Avaliou-se o efeito do N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) na regeneração de neurônios periféricos em animais adultos. O nervo ciático esquerdo de oito camundongos machos adultos da linhagem C57BL/6J foi seccionado e o coto proximal e distal foram ancorados no interior de um tubo de polietileno (TP) com diâmetro interno de 0,76 mm, mantendo-se uma distância de quatro mm entre os mesmos. Os animais foram divididos aleatória e eqüitativamente em dois grupos e receberam 2&micro;l de solução purificada de colágeno (Vitrogen&reg;2,4 mg/ml) (COL) ou colágeno e MDP na proporção de 1:1 obtendo-se uma concentração de 1 mM (COL/MDP). Outros quatro animais não operados serviram como controle de normalidade (NOR). Após quatro semanas, os TP com os cabos de regeneração (CR) no seu interior, foram coletados para determinação do número de axônios mielínicos e da média do diâmetro das fibras mielínicas regeneradas. Os resultados revelaram diferença significativa no número de axônios entre os grupos NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) e COL/MDP (2430 ± 223). Houve redução significativa no diâmetro das fibras mielínicas nos grupos que receberam as próteses tubulares (COL= 3,38 &micro;m ± 1,16 e COL/MDP= 3,54 &micro;m ± 1,16) quando comparados ao grupo NOR (6,19 &micro;m± 2,45). O gânglio da raiz dorsal L5 também foi removido e seccionado em série para a contagem e mensuração dos neurônios sensitivos. O número de neurônios não diferiu entre os grupos experimentais (COL = 564 ± 51 e COL/MDP = 514 ± 56), os quais apresentaram menor número de neurônios sensitivos em relação ao grupo não operado (NOR = 1097 ± 142). Os resultados indicam que a aplicação local do MDP estimula a regeneração de nervos em camundongos. / N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) was evaluated for its effect on the regenerating peripheral neurons in adult animals. The left sciatic nerve of nine male adult mice C57BL/6J was cut, the proximal and distal nerve stumps were inserted into a polyethylene tube (PT) with 0,76 mm inner diameter, leaving a four mm distance gap. Animals were randomly distributed into two groups and received 2&micro;l of purified preparation of collagen (Vitrogen&reg; 2,4 mg/ml) (COL) or collagen and MDP made up in 1:1 volume ratio, obtaining a 1 mM (COL/MDP) concentration. Other four non-operated animals served as controls (NOR). After four weeks, PT with the regenerated nerve cables (RC), were processed for total myelinated axon counts and myelinated fiber diameter. The results revealed significant difference (p<0.05) in the axons count among the groups NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) and COL/MDP (2430 ± 223). There was a significant reduction in the diameter of myelinated fibers in the operated groups (COL = 3,38 &micro;m ± 1,16 and COL/MDP = 3,54 &micro;m ± 1,16) when compared to non-operated animals (6,19 &micro;m ± 2,45). The L5 dorsal root ganglion (DRG) was also removed form the same mice and serially sectioned for sensory neurons count and measurement. No difference was found in the number of DRG neurons among the experimental groups (COL = 564 ± 51 and COL/MDP = 514 ± 56), which presented fewer sensory neurons compared to non-operated group (NOR = 1097 ± 142). The results indicate that the locally applied MDP stimulates peripheral nerve regeneration in mice.

Avaliou-se o efeito do N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) na regeneração de neurônios periféricos em animais adultos. O nervo ciático esquerdo de oito camundongos machos adultos da linhagem C57BL/6J foi seccionado e o coto proximal e distal foram ancorados no interior de um tubo de polietileno (TP) com diâmetro interno de 0,76 mm, mantendo-se uma distância de quatro mm entre os mesmos. Os animais foram divididos aleatória e eqüitativamente em dois grupos e receberam 2&micro;l de solução purificada de colágeno (Vitrogen&reg;2,4 mg/ml) (COL) ou colágeno e MDP na proporção de 1:1 obtendo-se uma concentração de 1 mM (COL/MDP). Outros quatro animais não operados serviram como controle de normalidade (NOR). Após quatro semanas, os TP com os cabos de regeneração (CR) no seu interior, foram coletados para determinação do número de axônios mielínicos e da média do diâmetro das fibras mielínicas regeneradas. Os resultados revelaram diferença significativa no número de axônios entre os grupos NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) e COL/MDP (2430 ± 223). Houve redução significativa no diâmetro das fibras mielínicas nos grupos que receberam as próteses tubulares (COL= 3,38 &micro;m ± 1,16 e COL/MDP= 3,54 &micro;m ± 1,16) quando comparados ao grupo NOR (6,19 &micro;m± 2,45). O gânglio da raiz dorsal L5 também foi removido e seccionado em série para a contagem e mensuração dos neurônios sensitivos. O número de neurônios não diferiu entre os grupos experimentais (COL = 564 ± 51 e COL/MDP = 514 ± 56), os quais apresentaram menor número de neurônios sensitivos em relação ao grupo não operado (NOR = 1097 ± 142). Os resultados indicam que a aplicação local do MDP estimula a regeneração de nervos em camundongos. / N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) was evaluated for its effect on the regenerating peripheral neurons in adult animals. The left sciatic nerve of nine male adult mice C57BL/6J was cut, the proximal and distal nerve stumps were inserted into a polyethylene tube (PT) with 0,76 mm inner diameter, leaving a four mm distance gap. Animals were randomly distributed into two groups and received 2&micro;l of purified preparation of collagen (Vitrogen&reg; 2,4 mg/ml) (COL) or collagen and MDP made up in 1:1 volume ratio, obtaining a 1 mM (COL/MDP) concentration. Other four non-operated animals served as controls (NOR). After four weeks, PT with the regenerated nerve cables (RC), were processed for total myelinated axon counts and myelinated fiber diameter. The results revealed significant difference (p<0.05) in the axons count among the groups NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) and COL/MDP (2430 ± 223). There was a significant reduction in the diameter of myelinated fibers in the operated groups (COL = 3,38 &micro;m ± 1,16 and COL/MDP = 3,54 &micro;m ± 1,16) when compared to non-operated animals (6,19 &micro;m ± 2,45). The L5 dorsal root ganglion (DRG) was also removed form the same mice and serially sectioned for sensory neurons count and measurement. No difference was found in the number of DRG neurons among the experimental groups (COL = 564 ± 51 and COL/MDP = 514 ± 56), which presented fewer sensory neurons compared to non-operated group (NOR = 1097 ± 142). The results indicate that the locally applied MDP stimulates peripheral nerve regeneration in mice.

Foi realizado um estudo experimental da influência do ultra-som terapêutico na regeneração do nervo ciático submetido a esmagamento controlado, em ratos. Foram empregados no estudo 20 ratos da linhagem Wistar, de peso médio em torno de 250 g, divididos em dois grupos, conforme o tipo de procedimento realizado: 1) somente esmagamento, dez ratos; e 2) esmagamento e irradiação com ultra-som, 10 ratos. Sob anestesia, o nervo ciático era exposto na coxa direita do animal e esmagado com um dispositivo especialmente idealizado e confeccionado para essa finalidade, com uma carga fixa de 15 Kg, por 10 minutos, num segmento de 5 mm proximal à sua bifurcação. A irradiação com o ultra-som pulsado (1:5, freqüência de 1 MHz, intensidade de 0.4 W/'CM POT.2', duração de 2 minutos) era iniciada já no primeiro dia pós-operatório e realizada por dez dias consecutivos. Os resultados foram avaliados pela análise funcional da impressão plantar dos animais obtidas numa pista de marcha e determinação do índice funcional do ciático (De Medinaceli e Bain, Mackinnon e Hunter), e pela morfometria, através do cálculo da densidade de fibras nervosas, após sacrifício dos animais no vigésimo primeiro dia pós-operatório. Os resultados foram submetidos a análise estatística e mostraram que, nas condições do trabalho, o ultra-som acelerou a regeneração do nervo, demonstrável com significância no vigésimo primeiro dia pós-operatório / An experimental study of the influence of therapeutic ultrasound on the regeneration of the sciatic nerve submitted to controlled crush injury was carried out in rats. Twenty female Wistar rats weighing 250 g on average were used and distributed in two groups according to the procedure: 1) crush injury only, ten rats; 2) crush injury followed by ultrasound irradiation, ten rats. Under general anesthesia the sciatic nerve was exposed on the right thigh and crushed with a device especially devised and built for that purpose, with a 15 kg constant load for 10 minutes, affecting a 5 mm-long segment of the nerve proximal to its bifurcation. Pulsed ultrasound irradiation (1:5, 1 MHz frequency, 0.4 W/'CM POT.2' intensity, 2 minutes duration) was started the day after the operation and repeated for ten consecutive days. The results were evaluated by functional footprint analysis and determination of the sciatic functional index (DeMedinaceli's and Bain, Mackinnon and Hunter's methods) at weekly intervals, and by morphometry (nerve fiber density) of the resected sciatic nerve after killing the animals on the 21st postoperative day. Results were submitted to statistical evaluation and showed that, in the conditions of the study, ultrasound accelerated nerve regeneration, as demonstrated with significance on the 21st postoperative day

Foi avaliada a reprodutibilidade entre examinadores do método de avaliação do Índice Funcional do Ciático (IFC), medido por um programa de computação desenvolvido para este fim. Foram empregados 20 ratos Wistar, cujo nervo ciático direito era abordado sob anestesia geral e esmagado num segmento de 5 mm proximal à sua trifurcação com um dispositivo especial, com carga fixa de 5 kgf por 10 minutos. Impressões das pegadas dos animais foram obtidas na fase pré-operatória e, depois, semanalmente, da 1ª à 8ª semana pós-operatória, em uma pista de marcha. As impressões eram digitalizadas, armazenadas e avaliadas, pela medida de parâmetros pré-determinados, por quatro examinadores, seguindo sempre a mesma seqüência de marcação dos parâmetros. Os resultados foram submetidos à análise estatística, que mostrou haver um alto índice de correlação entre examinadores na avaliação pré-operatória e nas 3a, 4a, 5a, 7a e 8a semanas (igual ou maior que 0,82), com queda casual na 6a semana, mas manteve significante como as demais (pF?0,01). Na 1a e 2a semanas, o índice de correlação foi próximo de zero, mostrando a pouca reprodutibilidade do método nesse período, em que a variabilidade entre os animais não diferiu da variabilidade entre os examinadores (pF?0,24 e 0,32, respectivamente), devido à pouca definição das impressões das pegadas. / The Sciatic Functional Index (SFI) is a quite useful tool to evaluate functional recovery of the sciatic nerve of rats in a number of experimental lesions and treatment. Although being an objective method, it depends on the examiner?s ability to adequately recognize and mark the previously established footprint landmarks, which is an entirely subjective step, thus potentially interfering with the calculations according to the mathematical formulae proposed by different authors. An inter-personal evaluation of the reproducibility of an SFI computer aided method was then carried out here to study data variability. A severe crush injury was produce on a 5 mm-long segment of the right sciatic nerve of 20 Wistar rats (5kgf load directly applied for 10 minutes) and the SFI was measured by four different examiners (2 experienced and 2 new-comers) either preoperatively and at weekly intervals from the 1st to the 8th postoperative week. Three measurements were made for each print and an average was drawn and used for the statistical analysis. The results showed that interexaminer correlation was high (0.82) on the 3rd, 4th, 5th, 7th and 8th weeks, with an unexpected (pF?0.01) drop on the 6th week. There was virtually no inter-personal correlation (correlation index nearly 0) on the 1st and 2nd weeks, period in which the variability between animals (pF?0.24) and examiners (pF?0.32) was similar, certainly due to the poor definition of the footprints. The authors conclude that the SFI method studied here is only reliable from the 3rd week on.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Julia de Miranda Moraes.pdf: 2895250 bytes, checksum: e061f736f6922f781b2c671bf4f90f32 (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / The aim of this work was to evaluate the regeneration of equine ulnar nerves submitted to neurotomy, silicone tubing and cell therapy with bone marrow mononuclear cells fraction (MCF) or adipose derived mesenchymal stem cells (ADSC). Fifteen adult horses were divided into three groups with five animals each: control group (CG) with the use of saline solution, group with FCM deposition and group with ADSC deposition. The same surgical procedure was performed in all groups, using both nerves of each animal (right and left), establishing two moments of biopsy: on the 13th week on the right limb (CG1, MCF1 and ADSC1) and on the 26th week on the left limb (CG2, MCF2 and ADSC2). The MCF and ADSC were obtained respectively, from bone marrow and adipose tissue from each animal, both used as an authologous implant. After 13 and 26 weeks, biopsies were performed in all groups and immediately it was made some fragments slide imprints for viewing the nanocrystal fluorescent label. The fragments were fixed in 10% buffered formalin for histological analysis, with HE, luxol fast blue, Masson's trichrome, immunohistochemistry against the antibodies neurofilament (NF), S-100, FGF-2 and GDNF. Microscopically it was observed the presence of axonal growth, connective tissue, inflammatory infiltrate, Schwann cells, neural growth factors, myelin sheath and wallerian degeneration. For histologic analysis, it was established qualitative scores and for immunohistochemistry it was performed quantitative analysis with Image J program. It was observed wallerian degeneration reduction, better fascicular reorganization, new collagen increased, myelin sheath early formation, and NF antibody stronger staining in the experimental groups compared to CG. The ADSC group presented the best results than the other groups, showing ADSCs efficiency compared to MCF and CG for peripheral nerve regeneration. However, it was proved a longer time necessity to occur complete regeneration of peripheral nerve after injury. / Este trabalho teve por objetivo avaliar a regeneração do nervo ulnar de equinos, submetidos à neurotomia, tubulização com tubo de silicone e terapia celular com fração de células mononucleares da medula óssea (FCM) ou células-tronco mesenquimais do tecido adiposo (ADSC). Foram utilizados 15 equinos adultos alocados em três grupos, com cinco animais em cada: grupo controle (GC) com utilização de soro fisiológico; grupo com deposição de FCM; e grupo com deposição de ADSC. Foi realizado o mesmo procedimento cirúrgico em todos os grupos, utilizando-se os dois nervos de cada animal (direito e esquerdo), e estabelecido dois momentos de biopsia: na 13ª semana com biopsia no membro direiro (GC1, FCM1 e ADSC1) e na 26ª semana com biopsia no membro esquerdo (GC2, FCM2 e ADSC2). A FCM e a ADSC foram obtidas respectivamente, da medula óssea e tecido adiposo de cada aninal, ambos utilizados como implantes autólogos. Após 13 e 26 semanas, realizaram-se as biopsias de todos os grupos e imediatamente, faziam-se imprints dos fragmentos para visualização do marcador fluorescente nanocristal. Os fragmentos foram fixados em formol tamponado a 10%, para análise histológica, com as coloraçãoes de HE, luxol fast blue, tricrômio de Masson e imuno-histoquímica com os anticorpos neurofilamento (NF), S-100, FGF-2 e GDNF. Microscopicamente avaliou-se a presença de proliferação axonal, tecido conjuntivo, infiltrado inflamatório, células de Schwann, fatores de crescimento neurais, bainha de mielina, e degeneração walleriana. Para a análise histológica estabeleceram-se escores qualitativos e para a imuno-histoquímica realizou-se análise quantitativa com o programa Image J. Foi observada diminuição da degeneração walleriana, melhor reorganização fascicular, aumento do colágeno novo, início de formação de bainha de mielina, além de maior marcação do anticorpo NF nos grupos experimentais em relação ao GC. O grupo ADSC apresentou melhores resultados em relação aos demais, enfatizando a eficiência das ADSCs em relação à FCM e ao GC para a regeneração nervosa periférica. Porém, há a necessidade de um tempo maior para ocorrer completa regeneração do tecido nervoso periférico após lesão.

Foi avaliada a reprodutibilidade entre examinadores do método de avaliação do Índice Funcional do Ciático (IFC), medido por um programa de computação desenvolvido para este fim. Foram empregados 20 ratos Wistar, cujo nervo ciático direito era abordado sob anestesia geral e esmagado num segmento de 5 mm proximal à sua trifurcação com um dispositivo especial, com carga fixa de 5 kgf por 10 minutos. Impressões das pegadas dos animais foram obtidas na fase pré-operatória e, depois, semanalmente, da 1ª à 8ª semana pós-operatória, em uma pista de marcha. As impressões eram digitalizadas, armazenadas e avaliadas, pela medida de parâmetros pré-determinados, por quatro examinadores, seguindo sempre a mesma seqüência de marcação dos parâmetros. Os resultados foram submetidos à análise estatística, que mostrou haver um alto índice de correlação entre examinadores na avaliação pré-operatória e nas 3a, 4a, 5a, 7a e 8a semanas (igual ou maior que 0,82), com queda casual na 6a semana, mas manteve significante como as demais (pF?0,01). Na 1a e 2a semanas, o índice de correlação foi próximo de zero, mostrando a pouca reprodutibilidade do método nesse período, em que a variabilidade entre os animais não diferiu da variabilidade entre os examinadores (pF?0,24 e 0,32, respectivamente), devido à pouca definição das impressões das pegadas. / The Sciatic Functional Index (SFI) is a quite useful tool to evaluate functional recovery of the sciatic nerve of rats in a number of experimental lesions and treatment. Although being an objective method, it depends on the examiner?s ability to adequately recognize and mark the previously established footprint landmarks, which is an entirely subjective step, thus potentially interfering with the calculations according to the mathematical formulae proposed by different authors. An inter-personal evaluation of the reproducibility of an SFI computer aided method was then carried out here to study data variability. A severe crush injury was produce on a 5 mm-long segment of the right sciatic nerve of 20 Wistar rats (5kgf load directly applied for 10 minutes) and the SFI was measured by four different examiners (2 experienced and 2 new-comers) either preoperatively and at weekly intervals from the 1st to the 8th postoperative week. Three measurements were made for each print and an average was drawn and used for the statistical analysis. The results showed that interexaminer correlation was high (0.82) on the 3rd, 4th, 5th, 7th and 8th weeks, with an unexpected (pF?0.01) drop on the 6th week. There was virtually no inter-personal correlation (correlation index nearly 0) on the 1st and 2nd weeks, period in which the variability between animals (pF?0.24) and examiners (pF?0.32) was similar, certainly due to the poor definition of the footprints. The authors conclude that the SFI method studied here is only reliable from the 3rd week on.

Foi realizado um estudo experimental da influência do ultra-som terapêutico na regeneração do nervo ciático submetido a esmagamento controlado, em ratos. Foram empregados no estudo 20 ratos da linhagem Wistar, de peso médio em torno de 250 g, divididos em dois grupos, conforme o tipo de procedimento realizado: 1) somente esmagamento, dez ratos; e 2) esmagamento e irradiação com ultra-som, 10 ratos. Sob anestesia, o nervo ciático era exposto na coxa direita do animal e esmagado com um dispositivo especialmente idealizado e confeccionado para essa finalidade, com uma carga fixa de 15 Kg, por 10 minutos, num segmento de 5 mm proximal à sua bifurcação. A irradiação com o ultra-som pulsado (1:5, freqüência de 1 MHz, intensidade de 0.4 W/'CM POT.2', duração de 2 minutos) era iniciada já no primeiro dia pós-operatório e realizada por dez dias consecutivos. Os resultados foram avaliados pela análise funcional da impressão plantar dos animais obtidas numa pista de marcha e determinação do índice funcional do ciático (De Medinaceli e Bain, Mackinnon e Hunter), e pela morfometria, através do cálculo da densidade de fibras nervosas, após sacrifício dos animais no vigésimo primeiro dia pós-operatório. Os resultados foram submetidos a análise estatística e mostraram que, nas condições do trabalho, o ultra-som acelerou a regeneração do nervo, demonstrável com significância no vigésimo primeiro dia pós-operatório / An experimental study of the influence of therapeutic ultrasound on the regeneration of the sciatic nerve submitted to controlled crush injury was carried out in rats. Twenty female Wistar rats weighing 250 g on average were used and distributed in two groups according to the procedure: 1) crush injury only, ten rats; 2) crush injury followed by ultrasound irradiation, ten rats. Under general anesthesia the sciatic nerve was exposed on the right thigh and crushed with a device especially devised and built for that purpose, with a 15 kg constant load for 10 minutes, affecting a 5 mm-long segment of the nerve proximal to its bifurcation. Pulsed ultrasound irradiation (1:5, 1 MHz frequency, 0.4 W/'CM POT.2' intensity, 2 minutes duration) was started the day after the operation and repeated for ten consecutive days. The results were evaluated by functional footprint analysis and determination of the sciatic functional index (DeMedinaceli's and Bain, Mackinnon and Hunter's methods) at weekly intervals, and by morphometry (nerve fiber density) of the resected sciatic nerve after killing the animals on the 21st postoperative day. Results were submitted to statistical evaluation and showed that, in the conditions of the study, ultrasound accelerated nerve regeneration, as demonstrated with significance on the 21st postoperative day

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase. / The diagnosis of pure neural leprosy (PNL) is based on clinical and laboratory data, including the histopathology of nerve biopsy specimens and detection of M. leprae DNA by polymerase chain reaction (PCR). Given that histopathological examination and PCR methods may not be sufficient to confirm diagnosis, immunolabeling of lipoarabinomanan (LAM) and/or phenolic glycolipid 1 (PGL1) M. leprae wall components were utilized in the first step of this investigation in an attempt to detect any vestigial presence of M. leprae in AFB- nerve samples. Furthermore, its well known that nerve damage in leprosy can be directly induced by Mycobacterium leprae in the early stages of infection; however, immunomediated mechanisms add gravity to the impairment of neural function in symptomatic periods of the disease. Therefore, this study also investigated the immunohistochemical expression of immunomarkers involved in the pathogenic mechanisms of leprosy nerve damage. These markers selected were CXCL10, CCL2 chemokines and CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, metalloproteinases 2 and 9 in nerve biopsy specimens collected from leprosy (23) and nonleprosy patients (5) suffering peripheral neuropathy. Twenty-three PNL nerve samples (6 AFB+ and 17 AFB-PCR+) were cryosectioned and submitted to LAM and PGL1 immunohistochemical staining by immunoperoxidase; 5 nonleprosy nerve samples were used as controls. The 6 AFB-positive samples showed LAM/PGL1 immunoreactivity. Among the 17 AFB- samples, only 8 revealed LAM and/or PGL1 immunoreactivity. In 17 AFB-PCR+ patients, just 7 had LAM and/or PGL1-positive nerve results. In the PNL cases, the detection of immunolabeled LAM and PGL1 in the nerve samples would have contributed to enhanced diagnostic efficiency in the absence of molecular diagnostic facilities. The results of the second part of this study showed that CXCL10-, CCL2-, MMP2- and MMP9-immunoreactivities were found in the leprosy nerves but not in nonleprosy samples. Immunolabeling was predominantly found in recruited macrophages and Schwann cells composing the inflammatory cellular population in the leprosy-affected nerves. The immunohistochemical expression of all the markers, but CXCL10, was associated with fibrosis; however, only CCL2 was, independently from the other markers, associated with this excessive deposit of extracellular matrix. No difference in the frequency of the immunolabeling was detected between the AFB+ and AFB- leprosy subgroups of nerves, exception made to some statistical tendency to difference in regard to CD68+ and HLA-DR+ cells in the AFB- nerves exhibiting epithelioid granuloma. MMP9 expression associated with fibrosis is consistent with previous results of this research group. The findings conveys the idea that CCL2 and CXCL10 chemokines at least in advanced stages of leprosy nerve lesions are not determinant for the establishment of AFB+ or AFB- leprosy lesions, however, CCL2 is associated with macrophage recruitment and fibrosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase. / The diagnosis of pure neural leprosy (PNL) is based on clinical and laboratory data, including the histopathology of nerve biopsy specimens and detection of M. leprae DNA by polymerase chain reaction (PCR). Given that histopathological examination and PCR methods may not be sufficient to confirm diagnosis, immunolabeling of lipoarabinomanan (LAM) and/or phenolic glycolipid 1 (PGL1) M. leprae wall components were utilized in the first step of this investigation in an attempt to detect any vestigial presence of M. leprae in AFB- nerve samples. Furthermore, its well known that nerve damage in leprosy can be directly induced by Mycobacterium leprae in the early stages of infection; however, immunomediated mechanisms add gravity to the impairment of neural function in symptomatic periods of the disease. Therefore, this study also investigated the immunohistochemical expression of immunomarkers involved in the pathogenic mechanisms of leprosy nerve damage. These markers selected were CXCL10, CCL2 chemokines and CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, metalloproteinases 2 and 9 in nerve biopsy specimens collected from leprosy (23) and nonleprosy patients (5) suffering peripheral neuropathy. Twenty-three PNL nerve samples (6 AFB+ and 17 AFB-PCR+) were cryosectioned and submitted to LAM and PGL1 immunohistochemical staining by immunoperoxidase; 5 nonleprosy nerve samples were used as controls. The 6 AFB-positive samples showed LAM/PGL1 immunoreactivity. Among the 17 AFB- samples, only 8 revealed LAM and/or PGL1 immunoreactivity. In 17 AFB-PCR+ patients, just 7 had LAM and/or PGL1-positive nerve results. In the PNL cases, the detection of immunolabeled LAM and PGL1 in the nerve samples would have contributed to enhanced diagnostic efficiency in the absence of molecular diagnostic facilities. The results of the second part of this study showed that CXCL10-, CCL2-, MMP2- and MMP9-immunoreactivities were found in the leprosy nerves but not in nonleprosy samples. Immunolabeling was predominantly found in recruited macrophages and Schwann cells composing the inflammatory cellular population in the leprosy-affected nerves. The immunohistochemical expression of all the markers, but CXCL10, was associated with fibrosis; however, only CCL2 was, independently from the other markers, associated with this excessive deposit of extracellular matrix. No difference in the frequency of the immunolabeling was detected between the AFB+ and AFB- leprosy subgroups of nerves, exception made to some statistical tendency to difference in regard to CD68+ and HLA-DR+ cells in the AFB- nerves exhibiting epithelioid granuloma. MMP9 expression associated with fibrosis is consistent with previous results of this research group. The findings conveys the idea that CCL2 and CXCL10 chemokines at least in advanced stages of leprosy nerve lesions are not determinant for the establishment of AFB+ or AFB- leprosy lesions, however, CCL2 is associated with macrophage recruitment and fibrosis.