La protéine TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) suscite un grand intérêt en thérapie anticancéreuse. Contrairement à la plupart des traitements couramment utilisés en clinique, cette protéine induit sélectivement la mort par apoptose de nombreuses cellules cancéreuses. Cette cytokine exerce son activité cytotoxique en se liant à des récepteurs transmembranaires exprimés à la surface de la cellule cible. Par un jeu d’interactions protéiques, la fixation de TRAIL sur ces récepteurs agonistes (TRAIL-R1 et TRAIL-R2) conduit à l’activation de l’apoptose. L’expression de deux récepteurs antagonistes, TRAIL-R3 et TRAIL-R4, par les cellules cancéreuses, permet aux cellules cibles d’échapper à l’apoptose induite par TRAIL. Nous montrons que ces deux récepteurs font intervenir des mécanismes moléculaires distincts. Leur expression pouvant potentiellement représenter un frein à l’utilisation clinique de TRAIL, nous avons étudié l’effet de la surexpression de l’un d’entre eux, TRAIL-R4 sur l’efficacité des stratégies thérapeutiques associant TRAIL aux chimiothérapies conventionnelles. Les résultats obtenus montrent également que la résistance induite par TRAIL-R4 peut être contournée in vitro et in vivo en associant TRAIL à des agents chimiothérapeutiques. D’un point de vue moléculaire, nous avons montré que la sensibilisation à TRAIL 1) implique une augmentation du recrutement et de l’activation de la caspase-8 au sein du DISC de TRAIL, 2) ne nécessite pas la voie mitochondriale, et 3) est négativement régulée de manière coopérative par c-FLIP, un inhibiteur sélectif de la caspase-8. De manière intéressante, comme les anticorps agonistes actuellement testés en clinique, de petits peptides agonistes de TRAIL-R2, développés en collaboration avec une équipe de chimiste, permettent de contourner la résistance induite par TRAIL-R4, offrant des perspectives thérapeutiques intéressantes. Les récepteurs TRAIL-R3 et TRAIL-R4 sont donc des inhibiteurs de TRAIL. Nos travaux démontrent cependant, que les stratégies associant TRAIL à des agents chimiothérapeutiques, ou l'utilisation d'agonistes TRAIL-R2 permet de contourner la résistance induite par les récepteurs antagonistes de TRAIL et donc d’éliminer ces cellules cancéreuses. / TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) is a very promising cytokine for cancer therapy. Contrary to current treatments, this protein is able to selectively kill cancer cells, whilst sparing healthy cells. TRAIL induces apoptosis following binding to one of its two different agonistic membrane receptors, TRAIL-R1 and TRAIL-R2. However, expression of one of its two antagonistic receptors, TRAIL-R3 and TRAIL-R4, on cancer cells can impair cancer cell killing by TRAIL. We have shown that these receptors inhibit TRAIL-induced cell death differentially. As these receptors can represent a brake for the use of TRAIL in cancer therapy, we investigated the effect of the expression of one of them, TRAIL-R4 on the efficacy of the different therapeutic strategies associating TRAIL and conventional therapeutic drugs. We show that acquired resistance to TRAIL following expression of TRAIL-R4 can be overcome in vitro and in vivo by combining TRAIL with chemotherapeutic agents. From a molecular point of view, we could demonstrate that sensitization to TRAIL 1) occurs mainly through an increase of caspase-8 recruitment and activation within the TRAIL DISC, 2) is independent of the mitochondrial pathway and 3) is negatively regulated, in a cooperative manner by c-FLIP, a caspase-8 selective inhibitor. Interestingly, like agonistic receptors currently tested in clinic, small agonistic peptides targeting TRAIL-R2, engineered in collaboration with a team of chemists, afford cancer cell killing regardless of TRAIL-R4 expression, providing novel therapeutic perspectives. TRAIL-R3 and TRAIL-R4 should thus be considered as TRAIL inhibitors. Our results demonstrate however that strategies aiming at combining TRAIL with chemotherapeutic agents or the use of TRAIL-R1 or TRAIL-R2 agonists could be effective treatments to eradicate cancer cells that express TRAIL antagonistic receptors.

Objectifs: La cytokine TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) suscite un intérêt majeur en thérapie anti-cancéreuse grâce à sa capacité à induire l’apoptose des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules saines. L’association du récepteur Fas et de l’actine via l’ezrine, une protéine de la famille ERM (Ezrin, Moesin, Radixin), régule les premières étapes de l’induction de l’apoptose par FasL. Au cours de mon projet de thèse, nous avons voulu déterminer le rôle que pouvait jouer l’ezrine au cours de l’apoptose induite par TRAIL, dans des lymphomes B ou des cellules cancéreuses adhérentes (HeLa, HCT116 et SW480). Matériel et Méthodes: Des approches biochimiques et moléculaires nous ont permis d’étudier et de déterminer l’implication de l’ezrine et sa phosphorylation dans la régulation de la mort induite par TRAIL. Résultats: Ce travail démontre que l’ezrine peut réguler de manière négative l’apoptose induite par TRAIL et FasL. Cette activité inhibitrice est régulée par la phosphorylation/déphosphorylation sur la serine 66 ainsi que sur la thréonine 353. Néanmoins cette régulation n’affecte ni la formation, ni l’activation du DISC (Death Inducing Signalling Complex). Des mutations de ces résidus par une alanine (S66A) ou un acide aspartique (Y353D) augmente sélectivement la capacité de TRAIL à induire l’apoptose. Au contraire, des mutations ponctuelles de ces résidus permettant de mimer la phosphorylation de l’ezrine sur la serine 66 (S66D) ou l’expression d’un variant non phosphorylable sur la thréonine 353 (Y353F) protègent les cellules cancéreuses de l’apoptose induite par TRAIL. De manière concordante, l’utilisation du H89, un inhibiteur de PKA, kinase responsable de la phosphorylation de la serine 66 augmente la sensibilité des cellules cancéreuses à TRAIL, alors qu’au contraire, un activateur de PKA (8bromocyclic AMP) rend ces mêmes cellules plus résistantes à TRAIL. Enfin, l’association de TRAIL et du cisplatine permet de dépasser l’inhibition de l’apoptose par l’ezrine. / Background and Aim: TRAIL has sparked a growing interest in oncology due to its ability to selectively trigger cancer cell death while sparing normal cells. The Fas/actin association through ezrin, a member of the ERM protein family, has been reported to regulate early steps of Fas-mediated apoptosis. In this project, we addressed the role of ezrin regarding TRAIL-induced cell death in B lymphoma cell lines, or adherent cancer cell lines (HeLa WT, HCT116, SW480). Methods: Molecular and biochemical approaches were employed to study the relevance of ezrin and its phosphorylation status in TRAIL signaling. Results: We found that ezrin displays a negative function towards TRAIL- and Fas-mediated apoptosis and that the ezrin-mediated TRAIL-induced cell death inhibition led to ezrin activation through phosphorylation/dephosphorylation events at serine 66 and tyrosine 353, but is mainly independent of TRAIL DISC (Death Inducing Signalling Complex) formation or activation. Mutations of these residues to alanine (S66A) or aspartic acid (Y353D) selectively enhanced TRAIL-induced cell death, whereas point mutations mimicking ezrin phosphorylation on S66 (S66D) or a nonphosphorylable variant on Y353 (Y353F) strongly protected cancer cells from apoptosis induced by TRAIL. Moreover, inhibition of the ezrin serine 66 PKA target site, using H89, increased cancer cell sensitivity to TRAIL, while treatment with 8bromocyclic AMP, a PKA activator, decreased TRAIL-induced cell death. In addition, combined TRAIL/cisplatin treatments abrogated ezrin-mediated inhibition of TRAIL-induced apoptosis.

Background and Aim: TRAIL has sparked a growing interest in oncology due to its ability to selectively trigger cancer cell death while sparing normal cells. The Fas/actin association through ezrin, a member of the ERM protein family, has been reported to regulate early steps of Fas-mediated apoptosis. In this project, we addressed the role of ezrin regarding TRAIL-induced cell death in B lymphoma cell lines, or adherent cancer cell lines (HeLa WT, HCT116, SW480). Methods: Molecular and biochemical approaches were employed to study the relevance of ezrin and its phosphorylation status in TRAIL signaling. Results: We found that ezrin displays a negative function towards TRAIL- and Fas-mediated apoptosis and that the ezrin-mediated TRAIL-induced cell death inhibition led to ezrin activation through phosphorylation/dephosphorylation events at serine 66 and tyrosine 353, but is mainly independent of TRAIL DISC (Death Inducing Signalling Complex) formation or activation. Mutations of these residues to alanine (S66A) or aspartic acid (Y353D) selectively enhanced TRAIL-induced cell death, whereas point mutations mimicking ezrin phosphorylation on S66 (S66D) or a nonphosphorylable variant on Y353 (Y353F) strongly protected cancer cells from apoptosis induced by TRAIL. Moreover, inhibition of the ezrin serine 66 PKA target site, using H89, increased cancer cell sensitivity to TRAIL, while treatment with 8bromocyclic AMP, a PKA activator, decreased TRAIL-induced cell death. In addition, combined TRAIL/cisplatin treatments abrogated ezrin-mediated inhibition of TRAIL-induced apoptosis.