da utilização de materiais sintéticos e biológicos, sob a forma de tubos, no reparo de extensos segmentos nervosos. Hoje, através dos avanços da engenharia tecidual, novos materiais estão em desenvolvimento, com o objetivo de aliar características microscópicas às técnicas cirúrgicas existentes. O colágeno, que é sabidamente um elemento promotor da proliferação celular e do reparo tecidual, tem sido amplamente utilizado em estudos de regeneração nervosa. Da mesma maneira, o ácido poli-láctico-poli-glicólico (PLGA), um copolímero sintético, tem apresentado algumas características favoráveis ao processo de regeneração, como biocompatibilidade e propriedades mecânicas adequadas. Com o propósito de facilitar a regeneração nervosa quando ocorre perda tecidual, uma técnica já difundida pode ser destacada: o enxerto de veia invertida, em que a veia jugular externa é utilizada ao avesso, funcionando como um tubo, criando um microambiente para a regeneração nervosa, através da exposição de elementos fundamentais da camada mais externa do vaso (túnica adventícia). Neste trabalho, agregamos como diferencial a utilização de dois tipos de membranas, especialmente desenvolvidas para fins odontológicos, que visam neoformação óssea, em um estudo que visa à regeneração de um nervo periférico misto, o nervo isquiático. As membranas de colágeno e PLGA foram colocadas na região do enxerto, sob a forma de tubo, com o objetivo de recuperar um segmento de 10 mm do nervo referido. E, por fim, aliamos a utilização de um segmento de 5 mm da veia jugular externa como tecido de preenchimento dos tubos feitos com as membranas, na tentativa de verificar a eficácia das moléculas biológicas presentes neste vaso, porém agora sendo utilizadas diretamente dentro do enxerto. Após um período de 6 semanas, o grupo que apresentou o melhor resultado foi aquele em que foi utilizada a membrana de colágeno, na forma de tubo, preenchida com a veia jugular externa. Nesse grupo, o diâmetro médio das fibras mielínicas apresentou um valor médio de 5,8 µm e espessura média da bainha de mielina de 1,65 µm. Para o período de 12 semanas, entre os grupos analisados, o maior valor médio encontrado para o diâmetro foi de 5,64 µm e 1,31 µm para a espessura, sendo que este resultado foi apresentado pelo grupo em que se utilizou a membrana de PLGA sem preenchimento com a veia jugular. Embora os valores não sejam muito inferiores, nos dois períodos, ficaram abaixo dos valores encontrados nos grupos controle normais. Em suma, acreditamos que as membranas de colágeno e PLGA, associadas à técnica de tubulização, apresentam grande potencial para serem utilizadas na regeneração de nervos periféricos. / Despite the development of technology involved in peripheral nerve regeneration, there is no technique that presents a recovery of the nervous tissue with completely satisfactory results. This fact arouses interest of several researchers around the word. Although the autologous nerve grafting is the current gold standard for the repair of large nerve gaps, over the past decades the development of artificial nerve conduits has therefore been of great interest due to the excellent results achieved. Through the advances in tissue engineering, new materials, synthetic and biological, have been used for construct nerve guides. The collagen is one of the oldest natural polymers used as a biomaterial, and it is known as a promoter of cell proliferation and of tissue repair. In the same way, the synthetic copolymer, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), have been used for nerve regeneration, and it have shown some favorable characteristics to nerve repair such as stability, biocompatibility, and mechanical properties. With the purpose of facilitating the regeneration in large nerve gaps, the inside-out vein graft is a widespread technique, where the vein works as a conduit, and it provides a good microenvironment for axon regeneration through the exposition of some primordial elements of its adventitial layer. In this work, we join as a differential the use of two materials, specially developed for dental purposes, which are normally used to facilitate the osteogenesis, in a nerve regeneration study. We performed the surgical procedures in the sciatic nerve, with two types of membranes (PLGA and collagen), which were used as tubes, in order to promote the regeneration of this nerve. The collagen and PLGA membranes were used with the objective of a recovery in a 10-mm sciatic nerve gap model. These tubular implants were filled with a 5 mm segment of the jugular vein in order to verify the effectiveness of some biological molecules of the adventitia layer in the nerve regeneration. After 6 and 12 weeks the graft and the distal stump were observed under light microscopy. In each studied period, the diameters of the myelin fibers, and the thickness of the myelin sheaths of the regenerated axons were measured. After 6 weeks, the group which presented the best result was the group with the collagen membrane tube filled with the external jugular vein. In this group the diameter of the myelin fibers presented an average value of 5.8 µm and an average value of the thickness of the myelin sheaths of 1.65 µm. After 12 weeks, between all the groups, the best results were found in the group where the PLGA membrane unfilled with the external jugular vein was used as a nerve guide, which presented the average diameter of 5.64 µm, and the average thickness of 1.31 µm. Although the average values werent much lower than the values found in the controls, they were beneath than the normal groups. These results proved that the collagen and the PLGA membranes have a great potential to be used as artificial nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.

As qualidades biofísicas do U.S.P. levaram-nos a estimar o efeito do mesmo sobre a regeneração de um nervo periférico. Este estudo foi levado a efeito sobre a axotomia experimental do nervo ciático de ratos. Para tal finalidade estimulamos por 12 dias consecutivos, durante 20 minutos o coto proximal dos nervos axotomizados. A morfologia foi avaliada comparativamente entre cortes semifinos corados pelo azul de toluidina e cortes ultra finos à microscopia eletrônica, dos cotos proximais de nervos estimulados e não estimulados. A avaliação morfométrica das estruturas, baseou-se na contagem diferencial das fibras; da espessura da bainha de mielina e da área dos axônios das fibras tipo A, mediante o emprego de um software especializado ( Image Tool). Os achados morfológicos e a análise estatística dos dados morfométricos são altamente sugestivos de que o U.S.P. estimula a regeneração de nervos periféricos. / The biophysical qualities of pulsed ultrasound led us to appraise it¢s effect on the regeneration of a peripheral nerve. In this study our intention was to evaluate the effects of pulsed ultrasound on the axotomy of the ciatic nerve in rats. The proximal stump of the nerve was stimulated on 12 consecutive days with pulsed ultrasound and the effects of the sonication were evaluated through morphologic and morphometric techniques. Our findings suggest that sonication leads to a rapid regeneration of the nerve after axotomization. These affirmations are based on the counting of different types of fibre components in mixed nerves and the morphologic recovery of the same in comparasion with nerves of animals submitted to sham operation.

As lesões dos nervos periféricos, que inervam os músculos esqueléticos, evoluem para perdas da propriocepção e alterações na morfologia e função das fibras musculares, causando um impacto negativo na qualidade de vidas dos indivíduos. Tais lesões implicam em alteração na expressão de genes específicos do músculo, como por exemplo, na MyoD e Miogenina, atuantes na ativação de células satélites e reguladores da massa muscular A técnica cirúrgica de tubulização é um recurso empregado na prática clínica para tratamento de músculos que sofreram desnervação. O objetivo do presente estudo foi analisar se a técnica de tubulização com o preenchimento de gordura altera a expressão de Myod e Miogenina, a morfometria do músculo sóleo de ratos e localização da Myod e Miogenina. Para isso, 57 ratos Wistar foram separados em grupos: controle inicial (GCI); final 45 (GCF45), final 150 (GCF150), desnervado 45 dias (GD45), desnervado 150 dias (GCD150) e grupos experimentais com veia vazia 45 dias (GESP45) e 150 dias (GESP150) e com veia preenchida de gordura 45 dias (GEG45) e 150 dias (GEG150). Para os procedimentos cirúrgicos de desnervação e reinervação e coleta do músculo os animais foram profundamente anestesiados. Após os devidos tempos experimentais, os animais foram sacrificados, o músculo sóleo foi dissecado, envolvido em meio de criopreservação e estocado a -80°C. A quantificação de mRNA do MyoD e Miogenina foi realizada por amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real (RealTimePCR) e a localização da produção de Myod e Miogenina foi realizada por microscopia confocal a laser e imunofluorescência. A morfometria foi realizada em lâminas coradas com HE, observadas em microscópio ótico e calculadas pelo software Image Pro-Plus 6.2. Os resultados do presente estudo mostraram que houve aumento da expressão do Myod e Miogenina nos grupos experimentais 45 dias quando comparados ao grupo controle inicial e um decréscimo da expressão de Myod e Miogenina para os grupos experimentais com 150 dias. A área da secção transversa nos grupos experimentais com 45 dias (GESP45 e GEG45) não apresentaram diferença estatística, quando comparado com grupo desnervado 45 dias (GCD45), enquanto que o grupo experimental com preenchimento de gordura 150 dias (GEG150) obteve os melhores resultados na medida da área da secção transversal do músculo sóleo. As lâminas observadas no microscópio confocal mostram a MyoD e Miogen localizadas no mionúcleo. Concluiu-se que o uso da gordura na técnica de tubulização do nervo ciático de ratos, interfere na regeneração do músculo sóleo. / Peripheral nerve injuries can result in the loss of propioception, morphological and functional alterations of muscle fibers which causes a negative impact on the quality of life. These injuries elicit an alteration on the expression of muscle specific genes, like MyoD and Myogenin, involved in the satellite cell activation and muscle mass regulation. The vein graft tubulization is a well known technique for treatment of denervated muscle. The aim of this work was to investigate if vein graf tubulization filled with fat tissue changes the expression and localization of MyoD and Myogenin and to study if it can modify the morphometry of soleus muscle. Fifty seven Wistar rats were divided in initial control group (ICG), final control group 45 days and 150 days (FCG45; FCG150), denervated 45 days and 150 days (D45; D150) and experimental groups with vein graft 45 days and 150 days (VG45; VG150). and vein graft filled with fat tissue 45 days and 150 days (VF45; VF150). For denervation and reinervation procedures and muscle biopsy the animals were submitted to anaesthesia and after the experimental time they were euthanized. Soleus muscle was dissected, involved in criopreservation medium and stored at -80oC. It was performed RealTime polymerase chain reaction (RealTimePCR) for MyoD and Myogenin mRNA quantification. The localization of its production was analysed by laser confocal microscopy and immunofluorescence staining. The morphometric analysis were done by Hematoxilin-Eosin staining and examined at optical microscopy using the Image ProPlus 6.2 software. There was an upregulation on the expression of MyoD and Myogenin for the experimental groups at 45 days when compared to the initial control group. On the other hand, we found a downregulation on the MyoD and Myogenin expression in the same groups with 150 days. The area of transversal section in the 45 days experimental groups (VF45, VG45) did not show statistical difference compared with denervated group with 45 days (D45). Moreover, the group filled with fat tissue at 150 days (VF150) presented the best results in the transversal section area of soleus muscle. In addition, the slides analysed under confocal microscopy showed the localization of MyoD and Myogenin in the mionuclei. In conclusion, the application of vein graft filled fat tissue improves the soleus muscle regeneration.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nagibpezatiboer_tese.pdf: 2425172 bytes, checksum: 4c714f51e7b7b8d75dfe136b995e6b72 (MD5) Previous issue date: 2012-10-17 / There are many varieties of lesions of the peripheral nerves derived from acquired or congenital degenerate diseases which can affect the central nervous system and can cause loss of sensory and motor functions. The aim of this work was to make an experimental stereological study of the axons after end-to-side neurorrhaphies and after side-to-side neurorrhaphies to compare the axon, endoneural and myelin sheath volume densities (as well as the muscle mass) in the fibular and tibial nerves with contact anastomosis between 0.25cm and 0.50 cm. After approval by the Ethics Committee, twenty male Wistar rats were divided into four distinct groups of five rats each for the anastomosis between the tibial and fibular nerves (G1= end-to-side neurorrhaphy; G2= 0.25cm side-to-side neurorrhaphy; G3= 0.50cm side-to-side neurorrhaphy and G4= control group of normality and denervation). After 180 days, nervous fragments were fixed in 10% formaldehyde included in paraffin and stained with Masson's trichrome tecnique for the stereological study by the software Image Pro Plus ® version 6.0 with the adoption of Weibel stereological grid to set the axon, endoneural and myelin sheath volume densities. The Mann-Whitney (U Test) was applied for the statistical analysis. Also tibial cranial muscles were removed and then weighed in a precision scale. There was no statistically significant difference between the groups, but there were significant differences comparing the 3 groups (G1, G2 e G3) to the control group (G4). The axon, enduneral and myelin sheath volume densities of tibial and fibular nerves as well as the muscle mass during postoperative period keep egalitarian for both end-to-side and side-to-side neurorrhaphies of anastomosis area of contact in experimental stereological study comparing neurorrhaphies. Therefore, both end-to-side neurorrhaphies (which recover and prevent the motor atrophy) and side-to-side l neurorrhaphies which is independent on the gap of the nerve stumps are recommended as surgical treatment options. / Introdução: Há grande variedade de lesões que acometem nervos periféricos, derivadas de doenças adquiridas ou degenerativas congênitas que afetam a parte central do sistema nervoso e que ocasionam perda de funções sensoriomotoras. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi perfazer estudo experimental estereológico axonal pós-neurorrafias término-lateral ou látero-lateral para comparar densidade de volume de axônios, de endouneuro e de bainha de mielina (bem como massa muscular) em nervos fibular e tibial, com anastomose de contato entre 0,25cm e 0,50 cm. Material e Método: Após aprovação do comitê de ética, foram utilizados 20 ratos machos da raça Wistar divididos em 04 grupos de 05 ratos cada, para realização de anastomose entre nervos fibular e tibial (G1=Neurorrafia término-lateral; G2=Neurorrafia látero-lateral de 0,25cm; G3= Neurorrafia látero-lateral de 0,50cm e G4= Controle de normalidade). Após 180 dias, fragmentos de nervos foram fixados em formaldeído a 10%, incluídos em parafina e corados com Tricômico de Masson para estudo estereológico pelo programa Image Pro Plus versão 6.0, com grade de Weibel para determinação dos números absolutos e da densidade de volume de axônios, endoneuro e bainha de mielina e aplicação do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Também o músculo tibial cranial foi removido e pesado em balança de precisão. Resultados: Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos, mas sim de todos os 03 grupos de estudo (G1, G2 e G3) em relação ao grupo controle (G4). Conclusões: Em estudo experimental estereológico comparativo entre neurorrafias, a densidade de volume de axônios, endoneuro e bainha de mielina de nervos tibial e fibular do mesmo modo que a massa muscular pós-cirúrgica se mantém equitativa em neurorrafias término-lateral e látero-lateral, independentemente da área de anastomose de contato. Pode-se inferir, como opções de reparo cirúrgico, tanto a neurorrafia término-lateral que recupera e previne a atrofia de placa motora quanto a neurorrafia látero-lateral que independe da distância entre os cotos nervosos.

Este estudo analisou experimentalmente as propriedades de tração no local da neurorrafia em nervos ciáticos seccionados dos porcos. Trata-se de um estudo comparativo entre quatro técnicas de suturas. Foram utilizados 25 nervos ciáticos distribuídos em cinco grupos com cinco nervos cada, de acordo com o tipo de técnica de sutura. Grupo 1: grupo controle composto por nervos, sem lesão; Grupo 2: com nervos lesionados submetidos à sutura epineural; Grupo 3: com nervos lesionados submetidos à sutura epineural e reforço com duas suturas extra lesionais; Grupo 4: composto por nervos lesionados submetidos à sutura epineural e reforço com Ultrapro® (Tela Cirúrgica Sintética não Absorvível) e Grupo 5: com nervos lesionados submetidos à sutura epineural reforçada com duas veias com suturas extra lesionais. A força máxima (N), deformação de ruptura (mm) e energia na força máxima (N.mm) foram medidos em ensaios mecânicos de tração em máquina universal de teste. Os resultados mostraram que não houve diferença estatística entre os Grupos 3 e 4 e Grupos 2 e 5. A sutura do Grupo 3 apresentou maior resistência a tração, maior capacidade de absorver energia. Conclui-se que a técnica de sutura utilizada no Grupo 3 alcançou melhor desempenho. / This study aimed to analyze experimentally, in the laboratory, the tensile properties at the neurorrhaphy site on sectioned sciatic nerves of pigs. A comparative study of four suture techniques. Twenty-five sciatic nerves were used. They were randomly distributed into 5 groups with 5 nerves each, according to the type of suturing technique. Group 1, Control group, consisting of nerves, without injury. Group 2, with injured nerves submitted to epineural suture. Group 3, with injured nerves submitted to epineural suture and reinforcement using 2 extralesional sutures. Group 4, composed of injured nerves submitted to epineural suture and reinforcement with Ultrapro® (Synthetic Non-Absorbable Surgical Patch). And Group 5, with injured nerves submitted to reinforced epineural suture with two veins using extralesional sutures. Maximum force (N), rupture deformation (mm), and energy at maximum force (N.mm) were measured in mechanical trials using a universal test machine. The results showed that there was no statistical difference between Groups 3 and 4 and between Groups 2 and 5. The Group 3 suture presented greater tensile strength, greater capacity to absorb energy. It was concluded that the suture technique used in group 3 achieved better performance.

Este estudo analisou experimentalmente as propriedades de tração no local da neurorrafia em nervos ciáticos seccionados dos porcos. Trata-se de um estudo comparativo entre quatro técnicas de suturas. Foram utilizados 25 nervos ciáticos distribuídos em cinco grupos com cinco nervos cada, de acordo com o tipo de técnica de sutura. Grupo 1: grupo controle composto por nervos, sem lesão; Grupo 2: com nervos lesionados submetidos à sutura epineural; Grupo 3: com nervos lesionados submetidos à sutura epineural e reforço com duas suturas extra lesionais; Grupo 4: composto por nervos lesionados submetidos à sutura epineural e reforço com Ultrapro® (Tela Cirúrgica Sintética não Absorvível) e Grupo 5: com nervos lesionados submetidos à sutura epineural reforçada com duas veias com suturas extra lesionais. A força máxima (N), deformação de ruptura (mm) e energia na força máxima (N.mm) foram medidos em ensaios mecânicos de tração em máquina universal de teste. Os resultados mostraram que não houve diferença estatística entre os Grupos 3 e 4 e Grupos 2 e 5. A sutura do Grupo 3 apresentou maior resistência a tração, maior capacidade de absorver energia. Conclui-se que a técnica de sutura utilizada no Grupo 3 alcançou melhor desempenho. / This study aimed to analyze experimentally, in the laboratory, the tensile properties at the neurorrhaphy site on sectioned sciatic nerves of pigs. A comparative study of four suture techniques. Twenty-five sciatic nerves were used. They were randomly distributed into 5 groups with 5 nerves each, according to the type of suturing technique. Group 1, Control group, consisting of nerves, without injury. Group 2, with injured nerves submitted to epineural suture. Group 3, with injured nerves submitted to epineural suture and reinforcement using 2 extralesional sutures. Group 4, composed of injured nerves submitted to epineural suture and reinforcement with Ultrapro® (Synthetic Non-Absorbable Surgical Patch). And Group 5, with injured nerves submitted to reinforced epineural suture with two veins using extralesional sutures. Maximum force (N), rupture deformation (mm), and energy at maximum force (N.mm) were measured in mechanical trials using a universal test machine. The results showed that there was no statistical difference between Groups 3 and 4 and between Groups 2 and 5. The Group 3 suture presented greater tensile strength, greater capacity to absorb energy. It was concluded that the suture technique used in group 3 achieved better performance.