Neurons are polarized cells with dendrites and an axon projecting from their cell body. Due to this polarized structure a major challenge for neurons is the transport of material to and from the cell body. The transport that occurs between the cell body and axons is called Axonal transport. Axonal transport has three major components: molecular motors which act as vehicles, microtubules which serve as tracks on which these motors move and microtubule associated proteins which regulate the transport of material. Axonal transport maintains the integrity of a neuron and its dysfunction is linked to neurodegenerative diseases such as, Alzheimer’s disease, Frontotemporal dementia linked to chromosome 17 and Pick’s disease. Therefore, understanding the process of axonal transport is extremely important. Single particle tracking is one method in which axonal transport is studied. This involves fluorescent labelling of molecular motors and microtubule associated proteins and tracking their position in time. Single particle tracking has shown that both, molecular motors and microtubule associated proteins exhibit motion with multiple components. These components are directed, where motion is in one direction, diffusive, where motion is random, and static, where there is no motion. Moreover, molecular motors and microtubule associated proteins also switch between these different components in a single instance of motion. We have developed a MATLAB program, called MixMAs, which specializes in analyzing the data provided by single particle tracking. MixMAs uses a sliding window approach to analyze trajectories of motion. It is capable of distinguishing between different components of motion that are exhibited by molecular motors and microtubule associated proteins. It also identifies transitions that take place between different components of motion. Most importantly, it is not limited by the number of transitions and the number of components present in a single trajectory. The analysis results provided by MixMAs include all the necessary parameters required for a complete characterization of a particle’s motion. These parameters are the number of different transitions that take place between different components of motion, the dwell times of different components of motion, velocity for directed component of motion and diffusion coefficient for diffusive component of motion. We have validated the working of MixMAs by simulating motion of particles which show all three components of motion with all the possible transitions that can take place between them. The simulations are performed for different values of error in localizing the position of a particle. The simulations confirm that MixMAs accurately calculates parameters of motion for a range of localization errors. Finally, we show an application of MixMAs on experimentally obtained single particle data of Kinesin-3 motor.

Alzheimer¡¦s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive deterioration of cognitive functions and the presence of intracellular neurofibrillary tangles (NFT) and extraneuronal senile plaques (SP). The major component of NFT is the hyperphosphorylated microtubules-associated protein tau. SP is consistent of extracellular deposition of £]-amyloid (A£]), mainly A£]1-42 peptide (A£]42). Given the need of tools for early and accurate diagnosis and prediction of disease progression and monitoring the efficacy of therapeutic agents for AD, development of cerebrospinal fluid (CSF) biomarkers have become a rapidly growing research field. In our study, patients with AD (n=28), non-AD dementia (n=16), other neurological disorder (OND, n=14) and healthy controls (HC, n=21) were included. Our results revealed that AD patients have significant higher CSF total tau (t-tau) and lower A£]42 levels than HC and OND groups. There is no significant difference of both CSF t-tau and A£]42 levels between AD and non-AD dementia groups. These results suggest that both CSF t-tau and A£]42 are good biomarkers for distinguishing AD from non-dementia control subjects but demonstrate less discriminating power in differentiating AD from non-AD dementia. Moreover, our results show only CSF t-tau level but not A£]42 has an inverse correlation with the score of short-term memory patients with AD (spearman: r = -0.444; p=0.018). These data indicate the higher CSF t-tau level is associated with much NFT pathology and more severe impairment of short-term memory in AD patients. In the study of the moleacular mechanism of tau¡¦s hyperphosphorylation by glycogen synthase kinase 3b (GSK3b), we show that the T231 is the primary phosphorylation site for GSK3b and the tau227-237 (AVVRTPPKSPS) derived from tau containing T231P232 motif is identified as the GSK3b binding site with high affinity of a Kd value 0.82 ¡Ó 0.16 mM. Our results suggest that direct binding and phosphorylation of T231P232 motif by GSK3b induces conformational change of tau and consequentially alters the inhibitory activity of its N-terminus that allows the sequential phosphorylation of C-terminus of tau by GSK3b. Furthermore, hyperphosphorylation reduces tau¡¦s ability to promote tubulin assembly and to form bundles in N18 cells. T231A mutant completely abolishes tau phosphorylation by GSK3b and retains the ability to promote tubulin polymerization and bundle formation. Taken together, these results suggest that phosphorylation of T231 by GSK3b may play an important role in tau¡¦s hyperphosphorylation and functional regulation.

Ulm, Univ., Diss., 2009.

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La protéine Tau est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives regroupées sous le terme de Tauopathies dont la plus fréquente est la maladie d’Alzheimer (MA), qui est caractérisée, dans les phases précoces, par une augmentation du stress oxydant dans le cerveau des patients. L’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ou ROS) dans les neurones mène notamment à l’apparition de dommages au niveau de leur ADN génomique. Les neurones ne se divisant pas, l’accumulation de dommages non réparés au niveau de la molécule d’ADN induit, à terme, des conséquences importantes sur leur fonctionnement. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’accumulation de dommages à l’ADN neuronal dans la MA ne sont pas élucidés. La MA est également caractérisée par la présence de protéine Tau hyper et anormalement phosphorylée. Cette protéine Tau pathologique s’agrège et forme les « dégénérescences neurofibrillaires » (ou DNF). Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau dans les cerveaux Alzheimer demeurent encore peu connus. Néanmoins, il est maintenant admis que bien plus que les agrégats insolubles, ce sont des petites formes oligomériques de Tau qui sont toxiques dans les neurones.Tau peut se localiser dans les conditions physiologiques au niveau de la membrane plasmique et au sein du noyau des neurones. Dans le laboratoire, il a été montré dans des cultures primaires de neurones murins que Tau joue un rôle essentiel dans la protection de l’ADN génomique neuronal en condition de stress. Le premier objectif de cette thèse était de savoir si in vivo Tau joue un rôle protecteur vis-à-vis de l’ADN. Nous avons donc mis au point un modèle murin de stress hyperthermique, stress induisant la formation de ROS. Nous avons ainsi validé in vivo la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l’ADN génomique. Nous avons également mis en évidence que l’absence de Tau altérait l’intégrité d’ARN cytoplasmiques et nucléaires en condition de stress, ce qui suggère que Tau pourrait jouer un rôle dans le contrôle qualité des ARN. Le deuxième objectif était d’évaluer l’impact de la pathologie Tau sur sa fonction protectrice de l’ADN. Notre hypothèse était que la pathologie Tau pourrait avoir un rôle délétère sur sa fonction protectrice de l’ADN génomique. L’impact de la pathologie Tau a alors été évalué in vivo dans un modèle de souris transgéniques (THY-Tau22). Nos résultats indiquent que dans les neurones hippocampiques soumis à un stress hyperthermique et possédant une pathologie de Tau précoce, il y a la perte de la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l’intégrité des acides nucléiques. Par ailleurs, nous avons observé qu’une augmentation de ROS jouait le rôle d’agent inducteur in vivo dans la formation de petits oligomères de Tau dans le cytoplasme et le noyau de neurones hippocampiques. De façon intéressante nous avons observé une corrélation entre les neurones possédant des dommages aux acides nucléiques et la formation de petits oligomères de Tau. Ces résultats mettent en lumière l’existence d’une fenêtre temporelle critique où une augmentation du stress oxydant induit conjointement l’oligomérisation de Tau et la formation de dommages aux acides nucléiques dans des neurones présentant une pathologie précoce. Ceci suggère que des formes oligomériques de Tau seraient impliqués dans l’altération des acides nucléiques.Les phospholipides peuvent également servir d’agent inducteur pour l’oligomérisation de Tau. Ils sont retrouvés dans les membranes. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines de la membrane plasmique riches en sphingolipides et en cholestérol qui pourraient servir de point de nucléation pour l’oligomérisation de Tau. Avant de pouvoir répondre à cette question, le troisième objectif a été d’étudier l’état de phosphorylation de Tau associée aux radeaux lipidiques. Nos résultats indiquent que dans le cortex de patients atteints de la MA, la protéine Tau associée aux radeaux lipidiques est hyperphosphorylée et oligomérisée. / Tau protein is involved in neurodegenerative diseases called tauopathies. The most frequent tauopathies is Alzheimer's disease (AD). This dementia is characterized, in the early phases, by an increase of oxidative stress in the brain of patients. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in neurons leads to the appearance of damage to genomic DNA. Neurons do not divide, so unrepaired DNA damage will have important consequences on neuronal functioning. However, mechanisms involved in DNA damage accumulation in AD have not been deciphered.AD is also characterized by the presence of hyper and abnormally phosphorylation of Tau protein. Pathological Tau forms aggregates and leads to the formation of neurofibrillary tangles. However, mechanisms involved in the intracellular aggregation of Tau in AD brains remain unknown. Nevertheless, it is now admitted that, much more than insoluble aggregates of Tau, small oligomers are the toxic form of Tau.Tau protein is mainly known for its MAP (Microtubule Associated Protein) function. However, in physiological condition, it can also be located at the plasmic membrane level and in neurons nucleus and therefore may have others functions. A new function of Tau was revealed in the laboratory. It was shown that Tau plays an essential role in neuronal genomic DNA protection in stress condition. This study was performed in primary neuronal cultures of embryonic mice neurons. The first objective of this thesis was to challenge the DNA protective function of Tau in vivo. To answer this question, we designed a murine model of hyperthermic stress which leads to the formation of ROS. Using this model, we showed that Tau is able to protect in vivo the genomic DNA of hippocampal neurons of mice submitted to hyperthermic stress. We also highlighted the fact that Tau deficiency alters the integrity of cytoplasmic and nuclear ARN suggesting that Tau could play a role in quality control of RNA. Our second objective was to study if Tau pathology has a deleterious impact on its DNA protective function. The impact of Tau pathology has been analyzed in the transgenic mouse model THY-Tau 22 mice. Our results indicate that an increase of ROS induces the loss of the nucleic acid protective function of Tau selectively in early stages of Tau pathology. We also observed that hyperthermic stress plays an inducing role in vivo in the formation of small Tau oligomers in the nuclei and the cytoplasm of hippocampal neurons. Interestingly, we observed a correlation between nucleic acid damage and the formation of Tau oligomers suggesting that oligomers would be the toxic forms of Tau involved in the alteration of nucleic acid integrity. These results bring to light the existence of a critical time window where an increase of ROS induces both Tau oligomerization and nucleic acid damage in neurons displaying early Tau pathology.Phospholipids, which are principally found in membranes, can be an inducing agent for Tau oligomerization. Lipid rafts are microdomains of the plasmic membrane, which are rich in sphingolipids, and cholesterol. A hypothesis is that lipid rafts could be a nucleation point for Tau oligomerisation. Before being able to answer this question, the third objectif was to study the phosphorylation and conformational state of Tau associated with rafts in physiological and pathological conditions. Our results indicate that in the cortex of AD patients, Tau associated to lipid rafts is hyperphosphorylated, abnormally conformed and oligomerized.

Inclusion body myositis and Alzheimer's disease are age-related disorders characterized in part by the appearance of intracellular lesions composed of filamentous aggregates of the microtubule-associated protein tau. Abnormal tau phosphorylation accompanies tau aggregation and may be an upstream pathological event in both diseases. Enzymes implicated in tau hyperphosphorylation in Alzheimer's disease include members of the casein kinase 1 family of phosphotransferases, a group of structurally related protein kinases that frequently function in tandem with the ubiquitin modification system. To determine whether casein kinase 1 isoforms associate with degenerating muscle fibers of inclusion body myositis, muscle biopsy sections isolated from sporadic disease cases were subjected to double-label fluorescence immunohistochemistry using selective anti-casein kinase 1 and anti-phospho-tau antibodies. Results showed that the alpha isoform of casein kinase 1, but not the delta or epsilon isoforms, stained degenerating muscle fibers in all eight inclusion body myositis cases examined. Staining was almost exclusively localized to phospho-tau-bearing inclusions. These findings, which extend the molecular similarities between inclusion body myositis muscle and Alzheimer's disease brain, implicate casein kinase 1 alpha as one of the phosphotransferases potentially involved in tau hyperphosphorylation.

Das Tau-Protein ist ein Mikrotubuli-assoziiertes-Protein, welches an der Stabilisierung der Mikrotubuli beteiligt ist (Weingarten et al. 1975; Drubin 1986). Bei bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen, den Tauopathien, kommt es zur pathologischen Phosphorylierung und Aggregation des Tau-Proteins im Gehirn der Betroffenen (Spillantini et al. 1997). Zu den Tauopathien zählen zahlreiche Erkrankungen, unter anderem die Alzheimersche Demenz, die chronisch-traumatische Enzephalopathie sowie einige Untergruppen der Frontotemporalen Demenz. Dabei kommt es zur Ablagerung von hyperphosphoryliertem und amyloidogen aggregiertem Tau-Potein, welches sich in Form von Tau-Protein Filmanten zu den Neurofibrillären Tangles (NFTs) zusammenlagert (Gendron und Petrucelli 2009). In dieser Arbeit wurde die Frontotemporale Demenz, genauer gesagt die Frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus assoziiert mit Chromosom 17 (FTDP17) untersucht (Foster et al. 1997). Ursache der FTDP17 können unter anderem Mutationen im MAPT-Gen sein, welches das Tau-Protein kodiert (Boeve und Hutton 2008). Die hier untersuchte P301L-Mutation bewirkt den Austausch von Prolin gegen Leucin an der Aminosäureposition 301 [Ausgehend von der längsten Tau-Protein Isoform: 4R2N] in der Mikrotubuli-bindenden-Domäne des Tau-Proteins (Hutton et al. 1998; Spillantini et al. 1998). Hierdurch kommt es zu einer eingeschränkten Bindung des Tau-Proteins an die Mikrotubuli, was die Bildung und Ablagerung von NFTs im Gehirn der betroffenen Personen bedingt (Spillantini et al. 1998)(Spillantini et al. 1998). Ziel dieser Arbeit war es die Progression der Tau-Protein-Pathologie systematisch an einem P301L-Mausmodell zu untersuchen. Dafür wurden weibliche und männliche Mäuse zu 2 verschiedenen Alterszeitpunkten in 14 neuroanatomischen Gebieten untersucht. Folgende Hypothese wurde dazu aufgestellt: Hypothese 1: Bei weiblichen sowie bei älteren Mäusen (6-11 Monate) des P301L-Mausmodells kommt es zu einer stärkeren Ausprägung von pathologisch phosphoryliertem Tau-Protein und von Tau-Protein-Aggregaten. Zusätzlich wurden 3 mögliche Einflussfaktoren auf die Ausbreitung der Tau-Protein-Pathologie untersucht. Es wurde zunächst Aggrecan, ein Chondroitin-Sulfat-Proteoglykan und Bestandteil der Perineuronalen Netze, betrachtet (Yamaguchi 2000; Morawski et al. 2012a). Perineuronalen Netzen wird eine protektive Wirkung bei neurodegenerativen Erkrankungen zuteil (Morawski et al. 2010; Morawski et al. 2012b; Suttkus et al. 2016). Als weiterer Einflussfaktor wurde die AMP-related-Kinase 5 (ARK5) untersucht, welche zu den AMP aktivierten Protein-Kinasen zählt (Suzuki et al. 2003). Es handelt sich um eine Serin-Threonin-Kinase, welche an der pathologischen Phosphorylierung des Tau-Proteins beteiligt ist (Lasagna-Reeves et al. 2016). Als drittes wurde Gigaxonin, ein E3-Ubiquitin-Ligase-Adapter-Protein, betrachtet (Bomont et al. 2000). Gigaxonin ist am proteasomalen Abbau zahlreicher Intermediär- und Neurofilamente beteiligt und ist Bindungspartner anderer Mikrotubuli-assoziierten-Proteine (Bomont 2016; Ding et al. 2006; Ding et al. 2002). Hypothese 2: Perineuronale Netze wirken protektiv gegenüber der übermäßigen und der pathologischen Phosphorylierung des Tau-Proteins. Aggrecan dient als Marker der Perineuronalen Netze. Dementsprechend gibt es in Gebieten mit hoher Aggrecan Expression eine verminderte pathologische Phosphorylierung und Tau-Protein-Aggregation. Hypothese 3: Die AMP-related-Kinase 5 (ARK5) ist an der pathologischen Phosphorylierung des Tau-Proteins beteiligt. In Gebieten mit starker Expression der ARK5 kann auch eine übermäßige sowie pathologische Phosphorylierung des Tau-Proteins festgestellt werden. Hypothese 4: Gigaxonin ist als E3-Ubiquitin-Ligase-Adapter-Protein am proteasomalen Abbau des Tau-Proteins beteiligt und mit ihm ko-lokalisiert. Es wurden 2 Alterszeitpunkte (2 Monate und 6-11 Monate) in weiblichen und männlichen transgenen (hTauP301L +/+/ mTau-/-, tg) Mäusen betrachtet. Als Vergleichsgruppen wurden Wildtyp- (mTau+/+, wt) und Knockout- (mTau-/-, ko) Mäuse untersucht. Die Ausbreitung der Tau-Protein-Pathologie wurde systematisch in 14 neuroanatomischen Gebieten mittels Immunhistochemie erforscht. Es wurde die Menge an Gesamttau-Protein, phosphoryliertem und pathologisch phosphoryliertem Tau-Protein bestimmt. Zur Quantifizierung wurden Westernblots und ELISAs durchgeführt, wobei im ELISA zusätzlich die Menge an Tau-Protein-Aggregaten gemessen werden konnte. Die wichtigsten Ergebnisse der durchgeführten Versuche werden im Folgenden vorgestellt: Gesamttau-Protein: Für das Gesamttau-Protein ergab sich eine einheitliche Verteilung zwischen den verschiedenen transgenen Maustypen. Es gab keinen Unterschied im Gesamttau-Protein-Gehalt zwischen weiblichen und männlichen bzw. zwischen alten und jungen transgenen Mäusen. Im Westernblot wurde signifikant mehr Tau-Protein bei transgenen Mäusen im Gegensatz zu Wildtyp-Tieren detektiert (p<0,05). Im ELISA zeigte sich hingegen kein signifikanter Unterschied in der Expression des Gesamttau-Proteins bei transgenen (53,3 ng/ml) bzw. Wildtyp-Mäusen (47,4 ng/ml). Phosphoryliertes Tau-Protein: Es wurde in 6 der 14 untersuchten Gebiete signifikant mehr phosphoryliertes Tau-Protein bei transgenen weiblichen Mäusen im Vergleich zur gleichaltrigen männlichen Vergleichsgruppe gemessen. In ebenfalls 6 Gebieten wurde signifikant mehr phosphoryliertes Tau-Protein bei alten weiblichen Mäusen im Vergleich mit jungen weiblichen Mäusen gemessen. Generell wurden im Hippocampus fast keine Zellen dieses Phosphorylierungstyps detektiert (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 0,0 positive Zellen/ 0,1mm²), während der Hypothalamus (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 14,93 positive Zellen/ 0,1mm²) sowie der Nucleus Edinger Westphal (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 19,05 positive Zellen/ 0,1mm²) am stärksten betroffen waren. Pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein: In 5 von 14 untersuchten Gebieten konnten bei transgenen weiblichen Mäusen signifikant mehr pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein als bei ihrer gleichaltrigen männlichen Vergleichsgruppe gemessen werden. In 7 Gebieten hatten alte weibliche Mäuse signifikant mehr pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein als ihre jüngere Vergleichsgruppe. Auch hier waren im Hippocampus fast keine Zellen welche diesen Phosphorylierungsstatus aufwiesen (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 0,0 positive Zellen/ 0,1mm²), während im Hypothalamus (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 11,2 positive Zellen/ 0,1mm²) und im Nucleus Edinger-Westphal (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 18,57 positive Zellen/ 0,1mm²) eine sehr starke Expression stattfand. Tau-Protein-Aggregate: Bei der Bestimmung der Tau-Protein-Aggregate hatten transgene Mäuse im Durchschnitt 13,2 ng/ml, Wildtyp Mäuse 2,4 ng/ml und Knockout Mäuse 0 ng/ml. Es konnte ein signifikanter Unterschied zwischen allen 3 Mausgruppen gemessen werden. Innerhalb der transgenen Mausgruppen hatten weibliche Mäuse signifikant mehr Tau-Protein-Aggregate (26,9 ng/ml) als ihre gleichaltrige männliche Vergleichsgruppe (1,7 ng/ml) (p<0,05). Tau-Protein modifizierende Enzyme und Proteine: Für keines der untersuchten Proteine bzw. Enzyme ließ sich eine Ko-Lokalisation mit pathologisch phosphoryliertem Tau-Protein nachweisen. Für Gigaxonin konnte jedoch im Westernblot ein signifikant höherer Wert bei transgenen Mäusen im Gegensatz zu Tau-Protein-Knockout-Mäusen gemessen werden. Mithilfe dieser Studie konnte gezeigt werden, dass ältere Mäuse des P301L-Mausmodells mehr phosphoryliertes und aggregiertes Tau-Protein exprimieren als junge Mäuse. Es wurde ebenso belegt, dass auch bei diesem P301L-Mausmodell weibliche Mäuse stärker betroffen sind als männliche Mäuse. In dieser Arbeit konnten eine Vielzahl von neuroanatomischen Gebieten mit signifikanten pathologischen Tau-Protein Phosphorylierungen und Aggregationen identifiziert werden, welche nun in weiterführenden Studien genauer untersucht werden können.  :1 Einleitung 1 1.1 Tau-Protein 1 1.1.1 Aufbau 1 1.1.2 Funktion 3 1.1.3 Tau-Protein modifizierende Enzyme und Proteine 4 1.1.4 Tauopathien 6 1.2 Frontotemporale Demenz 9 1.2.1 Epidemiologie, Symptome, Diagnostik und Therapie 9 1.2.2 Frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus assoziiert mit Chromosom 17 11 1.2.3 P301L-Mutation 11 1.3 Untersuchte neuroanatomische Gebiete 12 2 Aufgabenstellung 15 3 Materialien und Methoden 16 3.1 P301L-Mausmodell 17 3.2 Immunhistochemie 18 3.2.1 Gewebefixierung 20 3.2.2 Mikrotomschnitte 20 3.2.3 Avidin-Biotin-Komplexmethode 20 3.2.4 Auswertung am AxioScan.Z1 23 3.3 Westernblot 24 3.3.1 Gewebepräparation 26 3.3.2 Gelelektrophorese 26 3.3.3 Proteintransfer 27 3.3.4 Proteindetektion 27 3.3.5 Bestimmung der Proteingesamtmenge 29 3.3.6 Auswertung 29 3.4 ELISA 30 3.4.1 Gewebepräparation 30 3.4.2 ELISA 30 3.4.3 Auswertung 33 3.5 Statistische Methoden 33 4 Ergebnisse 34 4.1 Immunhistochemie 34 4.1.1 Tau-Protein 34 IV 4.1.2 Tau-Protein modifizierende Enzyme und Proteine 43 4.2 Westernblot 44 4.2.1 Tau-Protein 44 4.2.2 Gigaxonin 45 4.3 ELISA 46 4.3.1 Gesamttau-Protein 47 4.3.2 Aggregiertes Tau-Protein 47 5 Diskussion 50 5.1 Diskussion der Methoden 50 5.1.1 Diskussion des P301L-Mausmodells 50 5.1.2 Diskussion der Immunhistochemie 51 5.1.3 Diskussion des Westernblots 52 5.1.4 Diskussion des ELISAs 53 5.2 Diskussion der Tau-Protein-Expression 54 5.2.1 Diskussion der Tau-Protein-Antikörper 54 5.2.2 Regionale und Altersabhängige Expression des Tau-Proteins 56 5.2.3 Geschlechtsabhängige Expression des Tau-Proteins 59 5.3 Diskussion der Tau-Protein modifizierenden Enzyme und Proteine 61 5.3.1 Aggrecan 61 5.3.2 ARK5 62 5.3.3 Gigaxonin 63 5.4 Limitationen und Ausblick 63 6 Zusammenfassung 65 7 Literaturverzeichnis 69 8 Anlagen 78 8.1 Auswertung der Immunhistochemie 78 8.2 Auswertung der Westernblots 88 8.2.1 Tau-Protein Westernblots 88 8.2.2 Gigaxonin-Westernblot 91 8.3 Auswertung der ELISAs 92 8.3.1 Gesamttau-Protein 92 8.3.2 Tau-Protein-Aggregate 93 9 Selbstständigkeitserklärung 96 10 Danksagung 97

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In dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur rückführbaren Proteinquantifizierung unter Verwendung von Schwefelisotopenverdünnung mit induktiv gekoppelter Plasmamassenspektrometrie (ID-ICP-MS) entwickelt. Die Methode dient zur zuverlässigen Quantifizierung laborinterner Proteinstandards. Sie eignet sich nur zur Analyse reiner Proteine, deren Stöchiometrie bekannt ist, da die Proteinkonzentration aus dem Schwefelgehalt bestimmt wird. Nicht proteingebundener Schwefel wird durch Membranfiltration von der Proteinfraktion abgetrennt und mit ID-ICP-MS quantifiziert. Der Gesamtschwefelgehalt in der Probe wird ebenfalls mittels ID-ICP-MS quantifiziert und um die Menge an ungebundenem Schwefel korrigiert. Die Optimierung der Probenvorbereitung zeigte, dass ein Aufschluss die Unsicherheit des Ergebnisses verbessert. Für die Methodenentwicklung wurden ein zertifiziertes Rinderserumalbumin-Referenzmaterial (BSA), sowie ein kommerzielles Avidin verwendet. Die Bestimmung der Proteinmassenfraktionen und Unsicherheitsbudgets erfolgte nach Korrektur für den ungebundenen Schwefel (0,4 % für BSA, 30 % für Avidin). Die Methode wurde auf das Tau-Protein angewendet, das ein Biomarker für die sogenannten „Tauopathien“ ist – eine Gruppe neurodegenerativer Krankheiten, die die Alzheimer-Krankheit und die frontotemporale Demenz einschließen. Durch Verwendung eines isotopenangereicherten Spikes, der an das SI-System angebunden ist, wurde die metrologische Rückführbarkeit für den Massenanteil des Tau-Proteins erreicht. Dieser Tau-Standard wurde zur absoluten Quantifizierung toxischer transgener Tau-Spezies in der löslichen Hirnfraktion transgener Mäuse verwendet. Die entwickelte Methode ist für die rückführbare Quantifizierung von Proteinen zur Verwendung als Standards in der biologischen und medizinischen Forschung anwendbar. Sie zeigte eine ähnliche Präzision wie etablierte Verfahren, erforderte jedoch weniger Probenvorbereitung und keine spezies-spezifischen Standards. / In this work, a method for traceable protein quantification using sulphur isotope dilution inductively coupled plasma mass spectrometry (ID-ICP-MS) was developed. The method is intended for the reliable quantification of in-house protein standards. It is only suited for pure protein formulations for proteins of known stoichiometry because the protein concentration is determined from the sulphur content. Non-protein bound sulphur is separated from the protein fraction by membrane filtration and is quantified by ID-ICP-MS. The total sulphur content in the sample is as well quantified by ID-ICP-MS and corrected for the amount of non-protein bound sulphur. Optimisation of the sample preparation showed that digestion improves the uncertainty of the result. For method development, a certified reference material bovine serum albumin (BSA) and a commercial avidin were used. The protein mass fractions with full uncertainty budgets were determined after correction for unbound sulphur. The developed procedure was applied to the tau protein, which is a biomarker fort he so-called „tauopathies“ – a group of neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease and Frontotemporal dementia. By employing an isotopically enriched spike, which is linked to the SI system, full metrological traceability was achieved for the tau mass fraction. The mass fraction of (0.328 ± 0.036) g kg-1 for tau was determined by ID-ICP-MS and confirmed by amino acid analysis. This tau standard was used for the absolute quantification of toxic transgenic tau species in the soluble brain fraction of transgenic mice. The developed method is applicable for the traceable quantification of proteins for use as standards in biological and medical research. The precision of the method was similar to established absolute protein quantification procedures while requiring less sample preparation and no species-specific standards.

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