Histone acetyltransferases (HATs) are important enzymes in transcriptional control and potential targets for chemotherapeutic intervention in malignant diseases. Among different HAT members, the yeast Esa1 and human Tip60 (the HIV-1 Tat interactive protein, 60KDa) play multiple roles in normal cellular processes including transcription, cell cycle and checkpoint machinery, double strand DNA break repair, apoptosis, and cell cycle progression. Tip60 is also implicated in several human diseases such as prostate cancer, and gastric cancer. These studies suggest that Tip60 is a potential therapeutic target for new cancer treatment. So, we designed experimental work to synthesize and investigate organic inhibitors of Tip60 using different strategies, including substrate analogs, small molecule screening, and modification of the natural product anacardic acid. These studies provide important chemical agents for basic biology research of HAT function, and produce potential lead compounds for future pharmacologic intervention of HAT deregulation in cancer. Currently, of the methods used for the measurement of acetyltransferase activities, many comprise tedious separation procedures and involve enzyme-coupled steps or radioactive materials. These shortcomings have limited their applications in high-throughput screening (HTS) of HAT inhibitors. To circumvent these problems, a homogenous fluorescent HAT assay based on engineered H4 peptide was designed, synthesized, and evaluated. The data showed that these fluorescent reporters can be used to detect the acetyltransferase activities.

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The CMG (Cdc45, MCM, GINS) helicase is required for cellular proliferation and functions to unwind double-stranded DNA to allow the replication machinery to duplicate the genome. Cancer cells mismanage helicase activation through a variety of mechanisms, leading to the potential for the development of novel anti-cancer treatments. Mammalian cells load an excess of MCM complexes that act as reserves for new replication origins to be created when replication forks stall due to stress conditions, such as drug treatment. Targeting the helicase through inhibition of the MCM complex has sensitized cancer cells to drugs that inhibit DNA replication, such as aphidicolin and hydroxyurea. However, these drugs are not used in the clinical management of cancer. We hypothesized that the effectiveness of the clinically relevant drugs gemcitabine and 5-FU against pancreatic cancer cells, and oxaliplatin and etoposide against colorectal cells, could be increased through co-suppression of the MCM complex. The oncogene c-Myc also leads to the mismanagement of CMG helicases in part due to a non-transcriptional role in overactivating replication origins and causing DNA damage. We sought to elucidate the mechanism by which Myc causes overactivation of CMG helicases. Herein we demonstrate that co-suppression of reserve MCM complexes in pancreatic or colorectal cancer cell lines treated with clinically applicable chemotherapeutic compounds causes significant loss of proliferative capacity compared with cells containing the full complement of reserve MCMs. This is in part due to an inability to recover DNA replication following drug exposure, leading to an increase in apoptosis. Targeting of Myc to genomic sites induced large-scale decondensation of higher order chromatin that was required for CMG helicase assembly and activation at reserve MCM complexes. The physiological mediators of Myc, GCN5 and Tip60, are required for the chromatin unfolding and Cdc45 recruitment. We conclude that depletion of the reserve MCM complexes causes chemosensitization of multiple human tumor cell types to several chemotherapeutic drugs used in the clinical management of human cancer. This argues for the development and use of anti-MCM drugs in combination with chemotherapeutic compounds, which has the potential to increase the therapeutic index of existing clinical compounds. We have also identified a previously unknown role for Myc in normal cell cycle progression whereby DNA replication initiation is regulated through the assembly and activation of CMG helicases on Myc-mediated open chromatin regions. Our results also provide new mechanistic insight into Myc oncogenic transformation in which overstimulation of DNA replication could result in genomic instability and provide an explanation for Myc driven oncogenic transformation.

Die Acetyltransferase TIP60/KAT5 steuert die circadiane Uhr in Drosophila Endogene Uhren steuern verhaltensbezogene und physiologische Prozesse in einer rhythmischen Weise, die eine Periodizität von ~24 h aufweist. Drosophila zeigt einen robusten Rhythmus von Aktivitäts- /Ruhephasen, der von im Gehirn befindlichen zirkadianen Schrittmacherneuronen gesteuert wird. Angeborene Rhythmen der Genexpression werden durch positive und negative transkriptionelle/translationale Rückkopplungsschleifen, die die circadiane Uhr antreiben, generiert. Obwohl die Regulierung der Rückkopplung von Uhrengenen relativ gut verstanden ist, sind die Faktoren, die die Aktivatoren stimulieren, einen neuen circadianen Zyklus zu beginnen, noch unbekannt. Posttranslationale Modifikationen spezifischer Proteine durch Acetylierung erleichtert die Gentranskription. TIP60/KAT5 ist ein Mitglied der hochkonservierten MYST-Familie von Acetyltransferasen und ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, wie beispielsweise Zellwachstum und DNA-Reparatur, undzwar indem es verschiedene Zielproteine acetyliert. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die Mechanismen, durch die Lysin-Acetyltransferase TIP60/KAT5 die circadiane Uhr von Drosophila steuert, zu untersuchen. Das binäre UAS/GAL4 System wurde eingesetzt, um einen gezielten knock down (durch RNA-Interferenz) oder eine Überexpression (eine Mutation in der für die Katalyse essentiellen Aminosäure, wodurch eine dominant negative Funktion verursacht wird) von TIP60/KAT5 in zirkadianen Schrittmacherneuronen zu erreichen. Das temperatursensitive GAL80 (TARGET) System wurde verwendet, um die normale Entwicklung der Schrittmacherneuronen bis ins Erwachsenenstadium zu ermöglichen. Unter Verwendung von nicht-invasiven lokomotorischen Aktivitätstests konnte gezeigt werden, dass TIP60 in Schrittmacherneuronen für den robusten zirkadianen Rhythmus in Abwesenheit von Zeitgebern im adulten Stadium erforderlich ist. In Übereinstimmung mit den beobachteten Veränderungen des circadianen Bewegungsverhaltens, war die rhythmische Expression von wichtigen clock-controlled genes wie Period und Timeless sowie Genen der Hilfsschleife Vrille und Clockwork orange gedämpft. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die Tip60 mRNA unabhängig von der Uhr reguliert wird. Das zirkadiane Bewegungsverhalten wurde genutzt, um zu beurteilen, ob Untereinheiten des TIP60 (Nu4A) multimeren Komplexes auch an der Regulation des Rhythmus beteiligt sind. Um die Zielproteine von TIP60 in der circadianen Uhr zu bestimmen, wurde ein genetischer Interaktions-Test unter Verwendung des Phänotyps der circadianen Lokomotoraktivität durchgeführt und es wurde eine starke Interaktion mit dem zirkadianen Co-Aktivator CYCLE und dem Repressor PERIOD in trans-heterozygoten Kreuzungen gefunden. Aufgrund des Fehlens eines spezifischen Antikörpers, um die Funktion von TIP60 in vivo in adulter Drosophila zu untersuchen, wurde ein transgener Stamm (UAS dTIP60-HA) mit einem Hämagglutinin-Epitop-Tag erzeugt. Dieser transgene Stamm wurde genutzt, um TIP60-HA unter Verwendung eines ubiquitären Promotors (tub GAL4) überzuexprimieren. Ein Antikörper gegen das Epitop (Anti-HA) wurde verwendet, um einen Chromatin-Immunopräzipitations-Assay (ChIP) in diesen transgenen Fliegen durchzuführen. Es zeigte sich, dass TIP60 rhythmisch in der regulatorischen Region von clock-controlledgenes lokalisiert ist, was eine rhythmische Belegung von DNA-Elementen, ähnlich dem CLOCK/CYCLE Komplex, nahelegt. Co-Immunpräzipitation wurde mit transgenen Fliegen durchgeführt, um eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen TIP60 und CYCLE nachzuweisen. Die Ergebnisse dieser Studie legen deutlich eine Beteiligung von TIP60/KAT5 als Co-Aktivator an der präzisen Steuerung der circadianen Uhr in Drosophila nahe. Deutsche Übersetzung: Dr. Inga Urban

Chromatin is a dynamic structure, and chromatin remodeling enzymes regulate chromatin structure to control gene expression and proper lineage specification. Tip60-p400 is a multi-subunit chromatin remodeling complex containing two biochemical activities: the Tip60 subunit is a lysine acetyltransferase (KAT) that targets histones and non-histone proteins, and p400 catalyzes ATP-dependent incorporation of histone variant H2AZ into chromatin. Both of these chromatin modifications have been widely studied with respect to gene expression, DNA damage repair, and apoptosis. Ablation of these catalytic subunits causes defects in normal embryonic development, ESC self-renewal, and gene expression. My goal has been to understand the multiple independent functions of Tip60-p400 acetyltransferase in ESC maintenance and embryonic development. I showed that Tip60 KAT function is dispensable for gene expression, chromatin accessibility, and ESC self-renewal, which is different from Tip60 knockdown phenotype. Interestingly, KAT deficient mutants exhibited defect in differentiation towards mesoderm and endoderm lineages. Consistent with this defect, I also observed gastrulation defect in mice lacking Tip60 KAT activity. Together, these data demonstrate that Tip60 KAT dependent function is only required during later stages of embryonic development, and it is dispensable for ESC self-renewal and pre-implantation development. Tip60 KAT contains four isoforms generated from alternative splicing, whose individual functions are poorly characterized. In the second part of this thesis, I investigated the developmental role of one of the isoforms of Tip60, called Tip55. Unlike Tip60 knockout mice, which lack all the isoforms and causes pre-implantation lethality, I found that ablation of Tip55 results in post-implantation lethality. I further found that loss of Tip55 causes defects in heart, and neural tube development, demonstrating the essential function of Tip55 isoform for organogenesis during embryonic development. Together, these studies have provided new insight into the functions of Tip60-p400 and the mechanisms by which this complex regulates gene expression, ESC pluripotency, and embryonic development. Furthermore, these studies set the stage for future work to identify how the catalytic and non-catalytic functions are directed to perform distinct regulatory functions, as well as how each Tip60 isoform individually contributes to formation of the mammalian body plan.

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L'épigénétique définit les modifications transmissibles et réversibles de l'expression des gènes qui ne s'accompagnent pas de changement de la séquence nucléotidique. Il est actuellement clairement établi que les modifications épigénétiques, telle que la méthylation de l'ADN, contribuent au développement des cancers.<br />La protéine Tip60 est un co-régulateur transcriptionnel possédant une activité histone acétyltransférase (HAT). Tip60 est aussi un élément clé de la réponse aux dommages de l'ADN et joue un rôle critique dans le contrôle de la stabilité du génome via sa capacité à acétyler les protéines. Nous avons récemment identifié Tip60 comme un élément clé de l'activation des voies de réponse aux dommages de l'ADN induits par les carcinogènes du tabac, et avons émis l'hypothèse qu'une modification du profil d'acétylation des protéines histones et/ou non-histones pourrait constituer une nouvelle « signature épigénétique » de ces cancers. <br />Nous mettons en évidence pour la première fois dans les cancers du poumon une altération globale du « paysage épigénétique » de l'histone H4, cible majeure de Tip60, et montrons que certaines de ces modifications épigénétiques (H4K20me3) pourraient être des biomarqueurs candidats pour le dépistage précoce et la définition de protocoles thérapeutiques de ces cancers. Nous identifions par ailleurs Tip60 comme un nouveau régulateur de l'expression et des fonctions biologiques du facteur de transcription E2F1, et montrons que ces deux protéines jouent un rôle coordonné dans la réponse aux dommages de l'ADN induits par le cisplatine, en intervenant dans les voies de réparation de ces dommages. Nous montrons enfin la fréquente perte d'expression de la protéine Tip60 dans les cancers bronchiques, suggérant que cette protéine pourrait constituer un biomarqueur candidat de la réponse au traitement par les sels de platine.

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