Objetivos: objetivo geral deste trabalho foi avaliar a penetração cutânea da isotretinoína nanoencapsulada e livre utilizando técnicas de microdiálise e tape stripping in vitro. Métodos: A viabilidade da utilização da técnica de microdiálise para avaliar o perfil farmacocinético da isotretinoína após aplicação tópica foi investigada através da determinação da recuperação relativa (RR) in vitro por diálise e retrodiálise. A influência da concentração, do fluxo de perfusão e a ligação do fármaco à tubulação das sondas de microdiálise foram investigadas. A metodologia analítica para quantificação do fármaco em microdialisado foi validada. Em seguida, as penetrações cutâneas da isotretinoína livre e nanoencapsulada incorporada em géis hidrofílicos foram comparadas através da técnica de tape stripping in vitro em células de difusão de Franz utilizando pele humana e pele de porco. Para garantir a integridade das formulações, a estabilidade físico-química das mesmas foi avaliada. Os resultados de penetração cutânea foram comparados com os resultados in vivo obtidos em trabalho prévio do grupo de pesquisa. Resultados e Conclusões: Um método analítico simples e rápido para a determinação de isotretinoína em microdialisado foi validado de acordo com o FDA. A RR mostrou-se concentração independente e observou-se que há diferenças significativas entre as RR avaliadas pelos dois métodos utilizados, sendo a recuperação por retrodiálise 2,7 a 3,5 vezes superior que a obtida por diálise para os fluxos investigados. O fármaco aderiu às tubulações da sonda de microdiálise devido à sua lipofilicidade. Os hidrogéis de isotretinoína apresentaram estabilidade durante 2 meses de estocagem à 4 °C. Os experimentos de tape stripping in vitro mostraram que a isotretinoína não foi encontrada no compartimento receptor após 8 h, para ambas as formulações. A nanoencapsulação aumentou a penetração e prolongou a liberação da isotretinoína no estrato córneo de ambas as peles. A penetração cutânea em ambas as peles mostrou proporções similares para as duas formulações embora diferentes quantidades de fármaco tenham sido detectadas no estrato córneo. A pele de porco, mais permeável que a pele humana, é apropriada para prever a penetração cutânea da isotretinoína no estrato córneo humano in vitro (R = 0,79). O método in vitro não foi capaz de prever a penetração cutânea da isotretinoína in vivo. / Objectives: The aim of the present work was to assess the cutaneous penetration of isotretinoin free and loaded into polymeric nanocapsules using microdialysis and tape stripping in vitro. Methods: The feasibility of using microdialysis to determine the pharmacokinetic profile of isotretinoin after topical application was investigated through assessment of relative recovery (RR) in vitro by dialysis and retrodialysis. The influence of isotretinoin concentration, perfusion flow rate and drug binding to the probes were determined. The analytical method for quantification of microdialysate samples was validated. Furthermore the cutaneous penetration of isotretinoin free and loaded nanocapsules incorporated in hydrogel formulations were compared by tape stripping in vitro using Franz-type diffusion cells with excised human and pig skin. In order to ensure the integrity of the formulations used in this study, the chemical and physical stabilities were evaluated. The results of cutaneous penetration were compared with the results of tape stripping in vivo acquired in a previous study of our group. Results and Conclusions: A simple and rapid analytical method for quantification of isotretinoin in microdialysate samples was validated according to FDA. RR was concentration independent but method dependent under the conditions investigated being the retrodialysis recovery 3.5 to 2.7 times higher than the dialysis. Isotretinoin bound to the microdialysis tubing due to its high lipophilicity. The hydrogels showed storage stability for 2 months at 4 °C. In vitro tape stripping in human and pig skin showed that no isotretinoin reaches the receptor compartment for both formulations up to 8 h. Nanoencapsulation increased isotretinoin skin penetration for both stratum cornea and prolonged drug release. Similar proportion of cutaneous penetration for human and pig skin were observed although different amounts of drug were detected at the stratum corneum of both skin specimens. Pig skin, more permeable than human skin, is suitable for predicting cutaneous penetration of isotretinoin in humans in vitro (R = 0.79). The in vitro experiments were not suitable to reflect the in vivo results for percutaneous penetration of isotretinoin.

Objetivos: objetivo geral deste trabalho foi avaliar a penetração cutânea da isotretinoína nanoencapsulada e livre utilizando técnicas de microdiálise e tape stripping in vitro. Métodos: A viabilidade da utilização da técnica de microdiálise para avaliar o perfil farmacocinético da isotretinoína após aplicação tópica foi investigada através da determinação da recuperação relativa (RR) in vitro por diálise e retrodiálise. A influência da concentração, do fluxo de perfusão e a ligação do fármaco à tubulação das sondas de microdiálise foram investigadas. A metodologia analítica para quantificação do fármaco em microdialisado foi validada. Em seguida, as penetrações cutâneas da isotretinoína livre e nanoencapsulada incorporada em géis hidrofílicos foram comparadas através da técnica de tape stripping in vitro em células de difusão de Franz utilizando pele humana e pele de porco. Para garantir a integridade das formulações, a estabilidade físico-química das mesmas foi avaliada. Os resultados de penetração cutânea foram comparados com os resultados in vivo obtidos em trabalho prévio do grupo de pesquisa. Resultados e Conclusões: Um método analítico simples e rápido para a determinação de isotretinoína em microdialisado foi validado de acordo com o FDA. A RR mostrou-se concentração independente e observou-se que há diferenças significativas entre as RR avaliadas pelos dois métodos utilizados, sendo a recuperação por retrodiálise 2,7 a 3,5 vezes superior que a obtida por diálise para os fluxos investigados. O fármaco aderiu às tubulações da sonda de microdiálise devido à sua lipofilicidade. Os hidrogéis de isotretinoína apresentaram estabilidade durante 2 meses de estocagem à 4 °C. Os experimentos de tape stripping in vitro mostraram que a isotretinoína não foi encontrada no compartimento receptor após 8 h, para ambas as formulações. A nanoencapsulação aumentou a penetração e prolongou a liberação da isotretinoína no estrato córneo de ambas as peles. A penetração cutânea em ambas as peles mostrou proporções similares para as duas formulações embora diferentes quantidades de fármaco tenham sido detectadas no estrato córneo. A pele de porco, mais permeável que a pele humana, é apropriada para prever a penetração cutânea da isotretinoína no estrato córneo humano in vitro (R = 0,79). O método in vitro não foi capaz de prever a penetração cutânea da isotretinoína in vivo. / Objectives: The aim of the present work was to assess the cutaneous penetration of isotretinoin free and loaded into polymeric nanocapsules using microdialysis and tape stripping in vitro. Methods: The feasibility of using microdialysis to determine the pharmacokinetic profile of isotretinoin after topical application was investigated through assessment of relative recovery (RR) in vitro by dialysis and retrodialysis. The influence of isotretinoin concentration, perfusion flow rate and drug binding to the probes were determined. The analytical method for quantification of microdialysate samples was validated. Furthermore the cutaneous penetration of isotretinoin free and loaded nanocapsules incorporated in hydrogel formulations were compared by tape stripping in vitro using Franz-type diffusion cells with excised human and pig skin. In order to ensure the integrity of the formulations used in this study, the chemical and physical stabilities were evaluated. The results of cutaneous penetration were compared with the results of tape stripping in vivo acquired in a previous study of our group. Results and Conclusions: A simple and rapid analytical method for quantification of isotretinoin in microdialysate samples was validated according to FDA. RR was concentration independent but method dependent under the conditions investigated being the retrodialysis recovery 3.5 to 2.7 times higher than the dialysis. Isotretinoin bound to the microdialysis tubing due to its high lipophilicity. The hydrogels showed storage stability for 2 months at 4 °C. In vitro tape stripping in human and pig skin showed that no isotretinoin reaches the receptor compartment for both formulations up to 8 h. Nanoencapsulation increased isotretinoin skin penetration for both stratum cornea and prolonged drug release. Similar proportion of cutaneous penetration for human and pig skin were observed although different amounts of drug were detected at the stratum corneum of both skin specimens. Pig skin, more permeable than human skin, is suitable for predicting cutaneous penetration of isotretinoin in humans in vitro (R = 0.79). The in vitro experiments were not suitable to reflect the in vivo results for percutaneous penetration of isotretinoin.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Erika Crispim Resende - 2013.pdf: 9225841 bytes, checksum: 704ac58eda3cb376fd2c234dcc302a24 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante. / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante.

Zielsetzung dieser Arbeit war es, das Verhalten der in modernen Sonnenschutzmitteln eingesetzten Titandioxid-Mikropartikel mit quantitativen Methoden zu bestimmen, um Aussagen über ihre Eignung zu erhalten. Dabei stand die Frage nach der Verteilung der Substanz innerhalb des Stratum corneum im Mittelpunkt der Untersuchungen. Insbesondere war wegen der bekannten photokatalytischen Aktivität von Titandioxid zu klären, ob ein Kontakt mit den lebenden Bereichen der Haut ausgeschlossen werden kann. Für die Messungen wurden zwei kommerziell genutzte, unterschiedlich beschichtete Titandioxid-Mikropartikel eingesetzt. Eine wesentliche Voraussetzung für diese Untersuchungen war die Anwendung der Abrissmethode (Tape stripping) in Kombination mit der spektroskopischen Bestimmung der Extinktion im sichtbaren Bereich zur Berechnung des Hornschichtprofils. Die Konzentration der Titandioxid-Partikel wurde mit Hilfe von Röntgenfluoreszenz-Messungen bestimmt. So war es erstmals möglich, in vivo standardisierte und reproduzierbare Untersuchungen zum Penetrationsverhalten von beschichteten Titandioxid-Mikropartikeln in die Hornschicht der menschlichen Haut durchzuführen. Durch Langzeitapplikation der Substanzen und die Beobachtung der Titandioxid-konzentrationen in der Hornschicht über mehrere Tage konnten auch Aussagen zum Penetrationsverhalten der applizierten Mikropartikel gemacht werden. Es wurde eindeutig gezeigt, dass die untersuchten Substanzen unabhängig von ihrer Struktur, von ihrer Beschichtung und vom Probanden hauptsächlich in den obersten Schichten des Stratum corneum lokalisiert sind. Nach Klärung dieser grundsätzlichen Fragen war es notwendig, die Ursache für das Auftreten extrem geringer Titandioxid-Konzentrationen auf Abrissen zu bestimmen, die aus tieferen Schichten des Stratum corneum entnommen wurden. Durch die Kombination der Abrissmethode mit einem speziellen Färbeverfahren und der Laser-Scan-Mikroskopie ergaben sich deutliche Hinweise auf die Bedeutung der Follikelkanäle für das beobachtete Phänomen. Röntgenspektroskopische Untersuchungen an Biopsien zeigten, dass diese Mikropartikel in die Haarfollikel eindringen und damit Bereiche unterhalb des Stratum corneum erreichen. Hierbei wurden die Mikropartikel in dieser Region nur in Follikelkanälen, nicht aber im Bereich der lebenden Zellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse belegen, dass Titandioxid nur in einzelne Follikelkanäle penetriert, eine Aussage, die im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen erstmals beschrieben wurde. In Übereinstimmung mit der Zielsetzung der Arbeit konnte unter Einsatz unterschiedlicher Untersuchungsmethoden gezeigt werden, dass die beschichteten Titandioxid-Mikropartikel im oberen Bereich der Hornschicht lokalisiert sind und damit als hocheffiziente Lichtschutzfilter den Schutz der darunter liegenden lebenden Bereiche der Haut garantieren. Der sichere Nachweis der Titandioxid-Mikropartikel innerhalb einzelner Follikelkanäle besitzt grundsätzliche Bedeutung für das Verständnis von Penetrationswegen. / The objective of this work was to determine the behaviour of titanium dioxide microparticles, used in modern sunscreen agents, with quantitative methods in order to receive statements about their suitability. The focal point of the investigations was the question on the distribution of the substance within the stratum corneum. Because of the well-known photocatalytic activity of titanium dioxide, our aim was to clarify whether a contact with the living cells of the skin could be excluded. For these measurements, two commercial titanium dioxide micro particles were used, covered with different coating materials. The calculation of the stratum corneum profile was a substantial prerequisite for these investigations. This was done by application of the tape stripping method in combination with the spectroscopic determination of the absorption in the visible range. The concentration of the titanium dioxide particles on the tape strips was determined by X-ray fluorescence measurements. In this manner it was possible for the first time, to perform standardized and reproducible in vivo measurements to investigate the penetration behaviour of coated titanium dioxide micro particles into the horny layer of the human skin. Predications could be made about the penetration behaviour of the applied micro particles by observation of the titanium dioxide concentrations in the stratum corneum during several days after long-term application of the substances. It could be shown that the examined substances were localized mainly in the upper layers of the stratum corneum, independently of their structure, coating and the volunteers. After clarifying these basic questions, it was necessary to explain the occurrence of extremely small concentrations of titanium-dioxide on tape strips, which were taken from deeper layers of the stratum corneum. This observed phenomenon was investigated by combining tape stripping with a selective staining of the tapes and with laser scanning microscopy. Investigations of a biopsy with x ray fluorescence measurements showed that the micro particles penetrate into the hair follicles, and in this manner reached areas below the stratum corneum. In this region, the micro particles were found only in follicle channels, but not within the area of the living cells. These results prove that titanium dioxide micro particles only penetrate into single follicle channels, a statement, which has been described here for the first time. In agreement with the objective of this thesis, it was shown, that the coated titanium dioxide micro particles were localized within the upper area of the horny layer and as high efficient sunscreen filters consequently guarantee, the protection of the living areas of the skin below. The proof of the titanium dioxide micro particles within individual follicle channels has basic importance for the understanding of the penetration pathways.

Atopic eczema is an incurable disorder of the skin. Sufferers are afflicted with hypersensitivity to environmental agents such as soaps (detergents), animal dander, pollen, specific foods and sometimes even water. Genetic mutations in atopic eczema compromise the development of the stratum corneum resulting in xerotic skin that is prone to cracking and increased permeability which leads to irritation due to the influx of exogenous material through the skin. The causes of atopic eczema are due to a combination of genetic and environmental factors and it is, therefore, a difficult disease to manage. Emollients and topical corticosteroids are the mainstay treatments for eczema. However, they do not treat the underlying cause of the flare-ups frequently seen in the condition; the damaged skin barrier. Defects in the skin barrier arise from premature desquamation of the stratum corneum. The main contributors to barrier breakdown are the up-regulation of skin proteases that are located in the skin. Since zinc is a known protease inhibitor, it would thus follow that a topical treatment for skin barrier repair should be developed. Therefore, the main objectives of this thesis are to successfully incorporate zinc into a formulation to develop a novel class of treatment for eczema and to assess the delivery of the element into the skin. In this thesis, methods to assess and characterise changes to skin barrier function and to extract and quantify zinc in the stratum corneum have been established. The development of two novel topically applied formulations containing zinc lactate as the active ingredient (1% w/w zinc lactate cream and a 2% w/v zinc lactate formulation) has been achieved and the uptake of zinc from the preparations in vitro determined. Further, the in vitro percutaneous penetration of zinc from three commercially available preparations has been investigated and compared to that recovered from the stratum corneum after passive diffusion with the novel zinc formulations. Additionally, in vivo uptake of zinc into human stratum corneum from Sudocremis ® reported. Scanning electron microscopy has revealed the distribution of zinc on the surface of skin treated with various formulations and has also allowed the efficiency of two cleaning procedures to be ascertained. The delivery of zinc from the novel topical formulation; 1% w/w zinc lactate cream, was more efficient than that the three commercial formulations and shows promise as a new approach to treat atopic eczema.

Introdução: o fator de proteção solar (FPS) dos filtros solares é determinado in vivo pela aplicação de uma quantidade padrão de 2mg/cm². Na prática, os usuários aplicam uma quantidade menor e de maneira irregular o que afeta o FPS final. Modelos matemáticos mostram que a reaplicação do fotoprotetor resulta em um aumento de 15-40% na capacidade de proteção à radiação ultravioleta. Objetivos: avaliar se a reaplicação de filtro solar aumenta a quantidade e melhora a regularidade do filme do produto na pele. Métodos: os voluntários selecionados foram solicitados a aplicar um filtro solar padronizado composto por benzofenona 6% (FPS 6) em ambos antebraços previamente lavados com sabonete neutro. Após 30 minutos o fotoprotetor foi reaplicado em um antebraço, selecionado previamente por computador para evitar a influência do lado dominante. Cinco fitas adesivas foram coletadas de duas diferentes áreas de cada antebraço, 30 minutos após a primeira aplicação e 30 minutos após a reaplicação. A concentração de benzofenona foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência e a quantidade do filtro estimada por correlação matemática entre a quantidade de benzofenona removida nas fitas e a concentração na formulação. Resultados: um total de 107 voluntários, com idades entre 18 e 35 anos, foram selecionados. Entre eles, 36 participaram da parte prática do estudo (21 mulheres e 15 homens, idade média de 22,6 anos) A mediana da quantidade do filme de filtro solar aplicado à pele com 1 aplicação foi de 0,43mg/cm² (0,17-1,07) e com 2 aplicações foi de 0,95mg/cm² (0,18-1,91) e essa diferença foi considerada estatisticamente significativa (p=0,002). A variação comparando a uniformidade do filme com 1 e 2 aplicações não foi significativa (p=0,423). Conclusões: a reaplicação de filtro solar resulta em uma melhora da quantidade de produto aplicado à pele, refletindo, provavelmente, em uma melhora da proteção à radiação ultravioleta. Contudo, mesmo com a reaplicação a quantidade mediana foi inferior à preconizada (2mg/cm²) e não foi uniforme, confirmando que o fator de proteção real é muito inferior ao estabelecido no rótulo do produto. Os resultados reforçam a recomendação de reaplicar o produto para atingir um melhor nível de fotoproteção. / Background: the sun protection factor (SPF) of sunscreens is determined in vivo by the application of a standard amount of 2mg/cm², under controlled conditions. Individuals usually apply a smaller and irregular amount, compromising the final sun protection. Theoretical models show that sunscreen reapplication results in an increase of 15% to 40% in the UV protection capacity. Objective: to verify how young individuals use the filter and whether its reapplication increases the amount and regularity of the product in the skin, under real conditions. Methods: the selected volunteers were asked to apply a standardized sunscreen with 6 % benzophenone on both forearms. After 30 minutes, the sunscreen was reapplied in one of the forearms. Five tape-strips were collected from 2 different sites in each forearm, 30 minutes after the first application and 30 minutes after reapplication. The concentration of benzophenone was measured by liquid chromatography and the quantity of filter was estimated by calculating the correlation between the amount of benzophenone that was removed by the tapes, and the quantity present in the formulation. Results: A total of 107 volunteers, with ages between 18 and 35 years, were selected. Among them, 36 volunteers (21 female and 15 male, mean age 22.6 years) participated in the practical part of the study. The overall median sunscreen amount was 0,43mg/cm² (0.17–1.07) with 1 application and 0.95mg/cm² (0.18-1.91) with 2 applications, and the difference between sites was significant (p=0,002). The variation comparing the uniformity of the film with 1 and 2 applications was not significant (p=0,423). Conclusion: the reapplication of sunscreen contributes for a better amount of the product in the skin, probably reflecting in a better sun protection. However, even with reapplication, the median amount was less than the recommended one (2mg/cm²) and not homogeneous, confirming that the real level of protection is much lower than the stated SPF of the product. The results support the recommendation for reapplying filters to obtain a more reliable chemical photoprotection.

Extensive research has already been performed on Aloe vera therefore it is important that researchers include other aloe species, such as Aloe marlothii and Aloe ferox, in studies involving aloe plant materials (Loots et al., 2007:6891). The use of natural products has regained popularity and in recent years the demand for alternative medication has risen considerably (Walji & Wiktorowicz, 2013:86). The hydration state of the human skin is fundamental for its normal functioning (Verdier-Sévrain & Bonté, 2007:75), with healthy skin possessing a water content higher than 10% (w/v) (Blank, 1952:439). This demonstrates the importance of the topical application of skin moisturisers as part of basic skin care regime (Verdier-Sévrain & Bonté, 2007:75). The first part of this project focused on the in vivo skin hydration effects of the precipitated polysaccharide components of A. vera, A. ferox and A. marlothii leaf gel materials (3% (w/v)) after single (30, 90 and 150 min after application) and multiple applications (twice daily application over a period of four weeks) on healthy volunteers, respectively. The anti-erythema effects of these aloe materials on sodium lauryl sulphate irritated skin were also examined. The skin hydration effects of the aloe materials were determined with the Corneometer® CM 825 and Visioscan® VC 98 during the short term study (single application) and longer term study (multiple applications). In addition, as an indirect measurement of skin hydration, the Cutometer® dual MPA 580 was used to measure skin elasticity during the longer term study. To determine the anti-erythema effects of the aloe materials when applied to irritated skin areas, the haemoglobin content of the skin was measured with a Mexameter® MX 18. The results from the in vivo study indicated that A. ferox gel material dehydrated the skin, whereas A. vera and A. marlothii gel materials hydrated the skin during the short term study. Results from the longer term study showed that all the aloe leaf materials have skin dehydration effects, probably due to the aloe absorbing moisture from the skin into the applied gel layer upon drying. From the anti-erythema study, it was seen that A. vera and A. ferox materials had the potential to reduce erythema on the skin similar to that of the positive control group (i.e. hydrocortisone gel) after six days of treatment. The skin possesses exceptional barrier properties which can mostly be ascribed to the outermost layer of the skin, the stratum corneum (SC). Due to the physical barrier the skin has against drug permeation, the delivery of drug molecules into and across the skin continues to be challenging (Lane, 2013:13) and to overcome this barrier, penetration enhancers can be used to efficiently deliver drugs across the skin (Barry, 2002:522). The aim of the second part of this project was to determine the skin penetration enhancing effects of the gel and whole leaf materials of A. vera, A. marlothii and A. ferox. Ketoprofen was used as the marker compound and a high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed and validated to determine the amount of ketoprofen present in the samples. Prior to the skin diffusion studies, membrane release studies were performed to test whether the solutions containing different concentrations of the aloe leaf materials (i.e. 3.00%, 1.50% and 0.75% (w/v)) released ketoprofen from their gel-like structures. From these studies, it was evident the 0.75% (w/v) concentration had the highest average percentage ketoprofen release, which was subsequently chosen as the concentration for the aloe leaf materials tested in the transdermal skin diffusion studies. The in vitro permeation study was conducted across dermatomed (400 μm thick) skin in Franz diffusion cells. Tape stripping was performed after completion of the diffusion studies to determine the concentration ketoprofen present in the SC-epidermis and epidermis-dermis layers of the skin. Results from the in vitro permeation study showed that A. vera gel enhanced the flux of ketoprofen to the highest extent (20.464 μg/cm2.h) when compared to the control group (8.020 μg/cm2.h). Aloe marlothii gel (12.756 μg/cm2.h) and A. ferox whole leaf material (12.187 μg/cm2.h) also enhanced the permeation of ketoprofen across the skin compared to the control group. A. vera gel material was the most efficient transdermal drug penetration enhancer of the selected aloe species investigated. In order to determine by which mechanism the aloe leaf materials enhanced the skin permeation of ketoprofen (Hadgraft et al., 2003:141), the permeation profiles were analysed using a non-linear curve-fitting procedure (Díez-Sales et al., 1991:3) to obtain α, β and kp values. A change in the α-value indicated the aloe leaf material influenced the partition coefficient (K), whereas a change in β indicated the aloe leaf material influenced the diffusivity (D) (with the assumption that h, the diffusional path length is constant) (Otto et al., 2010:278). The calculated α-values indicated the drug permeation enhancing effect of A. vera gel can be ascribed to an increased partitioning of the drug into the skin. The calculated β-values showed A. ferox whole leaf altered the diffusion characteristics of the skin for ketoprofen. The tape stripping results showed A. marlothii whole leaf delivered the highest concentration of the ketoprofen into the SC-epidermis and epidermis-dermis layers of the skin. / PhD (Pharmaceutics), North-West University, Potchefstroom Campus, 2014

Extensive research has already been performed on Aloe vera therefore it is important that researchers include other aloe species, such as Aloe marlothii and Aloe ferox, in studies involving aloe plant materials (Loots et al., 2007:6891). The use of natural products has regained popularity and in recent years the demand for alternative medication has risen considerably (Walji & Wiktorowicz, 2013:86). The hydration state of the human skin is fundamental for its normal functioning (Verdier-Sévrain & Bonté, 2007:75), with healthy skin possessing a water content higher than 10% (w/v) (Blank, 1952:439). This demonstrates the importance of the topical application of skin moisturisers as part of basic skin care regime (Verdier-Sévrain & Bonté, 2007:75). The first part of this project focused on the in vivo skin hydration effects of the precipitated polysaccharide components of A. vera, A. ferox and A. marlothii leaf gel materials (3% (w/v)) after single (30, 90 and 150 min after application) and multiple applications (twice daily application over a period of four weeks) on healthy volunteers, respectively. The anti-erythema effects of these aloe materials on sodium lauryl sulphate irritated skin were also examined. The skin hydration effects of the aloe materials were determined with the Corneometer® CM 825 and Visioscan® VC 98 during the short term study (single application) and longer term study (multiple applications). In addition, as an indirect measurement of skin hydration, the Cutometer® dual MPA 580 was used to measure skin elasticity during the longer term study. To determine the anti-erythema effects of the aloe materials when applied to irritated skin areas, the haemoglobin content of the skin was measured with a Mexameter® MX 18. The results from the in vivo study indicated that A. ferox gel material dehydrated the skin, whereas A. vera and A. marlothii gel materials hydrated the skin during the short term study. Results from the longer term study showed that all the aloe leaf materials have skin dehydration effects, probably due to the aloe absorbing moisture from the skin into the applied gel layer upon drying. From the anti-erythema study, it was seen that A. vera and A. ferox materials had the potential to reduce erythema on the skin similar to that of the positive control group (i.e. hydrocortisone gel) after six days of treatment. The skin possesses exceptional barrier properties which can mostly be ascribed to the outermost layer of the skin, the stratum corneum (SC). Due to the physical barrier the skin has against drug permeation, the delivery of drug molecules into and across the skin continues to be challenging (Lane, 2013:13) and to overcome this barrier, penetration enhancers can be used to efficiently deliver drugs across the skin (Barry, 2002:522). The aim of the second part of this project was to determine the skin penetration enhancing effects of the gel and whole leaf materials of A. vera, A. marlothii and A. ferox. Ketoprofen was used as the marker compound and a high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed and validated to determine the amount of ketoprofen present in the samples. Prior to the skin diffusion studies, membrane release studies were performed to test whether the solutions containing different concentrations of the aloe leaf materials (i.e. 3.00%, 1.50% and 0.75% (w/v)) released ketoprofen from their gel-like structures. From these studies, it was evident the 0.75% (w/v) concentration had the highest average percentage ketoprofen release, which was subsequently chosen as the concentration for the aloe leaf materials tested in the transdermal skin diffusion studies. The in vitro permeation study was conducted across dermatomed (400 μm thick) skin in Franz diffusion cells. Tape stripping was performed after completion of the diffusion studies to determine the concentration ketoprofen present in the SC-epidermis and epidermis-dermis layers of the skin. Results from the in vitro permeation study showed that A. vera gel enhanced the flux of ketoprofen to the highest extent (20.464 μg/cm2.h) when compared to the control group (8.020 μg/cm2.h). Aloe marlothii gel (12.756 μg/cm2.h) and A. ferox whole leaf material (12.187 μg/cm2.h) also enhanced the permeation of ketoprofen across the skin compared to the control group. A. vera gel material was the most efficient transdermal drug penetration enhancer of the selected aloe species investigated. In order to determine by which mechanism the aloe leaf materials enhanced the skin permeation of ketoprofen (Hadgraft et al., 2003:141), the permeation profiles were analysed using a non-linear curve-fitting procedure (Díez-Sales et al., 1991:3) to obtain α, β and kp values. A change in the α-value indicated the aloe leaf material influenced the partition coefficient (K), whereas a change in β indicated the aloe leaf material influenced the diffusivity (D) (with the assumption that h, the diffusional path length is constant) (Otto et al., 2010:278). The calculated α-values indicated the drug permeation enhancing effect of A. vera gel can be ascribed to an increased partitioning of the drug into the skin. The calculated β-values showed A. ferox whole leaf altered the diffusion characteristics of the skin for ketoprofen. The tape stripping results showed A. marlothii whole leaf delivered the highest concentration of the ketoprofen into the SC-epidermis and epidermis-dermis layers of the skin. / PhD (Pharmaceutics), North-West University, Potchefstroom Campus, 2014

Pigmentation disorders occur in multiple conditions (Hakozaki et al., 2006:105). Although many modalities of treatments are available, none are completely satisfactory (Briganti et al., 2003:101). Two cytokines normally present in the skin, transforming growth factor–beta1 (TGF–81) and tumour necrosis factor–alpha (TNF–9), have been shown to inhibit melanin synthesis (Martinez–Esparza, 2001:972). The stratum corneum has been commonly accepted as the main barrier to percutaneous absorption. Many techniques have been applied to overcome this barrier properties and to enhance penetration with varying success (Pellet et al., 1997:92). The objective of this study was to investigate the topical delivery of the above mentioned peptide drugs with aid of the Pheroid drug delivery system. Pheroid technology is a delivery system that promotes the absorption and increases the efficacy of dermatological, biological and oral medicines in various pharmacological groups (Grobler et al., 2008:4). Pheroid entraps drugs with high efficiency and delivers them with remarkable speed to target sites (Grobler, 2004:4). In order to avoid degradation of these peptides, bestatin hydrochloride (an aminopeptidase inhibitor), was used (Lkhagvaa et al., 2008:386). Topical drug delivery was achieved by means of vertical Franz cell diffusion studies performed over a 6 and 12 h period. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) detection was used to detect cytokine concentrations. Entrapped cytokine solutions were monitored by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Upon removal of donor and receptor compartments, skin discs were subjected to tape stripping in order to establish the amount of active present within the stratum corneum and epidermis as well as the remaining dermis (Pellet et al., 1997:92). When comparing the two studies with each other, it is evident that the diffused concentration values obtained with PBS (phosphate buffer solution, pH 7.4) was lower than that obtained with the Pheroid drug delivery system. Both cytokine concentrations were successfully delivered topically as a minimum of concentrations for both actives were detected. This positive result was confirmed as well by the amount of active detected in stratum corneum–epidermis and epidermis–dermis solutions. / Thesis (M.Sc. (Pharmaceutics))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2011.

Pigmentation disorders occur in multiple conditions (Hakozaki et al., 2006:105). Although many modalities of treatments are available, none are completely satisfactory (Briganti et al., 2003:101). Two cytokines normally present in the skin, transforming growth factor–beta1 (TGF–81) and tumour necrosis factor–alpha (TNF–9), have been shown to inhibit melanin synthesis (Martinez–Esparza, 2001:972). The stratum corneum has been commonly accepted as the main barrier to percutaneous absorption. Many techniques have been applied to overcome this barrier properties and to enhance penetration with varying success (Pellet et al., 1997:92). The objective of this study was to investigate the topical delivery of the above mentioned peptide drugs with aid of the Pheroid drug delivery system. Pheroid technology is a delivery system that promotes the absorption and increases the efficacy of dermatological, biological and oral medicines in various pharmacological groups (Grobler et al., 2008:4). Pheroid entraps drugs with high efficiency and delivers them with remarkable speed to target sites (Grobler, 2004:4). In order to avoid degradation of these peptides, bestatin hydrochloride (an aminopeptidase inhibitor), was used (Lkhagvaa et al., 2008:386). Topical drug delivery was achieved by means of vertical Franz cell diffusion studies performed over a 6 and 12 h period. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) detection was used to detect cytokine concentrations. Entrapped cytokine solutions were monitored by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Upon removal of donor and receptor compartments, skin discs were subjected to tape stripping in order to establish the amount of active present within the stratum corneum and epidermis as well as the remaining dermis (Pellet et al., 1997:92). When comparing the two studies with each other, it is evident that the diffused concentration values obtained with PBS (phosphate buffer solution, pH 7.4) was lower than that obtained with the Pheroid drug delivery system. Both cytokine concentrations were successfully delivered topically as a minimum of concentrations for both actives were detected. This positive result was confirmed as well by the amount of active detected in stratum corneum–epidermis and epidermis–dermis solutions. / Thesis (M.Sc. (Pharmaceutics))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2011.