Tau protein is one of the microtubule-associated proteins (MAPs) and mainly expressed in neuronal cells. It hasbeen demonstrated that Tau may play an important role in regulating microtubule dynamic in neurons. Structurally and functionally, Tau protein composed of regulatory projection domain in N-terninus and microtubule-binding domain in C-terminus. It has been shown that the biological function of Tau protein was regulated by phosphorylation and dephosphorylation. In Alzheimer¡¦s disease (AD) brain, hyperphosphorylated Tau caused by over active kinases may contribute to the disassociation of Tau from microtubule and form the pathologically hallmarker, paired helical filaments (PHFs). The reason to study cdc2 and GSK3£] is two folds. First, both cdc2 and GSK3£] activities are raised abbrently in AD brain. Second, the phosphorylation sites of cdc2 and GSK3£] have been identified as those in PHFs.These prompted us to regard cdc2 and GSK3£] as candidates that hyperphosphorylated Tau in AD. In the following study, we used immunofluorescence analysis, co-immunoprecipitation and GST-fusion protein pull down assay to clarify the subcellular localization of Tau. We also shown that the interaction between tubulin withfull length Tau (Tau WT) and some Tau mutants that we found that not only Tau WT, but also N-terminus of Tau (Tau-N) and C-terminus of Tau (Tau-C) can bind to tubulin. Surprisingly, we observed that a fragment of N-terminus, Tau 122-244, localized in nucleus. Furthermore, we used tubulin assembly assay to test if tau or its mutants can promote tubulin assembly in vitro. Results showed that only Tau WT can promote tubulin assembly in vitro but not Tau-N or Tau-C. Although Tau-N or Tau-C can bind to tubulin in vivo and in vitro, these mutants did not remain the ability to promote tubulin assembly that suggested both functional domains, N-terminus and C-terminus of Tau, are necessary and essential for the biological function of Tau. On the other hand, we used of phosphorylation assay and site directed mutagenesis to demonstrate that T231 of Tau is one of important phosphorylation sites of cdc2 and GSK3£]. Finally, we used tubulin assembly assay to show that phosphorylated Tau by GSK3£] can negatively regulate the ability of Tau to promote tubulin assembly that indicated that the phosphorylation at T231 may play a role in regulating Tau.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2008. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2007.

Currently a grate emphasis is being put on accurate and early diagnosis of Alzheimer's disease (AD), which is important for the introduction of treatments that could postpone the onset of the disease. Antibodies against tau protein appear to be suitable biomarkers for early diagnosis of AD. Therefore, this work deals firstly with preparation of human recombinant tau protein in bacteria and its subsequent use in determining levels of antibodies in blood serum of patients with AD and in normal older persons. A preparation of the tau protein in sufficient purity was achieved for the antibodies measurment by ELISA method and results were statistically analyzed using nonparametric methods. Results were compared with data from Mgr. Jany Švarcové obtained by measuring antibodies in serum of patients with AD and normal elderly using an commercial bovine tau protein. According to the analysis there are differences between the data obtained from human and the bovine tau protein. It was proven that patients with AN have lower levels of antibodies against tau protein than healthy seniors. Recombinant human tau protein was also used to immunize rabbits. The ELISA method confirmed the creation of antibodies against human tau protein in rabbits.

Le vieillissement de la population est à l’origine de l’augmentation du nombre de personnes souffrant de démences, dont la plus fréquente est la maladie d’Alzheimer (MA). La MA est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par une atteinte progressive des fonctions cognitives, en premier lieu les fonctions mnésiques. Son diagnostic formel repose sur l’examen post-mortem du cerveau des patients. Il est basé sur la présence conjointe de deux lésions caractéristiques: des dépôts extracellulaires majoritairement composés de peptide amyloïde fibrillaire, résultat d’un clivage anormal du précurseur transmembranaire APP, et d’une dégénérescence neurofibrillaire ou pathologie tau, caractérisée par l’accumulation intra-neuronale de protéines tau hyper- et anormalement phosphorylées. Parallèlement à ces deux lésions se développe une réponse neuro-inflammatoire, notamment caractérisée par une augmentation du nombre et de l’activité des cellules microgliales et astrocytaires. Bien que les relations entre la pathologie amyloïde et la mise en place des processus neuro-inflammatoires aient fait l’objet d’intenses investigations, peu d’études se sont intéressés aux liens réciproques existants entre ces processus et la pathologie tau. A travers l’utilisation d’un modèle murin transgénique mimant le versant tau de la MA, la lignée THY-Tau22, un des objectifs de ma thèse a consisté à caractériser les différents aspects de leur réponse neuro-inflammatoire. Ces souris développent une pathologie tau hippocampique progressive associée à des altérations mnésiques. Les études transcriptomiques, biochimiques et histologiques réalisées ont mis en évidence une augmentation progressive de l’expression hippocampique de marqueurs de l’immunité innée mais également adaptative chez les souris THY-Tau22. Nous observons particulièrement l’établissement progressif de réactions microgliales et astrocytaires, une augmentation des niveaux de différentes chimiokines (CCL3, CCL4 et CCL5) conjointement à une infiltration parenchymateuse de lymphocytes T, en l’absence d’altération majeure de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Ces résultats mettent en exergue une corrélation entre le développement de troubles mnésiques et de la pathologie Tau hippocampique d’une part, et la présence d’une réponse neuro-inflammatoire d’autre part. La MA est une maladie multifactorielle dont la survenue est modulée par différents facteurs génétiques et environnementaux. Parmi les facteurs environnementaux mis en évidence par les études épidémiologiques, la consommation de caféine réduit notablement le risque de développer la MA. La caféine est une substance psychoactive dont les effets sont essentiellement médiés par le blocage des récepteurs adénosinergiques A1 et A2A, ces derniers étant particulièrement décrits pour moduler les processus neuroinflammatoires. Le rôle de ces récepteurs étant mal connus dans le contexte de la MA, et inconnu concernant ses relations à la pathologie Tau, la seconde partie de ma thèse a consisté à évaluer les effets de la caféine mais également d’un blocage spécifique des récepteurs A2A, par des approches génétiques et pharmacologiques, vis-à-vis des altérations comportementales, de la pathologie tau et de la réponse neuro-inflammatoire dans le modèle THY-Tau22. Les résultats obtenus démontrent que la caféine et le blocage spécifique des récepteurs A2A exercent des effets bénéfiques dans ce modèle de Tauopathie, avec une prévention des altérations mnésiques, une réduction de l’hyperphosphorylation de Tau et des effets anti-inflammatoires. Ces modifications sont associées à des effets bénéfiques en terme neurochimique et synaptique. L’ensemble de ces résultats démontrent pour la première fois un effet bénéfique de la caféine et du blocage des récepteurs A2A dans un modèle murin de tauopathie et suggèrent qu’un ciblage thérapeutique de ces récepteurs puisse être d’intérêt dans la MA. / Population ageing is a major risk factor for dementia, the most prevalent being Alzheimer disease (AD). AD is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive cognitive decline, notably impacting memory functions. Its formal diagnosis is based on the post-mortem examination of AD patients’ brains and defined by the combination of two lesions: extracellular deposition of fibrillar amyloid peptide, resulting from the abnormal cleavage of transmembrane APP precursor, and neurofibrillary tangles, characterized by intraneuronal accumulation of hyper- and abnormal phosphorylated tau protein (Tau pathology). Besides these two lesions hallmarks, neuro-inflammatory processes, mainly defined by an increase of the number and the activity of microglial and astroglial cells, are considered as a third pathological component. Although the relationships between amyloid pathology and neuro-inflammatory processes had been the subject of intense investigations, few studies has been achieved with regards to tau pathology. As a first aim of this work, neuro-inflammatory processes associated with Tau pathology has been evaluated using a transgenic mouse model mimicking AD-like Tau pathology, THY-Tau22 strain.. These mice overexpress a mutated human tau protein under the control of a neuronal promoter and progressively hippocampal tau pathology associated to memory decline. Transcriptomic, biochemical and histological evaluations revealed a progressive increase several markers of both innate and adaptive immunity in the hippocampus of THY-Tau22 transgenic mice. We notably observed a progressive rise of microglial and astrogliale reactions, the overproduction of many chemokines (CCL3, CCL4, CCL5) in association with a parenchymatous infiltration of T cells, without major disruption of blood brain barrier (BBB). These results highlight a correlation between the establishments of memory alterations and hippocampal tau pathology on the one hand, and the occurrence of a neuro-inflammatory response on the other hand. AD is a multifactorial disorder whose occurrence depends on different genetic and environmental factors. Among the latter, epidemiological studies have shown that caffeine consumption significantly reduces the risk to develop AD. Caffeine is a psychoactive drug, whose effects are mainly ascribed to the blockade of A1 and A2A adenosinergic receptors, the latter beeing known to modulate neuro-inflammatory processes. The role of A2A receptors in AD is far from understood, and relationship with tau pathology currently unknown. The second part of my PhD aimed at evaluating effects of caffeine but also of a specific A2AR blockade, using genetic and pharmacological means, towards behavioural alterations, tau pathology and neuro-inflammatory processes in THY-Tau22 model. Results obtained demonstrate that caffeine and specific A2AR blockade lead to beneficial effects towards memory dysfunction, tau hyperphosphorylation and hippocampal neuro-inflammation. These improvements are associated with beneficial neurochemical and electrophysiological changes. Theses results demonstrate for the first time a beneficial effect of caffeine and A2A receptor blockade in a mouse model of tauopathy and support that therapeutic targeting of A2A receptors could be of interest in AD.

Small-angle X-ray scattering (SAXS) is a universal low-resolution method to study proteins in solution and to analyze structural changes in response to variations of conditions (pH, temperature, ionic strength etc). SAXS is hardly limited by the particle size, being applicable to the smallest proteins and to huge macromolecular machines like ribosomes and viruses. SAXS experiments are usually fast and require a moderate amount of purified material. Traditionally, SAXS is employed to study the size and shape of globular proteins, but recent developments have made it possible to quantitatively characterize the structure and structural transitions of metastable systems, e.g. partially or completely unfolded proteins. In the absence of complementary information, low-resolution macromolecular shapes can be reconstructed ab initio and overall characteristics of the systems can be extracted. If a high or low-resolution structure or a predicted model is available, it can be validated against the experimental SAXS data. If the measured sample is polydisperse, the oligomeric state and/or oligomeric composition in solution can be determined. One of the most important approaches for macromolecular complexes is a combined ab initio/rigid body modeling, when the structures (either complete or partial) of individual subunits are available and SAXS data is employed to build the entire complex. Moreover, this method can be effectively combined with information from other structural, computational and biochemical methods. All the above approaches are covered in a comprehensive program suite ATSAS for SAXS data analysis, which has been developed at the EMBL-Hamburg. In order to meet the growing demands of the structural biology community, methods for SAXS data analysis must be further developed. This thesis describes the development of two new modules, RANLOGS and EM2DAM, which became part of ATSAS suite. The former program can be employed for constructing libraries of linkers and loops de novo and became a part of a combined ab initio/rigid body modeling program CORAL. EM2DAM can be employed to convert electron microscopy maps to bead models, which can be used for modeling or structure validation. Moreover, the programs CRYSOL and CRYSON, for computing X-ray and neutron scattering patterns from atomic models, respectively, were refurbished to work faster and new options were added to them. Two programs, to be contributed to future releases of the ATSAS package, were also developed. The first program generates a large pool of possible models using rigid body modeling program SASREF, selects and refines models with lowest discrepancy to experimental SAXS data using a docking program HADDOCK. The second program refines binary protein-protein complexes using the SAXS data and the high-resolution models of unbound subunits. Some results and conclusions from this work are presented here. The developed approaches detailed in this thesis, together with existing ATSAS modules were additionally employed in a number of collaborative projects. New insights into the “structural memory” of natively unfolded tau protein were gained and supramodular structure of RhoA-specific guanidine nucleotide exchange factor was reconstructed. Moreover, high resolution structures of several hematopoietic cytokine-receptor complexes were validated and re-modeled using the SAXS data. Important information about the oligomeric state of yeast frataxin in solution was derived from the scattering patterns recorded under different conditions and its flexibility was quantitatively characterized using the Ensemble Optimization Method (EOM). / Röntgenkleinwinkelstreuung (small angle X-ray scattering, SAXS) ist eine fundamentale niedrigauflösende Methode zur Untersuchung von Proteinen in Lösung und Analyse von Strukturänderungen unter verschiedenen Bedingungen (pH, Temperatur, Ionenstärke, usw.). SAXS ist nicht durch die Teilchengröße begrenzt und die Anwendbarkeit reicht von kleinsten Proteinen bis hin zu großen makromolekularen Maschinen, wie Ribosomen und Viren. SAXS-Experimente sind normalerweise schnell durchzuführen und erfordern eine relativ geringe Menge gereinigten Materials. SAXS wird hauptsächlich eingesetzt, um Größe und Form der globulärer Proteine zu studieren. Die neuesten Entwicklungen ermöglichen jedoch auch die Untersuchung und quantitative Charakterisierung metastabiler Systeme, wie teilweise oder vollständig ungefaltete Proteine. Für die SAXS-Datenanalyse existiert das umfassende Programmpaket ATSAS, welches am EMBL-Hamburg entwickelt wurde. Es ermöglicht die de novo Modellierung der Proteinform mit niedriger Auflösung, wenn keine ergänzende Information über die dreidimensionale Struktur vorhanden ist. Des weiteren können diverse Gesamteigenschaften des untersuchten Systems berechnet werden. Wenn ein hoch oder niedrig aufgelöstes strukturell bestimmtes oder vorgesagtes Modell vorhanden ist, kann es gegen experimentellen SAXS Daten validiert werden. Wenn die Probe polydispers ist, kann der oligomere Zustand und/oder der oligomere Zusammensetzung in Lösung bestimmt werden. Einer der wichtigsten Ansätze für SAXS Untersuchungen an makromolekularen Komplexen ist die kombinierte ab initio/Starrkörper-Modellierung, wenn entweder komplette oder partielle Strukturen der einzelnen Untereinheiten zusammen mit SAXS Daten benutzt werden, um daraus den gesamten Komplex zu konstruieren. Außerdem kann diese Methode mit Informationen von anderen strukturellen, rechnerischen und biochemischen Methoden effektiv kombiniert werden. Um den Anwendungsbereich von SAXS in der Strukturbiologie zu erweitern, müssen Methoden für die SAXS-Datenanalyse weiter entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue Module, RANLOGS und EM2DAM, entwickelt und zur ATSAS Programmsuite hinzugefügt. Ersteres kann eingesetzt werden, um eine Bibliothek verknüpfender Polypeptidketten (linkers) und -schleifen (loops) de novo aufzubauen und ist bereits ein Teil des Programms CORAL zur kombinierten ab initio/Starrkörper-Modellierung. EM2DAM kann eingesetzt werden, um Elektronenmikroskopie-Dichtekarten in Kugelmodelle umzuwandeln, welche für die Modellierung oder Struktur-Validierung benutzt werden können. Außerdem wurden die Programme CRYSOL und CRYSON zur Berechnung von Röntgenstrahl- beziehungsweise Neutronenstreumuster aus Atommodellen erweitert, um die Berechnung zu beschleunigen und neue Optionen einzubauen. Zwei weitere Programme, die noch nicht Teil des ATSAS Pakets sind, wurden entwickelt. Das erste ist ein Programm, das mögliche Proteinmodelle von Komplexen unter Verwendung des SAXS Starrkörper-Modellierung-Programms SASREF erstellt. Dann werden Modelle zu experimentellen SAXS-Daten angepasst, ausgewählt und verfeinert unter Verwendung des Protein-Protein-Docking-Programms HADDOCK. Das zweite Programm verfeinert binäre Protein-Protein-Komplexe unter Verwendung von SAXS-Daten sowie hochaufgelöster Modelle der ungebundenen Untereinheiten. Im Folgenden werden die einige Ergebnisse dargestellt und diskutiert. Die entwickelten Methoden wurden zusammen mit den vorhandenen ATSAS-Modulen im Rahmen von Kollaborationsprojekte eingesetzt. So war es möglich, neue Einblicke in das „strukturelle Gedächtnis“ des natürlicherweise ungefalteten Protein tau zu bekommen und die supramodulare Struktur eines RhoA-spezifischen Guanidinnukleotid-Austauschfaktors zu rekonstruieren. Außerdem wurden hoch aufgelöste Strukturen einiger blutbildender Cytokin-Empfänger-Komplexe unter Verwendung von SAXS Daten validiert und verfeinert. Wichtige Informationen über den oligomeren Zustand von Hefe-Frataxin in Lösung wurden aus den unter verschiedenen experimentelle Bedingungen gemessenen Streumustern abgeleitet, und seine Flexibilität wurde quantitativ unter Verwendung der Ensemble-Optimierungs-Methode (EOM) ermittelt.

Optische Pinzetten stellen neuartige Werkzeuge in der Biophysik dar, die sich durch eine außerordentliche Präzision auszeichnen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden verfeinerte Bildanalysetechniken vorgestellt und neu entwickelt, die es erlauben, die Position eines Mikropartikels mit einer zeitlichen Auflösung von 0,017 s und einer Genauigkeit von ±2nm in lateraler und in axialer Richtung zu bestimmen. Dies ermöglicht eine Kraftauflösung von bis zu ±50 fN. Damit sind die Voraussetzungen für die Untersuchung von Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen auf der Ebene einzelner Bindungsereignisse gegeben. In der vorliegenden Arbeit werden die Wechselwirkungen zwischen den phosphorylierungsspezifischen Antikörpern HPT-101, HPT-104 und HPT-110 und Tau-Peptiden mit verschiedenen Phosphorylierungsmustern sowie zwischen DNA und den Proteinen TmHU und oPrPC untersucht. Die Wechselwirkungen zwischen Tau-Peptiden und Antikörpern werden jeweils anhand ihrer Bindungshäufigkeit sowie der Verteilung der Abrisskräfte charakterisiert. Mit einem aus der Literatur bekannten, theoretischen Modell werden folgende Bindungsparameter bestimmt: Lebenszeit der unbelasteten Bindung, charakteristische Länge und freie Aktivierungsenergie der Dissoziation. Im Einklang mit Ergebnissen einer immunochemischen Messung werden spezifische Wechselwirkungen zwischen HPT-101 und dem biphosphorylierten Tau-Peptid sowie zwischen HPT-104 bzw. HPT-110 und den Peptiden, die eine Phosphorylierung an Thr231 bzw. Ser235 enthalten, beobachtet. Zusätzlich ermöglicht die Einzelmolekülmethode auch eine detaillierte Charakterisierung der unspezifischen Wechselwirkungen mit den Tau-Peptiden, welche das jeweilige spezifisch erkannte Phosphorylierungsmuster nicht beinhalten. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss der Proteine TmHU und oPrPC auf einen einzelnen, mit konstanter Kraft gehaltenen DNA-Strang. Der zeitliche Verlauf der TmHU-induzierten Kondensationsreaktion wird bei Kräften zwischen 2 pN und 40 pN sowie in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration untersucht. Bei kleinen Kräften ist eine Verkürzung in zwei Phasen auf bis zu 30% der Konturlänge zu beobachten. Unter zusätzlicher Einbeziehung der Ergebnisse einer SMD-Simulation sowie einer rasterkraftmikroskopischen Untersuchung kann die erste Phase der Verkürzung einer primären Anbindung von TmHU zugeordnet werden. Die zweite Reaktionsphase entspricht hingegen vermutlich der Ausbildung einer Überstruktur. Die Wechselwirkung von oPrPC mit DNA wird zusätzlich mit einer kombinierten Anordnung aus Nanokapillare und optischer Pinzette untersucht. Dabei zeigt sich, dass ein Protein/DNA-Komplex ausgebildet wird, der eine negative Oberflächenladung aufweist und sich in seinem Volumen und seiner Ladung von reiner DNA unterscheidet. Allerdings hat oPrPC keinen Einfluss auf den Ende-zu-Ende-Abstand bzw. die Elastizität der DNA.

Das Tau-Protein ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein und kommt im zentralen Nervensystem (ZNS) und im peripheren Nervensystem (PNS) vor. Die Hyperphosphorylierung und Aggregation des Tau-Proteins ist eine der zentralen Pathologien bei der Entstehung der Alzheimerschen Erkrankung (AD). Die AD ist die häufigste Form der progressiven Demenz und eine der häufigsten neuro-degenerativen Erkrankungen. Gegenstand dieser Arbeit ist die Kartierung der nicht-neuronalen Gewebe, die Tau-Protein enthalten können. Mit diesem Ziel wurden in den unterschiedlichen Geweben mit den Methoden SandwichELISA, Immunhistochemie und RT-PCR auf die Tau-Menge quantifiziert, alternatives Spleißen untersucht und die Zelltyp-spezifische Expression detektier. So konnte eine Liste der Gewebe, die Tau-Protein enthalten erstellt werden. Eine immunhistochemische Markierung erfolgte jeweils in den drei Geweben mit dem höchsten Anteil an Tau-Protein. Hier ließ sich das Protein vorrangig in Nervenfasern darstellen. Durch RT-PCR wurde eine Isoformen-Analyse erstellt. Dabei wurde ein ähnliches Muster wie im ZNS festgestellt mit zusätzlicher Expression des „Big-Tau“ Exons 4a, sowie einer weiteren Spleiß-Isoform mit Inklusion des Exon 8, welches bisher nur im Rind und im Rhesus-Affen nachgewiesen war.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第19935号 / 工博第4218号 / 新制||工||1652(附属図書館) / 33021 / 京都大学大学院工学研究科マイクロエンジニアリング専攻 / (主査)教授 小寺 秀俊, 教授 中部 主敬, 准教授 横川 隆司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DGAM

微小管結合タンパク質の1つであるタウは、神経細胞の軸索に特異的に局在している。タウの軸索局在化分子機序を解明するために、外因性タウを神経細胞の発達初期に一時的に発現させ、軸索特異的に局在させる方法を構築した。この方法を用い、proline rich region 2 (PRR2)がタウの軸索局在化に重要であること、PRR2のリン酸化が軸索への移動に関与することを示唆した。またこの系の確立は局在や細胞内動態などの検討を行うことを可能にした。 / Microtubule-associated protein tau localizes specifically to neuronal axons. In order to elucidate the molecular mechanism of the axon localization of tau, we constructed an expression system for axon specific localization of exogenous tau in immature neurons in culture. Using this system, it suggested that the proline rich region 2 (PRR2) and phosphorylation of PRR2, which contains important phosphorylation sites, is critical for the localization. In the future, this experimental system will contribute greatly to the study of tau in normal and in the pathology of Alzheimer's disease. / 博士(理学) / Doctor of Philosophy in Science / 同志社大学 / Doshisha University

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