Yes / The molecular mechanisms and signalling cascades that trigger the induction of group I metabotropic glutamate receptor (GI-mGluR)-dependent long-term depression (LTD) have been the subject of intensive investigation for nearly two decades. The generation of genetically modified animals has played a crucial role in elucidating the involvement of key molecules regulating the induction and maintenance of mGluR-LTD. In this review we will discuss the requirement of the newly discovered MAPKAPK-2 (MK2) and MAPKAPK-3 (MK3) signalling cascade in regulating GI-mGluR-LTD. Recently, it has been shown that the absence of MK2 impaired the induction of GI-mGluR-dependent LTD, an effect that is caused by reduced internalization of AMPA receptors (AMPAR). As the MK2 cascade directly regulates tumour necrosis factor alpha (TNFα) production, this review will examine the evidence that the release of TNFα acts to regulate glutamate receptor expression and therefore may play a functional role in the impairment of GI-mGluRdependent LTD and the cognitive deficits observed in MK2/3 double knockout animals. The strong links of increased TNFα production in both aging and neurodegenerative disease could implicate the action of MK2 in these processes. / This work was supported by the BBSRC-BB/H018344/1 to S.A.L.C.

Rheumatoid Arthritis (RA) is an autoimmune disorder that results in inflamed joints and osteoporosis. Previous studies have shown that Mycobacterium avium subspecies Paratuberculosis (MAP) has a role in the downregulation of active osteocalcin in Crohn’s disease (CD). Since RA and CD have a similar pathology, we hypothesize that active inflammation following MAP infection will result in downregulation of active osteocalcin in RA patients. In this study, a total of 82 individuals (48 RA and 34 healthy) were examined for MAP status and for active osteocalcin. Out of the 48 RA patients, 18 were MAP positive compared to only 1 out of 34 healthy control (P-values < 0.05). Overall, active osteocalcin levels between RA (2.70 ± 0.87 ng/mL) were significantly lower than healthy controls (5.84 ± 1.42 ng/mL, P-values < 0.05). MAP positive RA patients active osteocalcin levels were lower (0.60 ± 0.31 ng/mL) than MAP negative RA patients (3.85 ± 1.31 ng/mL). The active osteocalcin level in healthy MAP positive controls were lower (1.65 ng/mL) than healthy MAP negative controls (5.96 ± 1.45 ng/mL). The level of active osteocalcin in all MAP positive patients was significantly lower (0.66 ± 0.29 ng/mL) than all MAP negative patients (4.95 ± 0.98 ng/mL, P-values < 0.05). The correlation between presence of MAP in RA individuals and downregulation of active osteocalcin supports a role of MAP as a pathogenic element in RA. In addition, we tested three Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in TNFα, TNFRSF1A and TNFRSF1B by TaqMan genotyping from peripheral blood samples of the 82 subjects. These SNPs were used to determine whether they influence the levels of osteocalcin in RA and healthy patients. Patients with the SNP TNFRSF1B:rs3397 who had TT genotype had a significantly lower osteocalcin level compared with patients without SNP who had CC genotype (0.98 ± 0.35 ng/mL vs. 1.86 ± 0.61 ng/mL). Overall, there was a correlation of the presence of these SNPs and the downregulation of osteocalcin in RA.

Οι αντι-TNFα βιολογικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται ευρέως στην καθ’ ημέρα κλινική πράξη για την αντιμετώπιση συστηματικών φλεγμονωδών νοσημάτων όπως είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα, η ψωριασική αρθρίτιδα και η νόσος του Crohn. Σύντομα, όμως, έγινε αντιληπτό ότι οι ασθενείς υπό θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα συχνά αναπτύσσουν στον ορό τους αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ) κυρίως τύπου IgM, ενώ ένα μικρό ποσοστό των ασθενών αυτών αναπτύσσει κλινικό σύνδρομο που θυμίζει ιδιοπαθή ΣΕΛ. Tα Β λεμφοκύτταρα θεωρείται ότι κατέχουν κεντρικό ρόλο στην παθογένεια του ΣΕΛ. Xαρακτηρίζονται από επίταση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε υπολείμματα τυροσίνης μετά από διέγερση του Β αντιγονικού υποδοχέα (BCR) και από μειωμένη έκφραση της κινάσης Lyn, ενός ενζύμου που ανήκει στην οικογένεια των Src κινασών και διαδραματίζει διπλό ρόλο, ευοδωτικό και ανασταλτικό, στην οδό σηματοδότησης του BCR. Επιπλέον, τα Β λεμφοκύτταρα στον ΣΕΛ χαρακτηρίζονται από μειωμένη έκφραση του δείκτη CD21 (υποδοχέας του συμπληρώματος τύπου 2), ενώ υπάρχουν αναφορές για αυξημένη έκφραση του δείκτη επιφανείας CD20. Για να μελετήσουμε τους μηχανισμούς της αυτοανοσίας που επάγεται από τη χρήση των αντι-TNFα παραγόντων εξετάσαμε εάν τα Β λεμφοκύτταρα των ασθενών υπό αντι-TNFα αγωγή αποκτούν φαινοτυπικά ή/και λειτουργικά χαρακτηριστικά που να προσομοιάζουν με αυτά που έχουν περιγραφεί για τα Β λεμφοκύτταρα στον ΣΕΛ. Συγκεκριμένα μελετήσαμε τα επίπεδα της Lyn, Syk, SHP-1, της φωσφορυλιωμένης Syk στη θέση τυροσίνης 348 (ΡΥ348-Syk), τα επίπεδα των τυροσινικά φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών καθώς και τους δείκτες επιφανείας CD20, CD21 και CD5 σε 29 ασθενείς με συστηματικά ρευματικά νοσήματα πριν και μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-TNFα βιολογικούς παράγοντες. Διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα της Lyn, αλλά όχι της Syk ή της SHP-1, αυξάνονται μετά τη θεραπεία με αντι-TNFα παράγοντες, ιδίως σε ασθενείς με σπονδυλοαρθροπάθειες. H ενζυματική δραστηριότητα της Lyn διατηρείται μετά την έναρξη αγωγής με αντι-TNFα, όπως διαπιστώθηκε από την κατά 2.9 φορές αύξηση των επιπέδων της PY348-Syk, η οποία χαρακτηρίζει την ενεργοποιημένη μορφή της Syk και αποτελεί ειδικό στόχο της Lyn. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα ασθενών που λαμβάνουν ανταγωνιστές του TNFα εμφανίζουν επίταση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης. Το CD20, ένας δείκτης επιφανείας που εκφράζεται αποκλειστικά στα Β λεμφοκύτταρα και συμμετέχει στη διατήρηση των ενδοκυτταρίων επιπέδων Ca++ μετά από διέγερση του BCR αυξάνεται μετά από θεραπεία με αντι-TNFα βιολογικό παράγοντα κυρίως στους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, ενώ τα επίπεδα του CD21 παρέμειναν αμετάβλητα. Επίσης, διαπιστώσαμε επέκταση του πληθυσμού των CD5+ B λεμφοκυττάρων, ενός υποπληθυσμού των Β κυττάρων που αποτελεί γνωστή πηγή φυσικών αυτοαντισωμάτων, κατά τη διάρκεια θεραπείας με αντι-TNFα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι τα Β λεμφοκύτταρα των ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα εμφανίζουν λειτουργικές και φαινοτυπικές διαταραχές οι οποίες μπορεί να σχετίζονται με την επαγωγή αυτοανοσίας, αλλά διαφέρουν από τις διαταραχές που έχουν περιγραφεί για το Β λεμφοκύτταρο στον ΣΕΛ και μπορεί να αναπαριστούν ένα διαφορετικό μοντέλο αυτοανοσίας. Περαιτέρω μελέτες για την αποσαφήνιση των μηχανισμών αυτοανοσίας από την χρήση των αντι-TNFα παραγόντων θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών και της παθογένειας άλλων αυτοάνοσων φλεγμονωδών νοσημάτων. / Biologic agents against ΤΝFα have been widely used for the management of systemic inflammatory disorders, such as rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis and Crohn’s disease. However, it soon became apparent that patients under ΤΝFα blockade commonly develop serologic autoimmune manifestations. Emergence of ANA, usually of the IgM isotype, is common in anti-TNFα treated patients and a few of these patients may develop a SLE-like syndrome. B cells are implicated in the pathogenesis of SLE and are characterized by enhanced tyrosine phosphorylation of proteins following BCR ligation and reduced expression of Lyn, a Src-family kinase abundantly expressed in B cells with both stimulatory and inhibitory properties on the BCR-signaling pathway. Reduced levels of B-cell surface CD21 (complement receptor type 2) and increased expression of CD20 have also been described for lupus B cells. To dissect the mechanisms of anti-ΤΝFα induced autoimmunity we examined the phenotype and function of B cells prior to and following treatment with ΤΝFα antagonists. Levels of Lyn, Syk, SHP-1, tyrosine 348 phospho-Syk (PY348-Syk) and tyrosine phosphorylated proteins were evaluated in 29 patients before and following treatment with TNFα blockers. B-cell surface expression of CD20, CD21 and CD5 were also assessed. Following treatment, B cell cytoplasmic levels of Lyn, but not Syk or SHP-1, significantly increased following treatment with anti-ΤΝFα agents, particularly in patients with spondyloarthropathies. Increased Lyn levels following treatment correlated with increased Lyn enzymatic activity as evidenced by a 2.9-fold increase of PY348-Syk levels, which comprises a Lyn-specific target. Moreover, unstimulated peripheral B cells from anti-ΤΝFα treated patients displayed a tendency towards increased tyrosine phosphorylated proteins following treatment. CD20, a B-cell restricted signaling-associated molecule implicated in the regulation of intracellular calcium levels following BCR ligation, significantly increased in patients with rheumatoid arthritis following treatment with anti-ΤΝFα agents whereas levels of CD21 remained unchanged. Circulating CD5+ B cells, a B-cell subpopulation and a known source of natural autoantibodies, were also significantly expanded during treatment. Our findings suggest that B cells in anti-ΤΝFα treated patients display functional and phenotypical aberrations that may be associated with the induction of autoimmunity, but do not acquire a typical idiopathic SLE profile. These aberrations are distinct from those previously described for lupus B cells and may thus represent a different model of autoimmunity. Further studies regarding the mechanisms underlying the induction of autoimmunity by TNFα antagonists may enhance our understanding on the molecular backgrounds and the pathogenesis of other autoimmune inflammatory disorders.

No description available.

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle majeur dans la modulation de l’alloréactivité après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permettent notamment de contrôler la réaction du greffon contre l’hôte (GVH) dans des modèles expérimentaux. Le potentiel thérapeutique des Treg est donc très important dans ce domaine, mais aussi dans l’auto-immunité ou en cancérologie. Cependant, de nombreuses barrières rendent difficile l’élaboration de stratégies thérapeutiques reposant sur le transfert adoptif de Treg chez l’homme et une meilleure compréhension des facteurs et mécanismes contrôlant la prolifération et les capacités suppressives de ces cellules permettrait de les cibler directement et si possible spécifiquement in vivo.Dans ce travail, après avoir élaboré un nouveau système d’évaluation clinique de la GVH chez la souris et démontré sa simplicité, sa reproductibilité et sa performance, nous avons pu montrer que l’action suppressive des Treg dans la GVH dépendait de l’interaction entre le TNFα produit par les lymphocytes T conventionnels (Tconv) du donneur et le récepteur TNFR2 exprimé par les Treg. En effet, en bloquant cette interaction de 3 façons différentes, à savoir par un anticorps monoclonal bloquant anti-TNFR2, ou en utilisant soit des Treg n’exprimant pas TNFR2 soit des Tconv ne produisant pas de TNFα, nous avons à chaque fois montré que l’effet protecteur des Treg était aboli en l’absence du signal TNF. Le récepteur TNFR2 étant exprimé préférentiellement par les Treg par rapport aux Tconv, nos résultats ouvrent la voie au ciblage des Treg in vivo via TNFR2, soit pour activer ce récepteur par un agoniste et donc stimuler les Treg afin de contrôler la GVH, soit à l’inverse pour bloquer l’axe TNFα/TNFR2 par un antagoniste et ainsi inhiber les Treg, ce qui permettrait alors de lever un frein à l’alloréactivité dans les situations où l’on cherche à la stimuler pour renforcer l’effet anti-tumoral, comme par exemple dans le cas des rechutes post-allogreffe. / Regulatory T cells (Tregs) are key players involved in the modulation of alloreactivity after hematopoietic stem cell transplantation. Indeed, Tregs can prevent graft-versus-host disease (GVHD) in experimental models. Therefore, the therapeutic potential of these cells in GVHD is substantial, as it is in other fields like auto-immunity or oncology. However, many obstacles still make the application of cellular therapy strategies based on the adoptive transfer of Tregs in humans quite complicated. A better understanding of factors and mechanisms that control the proliferation and suppressive capacities of Tregs could allow for a direct and specific targeting of these cells in vivo.In this work, after designing a new clinical grading system for murine GVHD and demonstrating its ease of use, reproducibility and performance, we have shown that the suppressive action of Tregs in GVHD depends on the interaction between TNFα produced by donor conventional T cells (Tconvs) and TNFR2 expressed by Tregs. Using 3 different ways to block this interaction, i.e. with an anti-TNFR2 blocking monoclonal antibody, or Tregs that do not express TNFR2 or donor Tconvs that cannot produce TNFα, we were able to show in each situation that blocking TNF signaling resulted in a loss of protection by Tregs. TNFR2 being highly expressed by Tregs as compared with Tconvs, our results pave the way for in vivo targeting of Tregs through TNFR2, either to activate this receptor with an agonist and therefore stimulate Tregs to control GVHD, or to block the TNFα/TNFR2 axis with an antagonist and in this case inhibit Tregs, which could boost alloreactivity, as expected in some particular settings like post-transplant relapse.

Die vorliegende publikationsbasierte Dissertationsschrift erörtert auf der Basis experimenteller Untersuchungen im Tiermodell die Auswirkungen von Stress auf die Zytokinproduktion und depressionsähnliches Verhalten. Außerdem wird getestet, ob die Blockade des Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF‑α) eine Möglichkeit zur antidepressiven Intervention darstellt. Einleitend werden die Zusammenhänge von Stress, Zytokinen und Depression referiert sowie das hypothetische Modell erläutert, das den publizierten Untersuchungen zugrunde liegt. Es wird hypothetisiert, dass Stress zur Erhöhung der Produktion proinflammatorischer Zytokine führt und dass die vermehrte Zytokinproduktion depressive Verhaltensweisen hervorruft. Aus dieser Annahme leitet sich die Möglichkeit ab, durch Blockade der Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF‑α antidepressive Effekte zu erzielen. In den beiden Arbeiten „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ (Archives of Toxicology) und „Stress-induced cytokine changes in rats“ (European Cytokine Network) wurde der Einfluss von sozialer Isolation, chronischem, milden und akutem Stress auf die Zytokinproduktion untersucht. In diesen Untersuchungen führten die verschiedenen Stressarten zu einer Modulation der Produktion proinflammatorischer Zytokine. Die dritte Publikation „Antidepressant effects of TNF‑α blockade in an animal model of depression“ (Journal of Psychiatric Research) berichtet von einem Experiment, in dem untersucht wurde, ob der TNF‑α-Inhibitor Etanercept antidepressive Effekte aufweist. Tatsächlich zeigte sich unter Etanercept ein Rückgang des depressionsähnlichen Verhaltens im forced swim test (FST) analog zu Verhaltensänderungen durch das in Tierversuchen als Standard-Antidepressivum geltende Imipramin. Die Autoren schlussfolgern, dass das Zytokinsystem durch Stress moduliert wird und so in die pathophysiologische Entwicklung einer Depression involviert sein könnte. Zytokininhibitoren könnten eine neue Klasse der Antidepressiva bei Therapieresistenz werden, wenn sich die Ergebnisse dieser Tierversuche in Studien an Probanden und an Patienten replizieren lassen.:Abkürzungsverzeichnis 5 1. Einführung 6 1.1. Zytokine 6 1.1.1. Tumornekrosefaktor-α 7 1.1.2. Interleukin‑1β 9 1.1.3. Interleukin‑2 9 1.1.4. Interleukin‑4 10 1.1.5. Interleukin‑6 10 1.1.6. Interleukin‑10 10 1.1.7. Interleukin‑17 11 1.1.8. Interleukin‑22 11 1.1.9. Interferon‑γ 12 1.2. Stress 12 1.2.1. Sympathikus und Zytokine 12 1.2.2. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse und Zytokine 12 1.3. Stress und Immunsystem 13 1.4. Stressarten und ihre Paradigmen im Tierversuch 14 1.4.1. Stress durch Isolation bei Ratten 14 1.4.2. Forced Swim Test: Paradigma zur Messung depressionsähnlichen Verhaltens und Modell für akuten Stress 15 1.4.3. Restraint Stress 16 1.5. Depression und Stress 16 1.6. Depression und Entzündung 17 1.7. Neue Therapieansätze gegen Depression 18 1.8. Theoretisches Modell und Fragestellung 19 1.9. Bibliografie zur Einführung 20 2. Originalarbeiten 34 „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ 35 „Stress-induced cytokine changes in rats“ 38 „Antidepressant effects of TNF-α blockade in an animal model of depression“ 45 3. Zusammenfassung 51 4. Anhang 55 Erklärung über die selbständige Abfassung der Arbeit 55 Lebenslauf 56 Publikationen 57 Danksagung 58

Η σήψη αποτελεί μια από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηλείας και θνησιμότητας στον ανεπτυγμένο κόσμο, όπου σχεδόν τα δύο - τρίτα του πληθυσμού υποφέρουν από παχυσαρκία. Σαν αποτέλεσμα, η συνύπαρξη των δύο αυτών καταστάσεων έχει γίνει όλο και συχνότερη στην κλινική πράξη και ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός κλινικών μελετών προσπαθεί να προσεγγίσει την πιθανή επίδραση της παχυσαρκίας στην νοσηρότητα και θνησιμότητα των ασθενών με σήψη, με έως τώρα αντιφατικά αποτελέσματα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνήσει τον τρόπο με τον οποίο η παχυσαρκία επηρεάζει την ανοσιακή απάντηση των σηπτικών ασθενών, εκτιμώντας τον αριθμό και την κατάσταση ενεργοποίησης των μακροφάγων του λιπώδους ιστού, τα επίπεδα του TNFα στον ορό και στον λιπώδη ιστό και δείκτες οξειδωτικού stress στο πλάσμα. Ασθενείς και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 106 ασθενείς, οι οποίοι χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (Ελέγχου n=26, Παχυσαρκίας n=27, Σήψης n=27, Σήψης & Παχυσαρκίας n=26). Ο αριθμός των μακροφάγων στο υποδόριο και ενδοκοιλιακό λίπος και οι υπότυποί τους (M1 και M2) αναγνωρίστηκαν με ανοσοϊστοχημική τεχνική υπό μικροσκόπηση. Τα επίπεδα του TNFα mRNA στο υποδόριο και ενδοκοιλιακό λίπος μετρήθηκαν με real-time reverse transcription-PCR. Στον ορό τα επίπεδα του TNFα μετρήθηκαν με sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Το οξειδωτικό stress στο πλάσμα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας επιλεγμένους βιοδείκτες [TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances), Πρωτεϊνικά Καρβονύλια, TAC (total antioxidant capacity)]. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε ότι η σήψη αυξάνει τον ολικό αριθμό και τον Μ2 υπότυπο των μακροφάγων στο ενδοκοιλιακό λίπος, ενώ η παχυσαρκία δεν φάνηκε να επηρεάζει τη συγκέντρωση των μακροφάγων στο λίπος. Η παχυσαρκία βρέθηκε ότι αυξάνει τα επίπεδα του TNFα mRNA (P<0.05) στο ενδοκοιλιακό λίπος καθώς επίσης και τα επίπεδα των TBARS (P<0.001) και Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων (P<0.001) στο πλάσμα των σηπτικών ασθενών. Τα επίπεδα της TAC στο πλάσμα βρέθηκε ότι μειώνονται και τα επίπεδα TNFα στον ορό ότι αυξάνονται με τη σήψη, ενώ δεν επηρεάζονταν από την παχυσαρκία. Συμπεράσματα: Η παχυσαρκία σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή TNFα στον λιπώδη ιστό και αύξηση του οξειδωτικού stress, προάγοντας την προ-φλεγμονώδη απάντηση στους σηπτικούς ασθενείς. / Sepsis is one of the most important causes of mortality in the developed world, where almost two thirds of the population suffer from obesity. Therefore, the coexistence of both conditions has become frequent in clinical practice and a growing number of clinical studies attempts to examine the potential effect of obesity on sepsis with controversial results up to now. The present study investigates how obesity influences the immune response of septic patients, by assessing the number and activation state of adipose tissue macrophages, serum and adipose tissue tumor necrosis factor-alpha (TNFα) levels and plasma oxidative stress markers. Subjects/methods: The study included 106 patients, divided into four groups (control n = 26, obesity n = 27, sepsis n = 27 and sepsis and obesity n = 26). The number of macrophages in subcutaneous and visceral adipose tissue (SAT and VAT) and their subtypes (M1 and M2) were defined with immunohistochemical staining techniques under light microscopy. TNFα mRNA levels were determined in SAT and VAT using real-time reverse transcription-PCR. Serum levels of TNFα were determined with sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Plasma oxidative stress was evaluated using selective biomarkers [thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), protein carbonyls and total antioxidant capacity (TAC)]. Results: Sepsis increased the total number of macrophages and their M2 subtype in VAT, whereas obesity did not seem to affect the concentration of macrophages in fat. Obesity increased TNFα mRNA levels (P < 0.05) in VAT as well as the plasma TBARS (P < 0.001) and protein carbonyls (P < 0.001) in septic patients. The plasma TAC levels were decreased and the serum TNFα levels were increased in sepsis although they were not influenced by obesity. Conclusions: Obesity is associated with elevated TNFα adipose tissue production and increased oxidative stress biomarkers, promoting the proinflammatory response in septic patients.

No description available.

Lors de la conception de médicaments, le criblage in silico est de plus en plus utilisé et lesméthodes disponibles nécessitent d'être évaluées. L'évaluation de 8 méthodes a mis enévidence l'efficacité des méthodes de criblage in silico et des problèmes de construction de labanque d'évaluation de référence (DUD), la conformation choisie pour les sites de liaisonn'étant pas toujours adaptée à tous les actifs. La puissance informatique actuelle le permettant,plusieurs structures expérimentales ont été choisies pour tenter de mimer la flexibilité dessites de liaison. Un autre problème a été mis en évidence : les métriques d'évaluation desméthodes souffrent de biais. De nouvelles métriques ont donc été proposées, telles queBEDROC et RIE. Une autre alternative est proposée ici, mesurant la capacité prédictive d'uneméthode en actifs. Enfin, une petite molécule active sur le TNFα in vitro et in vivo sur souris aété identifiée par un protocole de criblage in silico. Ainsi, malgré le besoin d'amélioration desméthodes, le criblage in silico peut être d'un important soutien à l'identification de nouvellesmolécules a visée thérapeutique.

[Formulae and special characters can only be approximated here. Please see the pdf version of the abstract for an accurate reproduction.] Apoptosis is a morphologically distinct form of cell death that is involved in the regulation of normal and aberrant cell systems. The complexities of the apoptotic cell death pathway arise from variation in both the cellular specialisation and initial stimulus. The corpus luteum (CL) is an endocrine gland that whilst critical to the maintenance of pregnancy in the rat, regresses at the completion of each oestrous cycle and pregnancy. This regression is facilitated through apoptosis; though, the stimulus and factors involved in the apoptotic pathway are poorly understood. Previous studies suggest that CL regression is not initiated through failure of luteotrophic support, but rather the active production of a luteolytic factor, of which tumour necrosis factor -alpha (TNFα) is one possible candidate. Several publications have reported the participation of the immune system in ovarian events. There is evidence that TNFα expression within the ovary is coordinated between cells of the immune system and the hormonal regulation of the CL. This study has focussed on the role of TNFα in CL apoptosis and the factors involved in this apoptotic pathway. TNFα-induced cell death is governed by the presence of the two TNFα receptors (TNFR) and several second messenger systems that include; the sphingolipids, mitogen-activated protein (MAP) kinases, nitric oxide (NO), nuclear factor-kappaB (NF-κB) and the caspases. These factors and their interactions were assessed in the rat CL during pregnancy and post-partum, and in vitro. Apoptosis was measured through the analysis of DNA fragmentation using DNA 3’ end labelling and single cell electrophoresis (COMET assay). Assessment of mRNA and protein expression was through Real-time RT-PCR and Western blot analysis; proteins were localised within the CL by immunocytochemistry. In addition, specific measurement of sphingolipid expression and nitric oxide (NO) production was by high performance liquid chromatography (HPLC) and NO assay respectively. Following parturition, TNFα mRNA and protein expression increased corresponding to the onset of CL apoptosis and increased expression of the chemotactic factor monocyte chemoattractant protein -1 (MCP-1). Furthermore, CL apoptosis was induced by treatment with recombinant TNFα in a time- and dose-dependent manner. A similar effect was observed in isolated luteal cells. Simultaneously, the functional regression of the CL was assessed by measurement of both progesterone synthesis and steroidogenic acute regulatory (StAR) protein expression. StAR mRNA and protein expression declined toward parturition in vivo. Immunocytochemical studies revealed the presence of TNFα receptors 1 (TNFR1) and 2 (TNFR2) in luteal cells. Furthermore, TNFR mRNA was isolated from CL throughout pregnancy and post-partum. Subsequently, the role of the sphingolipids ceramide and sphingosine was examined during CL apoptosis in vitro. Ceramide and sphingosine were found to be potent apoptotic agents when administered in vitro (50µM). The downstream signal transduction of TNFα and ceramide was assessed through MAP kinase expression. Both TNFα and ceramide increased expression of the pro-apoptotic p38 MAP kinase with no change to the non-apoptotic extracellular signal-related kinase (ERK1&2). Despite previous reports of c-Jun NH2 terminal kinase (JNK) involvement in the cell death pathway, JNK expression was not evident in the rat CL. The caspases are a family of cysteine proteases central to the regulation and execution of apoptosis. General inhibition of the caspase cascade in vitro was effective in preventing apoptosis regardless of the apoptotic stimulus (TNFα, ceramide and sphingosine), suggesting that this pathway is central to CL apoptosis. Specific inhibition of several caspases produced a varying effect; inhibition of caspases 3, 6 and 8 significantly reduced the level of TNFα-induced apoptosis, thus supporting their classification as either regulatory or effector caspases. NO is endowed with the unique ability to initiate and to block apoptosis and this dichotomy extends to the cytotoxic actions of TNFα. Inhibition of NO production by treating CL with L-NAME prevented the onset of apoptosis, whilst NO production increased in response to increasing levels of apoptosis following trophic withdrawal. However, this effect was not seen during TNFα-induced apoptosis, suggesting that the actions of NO are independent of TNFα. The data presented within this study examine multiple elements of the TNFα cell death pathway in a single system. The results suggest that these elements are involved in TNFα signal transduction and furthermore, in rat CL apoptosis. It can be said that TNFα plays an active role in CL regression through the activation of the caspases, the sphingolipids and the MAP kinases.