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S’ha realitzat l’estudi de l’efecte del processat de suc de raïm amb polsos elèctrics d’alta intensitat de camp (PEAIC) amb la intenció d’aconseguir la seva conservació. Els seus efectes s’han mesurat en diferents propietats característiques del suc de raïm com el contingut en sòlids solubles, pH, acidesa, conductivitat elèctrica, activitat microbiològica i enzimàtica, alguns compostos bioactius com el contingut en polifenols o vitamina C i capacitat antioxidant. Els valors obtinguts s’han comparat amb els obtinguts del tractament conservant de referència actual, el processat tèrmic. També s’ha determinat l’evolució de components específics durant el procés de vinificació des de l’obtenció del suc de raïm fins a l’envelliment del vi. L’estudi s’ha dut a terme en 4 fases en les que s’ha determinat que els PEAIC redueixen el contingut microbià del suc de raïm, tant l’inoculat com el natural, i l’activitat enzimàtica oxidativa. Així mateix, s’ha constatat que es possible optimitzar el procés tenint en compte les característiques de l’equipament i el medi. La comparació dels resultats de les variables estudiades amb aquesta tecnologia i amb tractament tèrmic a permès evidenciar que els efectes dels PEAIC són menys dràstics, fet que permet la seva utilització en l’elaboració de suc de raïm i vi sense que afecti negativament al procés o a l’envelliment del producte. La principal conclusió de l’estudi amb les dades obtingudes de tres varietats habitualment utilitzades a Catalunya és que el processat amb PEAIC és una eina de conservació del suc de raïm viable des del punt de vista tecnològic. L’adquisició de dades d’altres varietats i temporades fora de gran utilitat per ampliar aquesta conclusió. / Se ha realizado el estudio del efecto del procesado de zumo de uva con pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC) para su conservación. Los efectos se han medido en distintas propiedades características del zumo de uva como el grado brix, pH, acidez, conductividad eléctrica, actividad microbiológica y enzimática, algunos compuestos activos biológicamente como el contenido en polifenoles o vitamina C y la capacidad antioxidante. Los valores obtenidos se han comparado con los del tratamiento conservante de referencia, es decir, el tratamiento térmico. También se ha determinado la evolución de compuestos específicos durante el procesado desde el zumo de uva hasta el envejecimiento del vino. El estudio se ha realizado en 4 fases en las que se ha observado que los PEAIC reducen claramente la micro flora del zumo de uva, tanto la inoculada como la natural, así como la actividad enzimática oxidante. Se ha confirmado, además, que es posible optimizar esta reducción teniendo en cuenta las características del equipo de procesado y el medio. La comparación de resultados de las variables estudiadas tras el procesado PEAIC con el tratamiento térmico ha permitido constatar que los efectos de los PEAIC son menos drásticos lo que permitiría su uso como tratamiento en la elaboración del zumo y vino sin que afecte negativamente al proceso de vinificación o a su envejecimiento. La principal conclusión del estudio con los datos de tres variedades habitualmente utilizadas en Cataluña es que el procesado mediante PEAIC para la conservación de zumo de uva es técnicamente viable. La obtención de nuevos datos de otras variedades y distintas vendimias seria útil para poder generalizar esta conclusión. / The effect of pulsed electric fields as a preservation method on grape juice was studied. Its effects were measured on typical grape juice properties such as brix degrees, pH, acidity, electrical conductivity, microbial and enzymatic activities, and some bioactive compounds like vitamin C and polyphenol contents or antioxidant activity. The obtained values were compared with the current preservative reference technology, which is the heat processing. It was also analysed the effect of PEF on the evolution of specific compounds throughout the wine making process from juice to ageing. The study was carried out in 4 phases. It was observed a clear reduction of the microbial populations of both, inoculated and natural flora, as well as the oxidant enzymatic activities of grape juice. Besides, these effects were optimised taking into account the PEF processing device and the food product. The comparison of both treatments revealed that the PEF treatment yielded milder values of the variables than the thermal treatment. Therefore it could be used in juice and wine making without a negative impact on the quality of the product. The main conclusion inferred from the study is that on three commonly used Catalan varieties PEF processing is a feasible technology to preserve grape juice. New data coming from different varieties and years should broaden this conclusion.

L‟olivicultura de la comarca del Priorat es basa en la varietat „Arbequina‟ i està inclosa dins la DOP “Siurana” (Tarragona) on ocupa unes 2.900 ha que produeixen 4.700 t d‟olives i 900 t d‟oli, que ha de competir amb unes 100.000 t d‟oli d‟aquesta varietat produïdes a tot el mon, més de la meitat fora de Catalunya i amb tecnologies de producció modernes que permeten reduir costos i millorar la rendibilitat. Per aquest motiu els productors de la zona van fundar l‟Associació d‟Oleïcultors del Priorat (AOP) amb la finalitat de crear una estructura comercial que permetés accedir a mercats d‟alt preu, semblants als que utilitzen els vins de qualitat de la comarca. La AOP signà el 2002 un conveni amb l‟IRTA i el DAAM per a desenvolupar un programa científico-tècnic que permetés la caracterització i tipificació dels olis de la comarca, establint criteris objectius de selecció d‟aquells olis de qualitat superior i diferenciable de la resta d‟olis de „Arbequina‟ de Catalunya, per a facilitar la seva comercialització. Aquesta tesis doctoral inclou tots els aspectes científics sobre els que està fonamentada l‟aplicació comercial d‟aquest programa. Els objectius fixats són: (1) caracteritzar els olis produïts a la comarca, a nivell fisicoquímic i sensorial; (2) constatar si aquests olis són objectivament diferents dels d‟altres zones, produïts amb la mateixa varietat „Arbequina‟; (3) identificar en què consisteix la seva tipicitat, relacionant-la amb factors propis del clima i sòls de la comarca; i (4) caracteritzar l‟olivicultura i elaiotècnia de la comarca. Els treballs s‟han desenvolupat durant sis campanyes successives (2002-03 a 2008-09) i es basen en l‟anàlisi sistemàtica de pràcticament el 100% dels olis produïts a la comarca durant aquests anys (6.308.124 litres), la descripció de l‟olivicultura de la zona (mitjançant enquesta) i dels processos d‟extracció (descripció de les instal·lacions i anotació de les condicions de procés en campanya) i l‟estudi de la relació existent entre l‟oli i els factors de producció, edàfics i climàtics. Als olis s‟han analitzat les característiques sensorials, paràmetres fisicoquímics de qualitat, àcids grassos, esterols, polifenols totals, índex d‟amargor, estabilitat i, en alguns casos, ceres i compostos volàtils. La metodologia utilitzada és similar a la dels nombrosos treballs de tipificació i caracterització d‟olis d‟oliva verge, normalment associats a DOP espanyoles i d‟Itàlia, la qual fiabilitat està relacionada amb la representativitat de les mostres d‟oli analitzades i que apliquen tècniques estadístiques univariants i multivariants diverses. Els resultats demostren que fins un 54% dels olis de la zona Priorat, elaborats majoritàriament amb „Arbequina‟, es poden diferenciar objectivament dels d‟altres zones productores del mon que utilitzen la mateixa varietat, inclús de les veïnes Garrigues i Siurana-Camp. Aquestes diferències ho són tant a nivell sensorial (principalment els atributs picant, aromes secundàries, fruitat, astringència i dols), como a nivell d‟àcids grassos (principalment palmitoleic, oleic, palmític i esteàric). Existeix una variabilitat intrazonal (inferior al 20% en tots els paràmetres, excepte els esterols) que sembla aleatòria en el cas d‟atributs sensorials i, en el cas de la composició química, està relacionada amb factors geogràfics, de tècniques de cultiu i de clima de cada municipi. Les diferències respecte d‟altres zones veïnes on es cultiva la mateixa varietat estan relacionades amb l‟orografia i geologia particular de la comarca (més del 50% de plantacions estan a més de 400 m d‟altitud i sobre sòls del Paleozoic de baixa fertilitat i amb zones de transició cap a sòls sedimentaris del quaternari cap al Camp de Tarragona i del terciari cap a Les Garrigues) i amb el clima particular i bastant homogeni a tota la zona (règim termo-pluviomètric de tipus “mediterrani prelitoral sud”, amb transició cap a “mediterrani continental sec” a Les Garrigues i “mediterrani litoral sud” al Camp de Tarragona). S‟ha definit un model matemàtic per a predir si una partida d‟olives té possibilitats de produir olis de qualitat suficient per a la seva diferenciació, així com funcions discriminants de Fischer per a determinar si el perfil sensorial o la composició en àcids grassos d‟un oli són típics de la comarca del Priorat i, per tant, diferenciables de les zones veïnes. Actualment, els resultats d‟aquests treballs serveixen de base per a establir les estratègies comercials de venda dels olis del Priorat. Els moliners i envasadores trien aquells olis considerats com típics de la zona per a ser envasats (s‟ha passat del 20% al inici del programa fins al 65% actual), dedicant la resta de la producció a l‟autoconsum i al mercat a doll / El olivar de la comarca del Priorat se basa en el cultivo de la variedad „Arbequina‟ y está incluido en la DOP “Siurana” (Tarragona), ocupando unas 2.900 ha que producen 4.700 t de aceitunas y 900 t de aceite, que debe competir con unas 100.000 t de aceite de esta variedad producidas en todo el mundo, más de la mitad fuera de Cataluña y con tecnologías de producción modernas que permiten reducir los costes y mejorar la rentabilidad. Por este motivo, los productores de la zona fundaron la Asociación de Oleicultores del Priorat (AOP) con el fin de crear una estructura comercial que permitiera acceder a mercados de alto precio, parecidos a los que utilizan los vinos de calidad de la comarca. La AOP firmó, en 2002, un convenio con el IRTA y el DAAM para desarrollar un programa científico-técnico que permitiera la caracterización y tipificación de los aceites de la comarca, estableciendo criterios objetivos de selección de aquellos aceites de calidad superior y diferenciable del resto de aceites de „Arbequina‟ de Cataluña, para facilitar su comercialización. La presente tesis doctoral incluye todos los aspectos científicos sobre los que se fundamenta la aplicación comercial de este programa. Los objetivos que se plantean son: (1) caracterizar los aceites producidos en la comarca, a nivel físico-químico y sensorial; (2) constatar si estos aceites son objetivamente diferentes de los de otras zonas producidos con la misma variedad „Arbequina‟; (3) identificar en qué consiste su tipicidad, relacionándola con factores propios del clima y suelos de la comarca; y (4) caracterizar la olivicultura y elaiotecnia de la comarca. Los trabajos se han desarrollado durante seis campañas (2002-03 a 2008-09) y se basan en el análisis sistemático de prácticamente el 100% de los aceites producidos en la comarca durante esos años (6.308.124 litros), la descripción de la olivicultura de la zona (mediante encuesta) y de los procesos extractivos (descripción de las instalaciones y anotación de las condiciones de proceso en campaña) y el estudio de la relación existente entre el aceite y los factores tanto de producción como edáficos y climáticos. En los aceites se han analizado las características sensoriales, parámetros físico-químicos de calidad, ácidos grasos, esteroles, polifenoles totales, índice de amargor, estabilidad y, en algunos casos, ceras y compuestos volátiles. La metodología utilizada se basa en los numerosos trabajos de tipificación y caracterización de aceites de oliva virgen, normalmente asociados a DOP españolas e italianas, cuya fiabilidad está relacionada con la representatividad de las muestras de aceite analizadas y que aplican técnicas estadísticas univariantes y multivariantes diversas. Los resultados demuestran que hasta un 54% de los aceites de la zona Priorat, elaborados mayoritariamente con „Arbequina‟, pueden diferenciarse objetivamente de los de otras zonas productoras del mundo que utilizan la misma variedad, incluso de las vecinas Garrigues y Siurana-Camp. Dichas diferencias lo son tanto a nivel sensorial (principalmente los atributos picante, aromas secundarios, frutado, astringencia y dulzor), como a nivel de ácidos grasos (principalmente palmitoleico, oleico, palmítico y esteárico). Existe una variabilidad intrazonal (inferior al 20% en todos los parámetros, excepto los esteroles) que parece aleatoria en el caso de atributos sensoriales y que, en el caso de la composición química, está relacionada con factores geográficos, de técnicas de cultivo y de clima de cada municipio. Las diferencias respecto de otras zonas vecinas, donde se cultiva la misma variedad, están relacionadas con la orografía y geología particular de la comarca (más del 50% de plantaciones están a más de 400 m de altitud y sobre suelos del Paleozoico de baja fertilidad y con zonas de transición hacia suelos sedimentarios del cuaternario hacia el Camp de Tarragona y del terciario hacia Les Garrigues) y con el clima particular y bastante homogéneo en toda la zona (régimen termopluviométrico de tipo “mediterráneo prelitoral sur”, con transición hacia el “mediterráneo continental seco” de Les Garrigues y el “mediterráneo litoral sur” del Camp de Tarragona). Se ha definido un modelo matemático para predecir si una partida de aceitunas tiene posibilidades de producir aceites de calidad suficiente para su diferenciación, así como funciones discriminantes de Fischer para determinar si el perfil sensorial o la composición en ácidos grasos de un aceite son típicos de la comarca del Priorat y, por tanto, diferenciables de las zonas vecinas. Actualmente, estos resultados sirven de base para establecer las estrategias comerciales de venta de los aceites del Priorat. Los almazareros y envasadores escogen aquellos aceites considerados como típicos de la zona para su envasado (se ha pasado desde un 20% al inicio del programa hasta el 65% actual), dedicando el resto de la producción al autoconsumo y al mercado de graneles. / Olive production in the Priorat area raws on „Arbequina‟ cultivar and is included into PDO “Siurana” (Tarragona), with 2.900 ha and yielding 4.700 t fruits in average, equivalent to 900 t of virgin oil. This oil competes with 100.000 t of oil from the same cultivar produced worldwide (more than a half out of Catalonia and using new technologies to reduce costs and enhance profitability). This was the reason to promote the Priorat‟s Producer Association (PPA) in order to build a commercial structure to gain high value markets, similar to those used by high quality wines of this area. PPA proposed in 2002 an agreement with IRTA and the Agricultural Services from the Catalan Government with the aim to develop a scientific and technical program to characterize and differentiate virgin oils from Priorat and setting objective criteria to select high quality oils different from others „Arbequina‟. This ought to improve current commercialization. This thesis includes all scientific aspects supporting the commercial application of the program. Research goals were: (1) to characterize oils from Priorat using physic, chemical and sensorial parameters; (2) to assess if these oils can be differentiated from others produced with the same cultivar „Arbequina‟ in other regions; (3) to test their “typicality”, related to Priorats‟ climate and soil characteristics; and (4) to characterize olive production and mill technology in Priorat. The study was carried out during a six years period (2002-03 to 2008-09 harvests) with systematic analysis of almost 100% virgin oil produced in the area (6.308.124 liters). Olive crop production was studied using a questioner, while mill technology was assessed by registering processing conditions along harvest every year. The relationship between oil quality and climate, soils and cultural practices was studied. Chemical parameters analyzed were: sensory profile, physic and chemical quality parameters, fatty acids, sterols, total polyphenols, bitterness index, stability and, sometimes, waxes and volatiles. Methodology was similar to that applied in many scientific studies on virgin oil characterization in wide areas, usually linked to PDO in Spain and Italy. Results reliability depends on oil sampling representativeness. Both univariate and multivariate statistics were used. Results show that up to 54% of Priorat virgin oils made with „Arbequina‟ can be classified to be typical and different from other producing regions, even the neighboring areas of Garrigues and Siurana-Camp. Such differences are both sensorial (mainly pungency, secondary aromas, fruity, astringency and sweet) and chemical (fatty acids palmitoleic, oleic, pamitic, and stearic). Variability between Priorat areas, is lower than 20% (except for sterols) and seems to be random for sensory profile while is related to geography, cultural practices and climate, for chemical composition. Differences to other regions with the same cultivar are related to the Priorat‟s geography and geology (more than 50% orchards are placed higher than 400 m and over soils from Paleozoic with low fertility with transitions to quaternary sedimentary soils towards Camp of Tarragona and transitions to tertiary sedimentary soils towards Garrigues) and climate (Priorat‟s climate belongs to “south pre-littoral Mediterranean” with transitions to “dry continental Mediterranean” towards Garrigues and transitions to “south littoral Mediterranean” towards Camp of Tarragona). A mathematic model was fitted which makes possible to decide if an olive lot is able to produce virgin oil of enough quality to be classified as typical of Priorat. Fischers‟ discriminate functions were fitted that make possible to decide if a virgin oil sample has a fatty acid composition or a sensory profile characteristics from Priorat and different to other regions. Currently, these results are used to establish commercial strategies to sell Priorat virgin oils. The oil producers from this area select those more characteristics oils to be retailed (this increased from 20% at the beginning of the program to currently 65%) while the standard oils are used to self consumption or for bulk market.

La limitació en l’ús de fungicides per al control de malalties en postcollita de fruita és una problemàtica d’elevada magnitud en el sector fructícola actual. Degut a això l’ús d’estratègies alternatives com el control biològic microbià són fonamentals per a la producció de fruita de qualitat. Malgrat tot, el desenvolupament de programes de biocontrol eficaços requereix d’un coneixement profund de la capacitat de control i els mecanismes d’acció utilitzats per l’agent microbià que es pretén emprar, així com de la possibilitat per a què aquest pugui ésser produït i formulat a nivell comercial. En aquest context, la bactèria Bacillus subtilis soca CPA–8 aïllada de la superfície de nectarines al Laboratori de Patologia de Postcollita del Centre IRTA (Lleida) ha demostrat tenir una bona capacitat de biocontrol de malalties de postcollita de fruita de pinyol. El seu futur ús a nivell comercial depèn de l’estudi del seu potencial de biocontrol de malalties de postcollita de fruita; així com del desenvolupament de processos per a l’optimització de la producció i formulació. La present tesi tenia com a objectiu principal avaluar aspectes clau per al desenvolupament de B. subtilis CPA–8 com agent efectiu per al control biològic de malalties de postcollita de fruita. Per a complir amb aquest objectiu, en primer lloc, es va dur a terme una anàlisi detallada de les característiques biològiques de la soca CPA–8 com ara el seu creixement en medi de cultiu, producció d’endòspores i substàncies antifúngiques; així com el seu potencial per al control de malalties importants en postcollita de taronja, poma i fruita de pinyol (Capítol 1). Amb aquests resultats, el següent pas fou estudiar el mode d’acció utilitzat per B. subtilis CPA–8 per a la supressió de patògens de postcollita, concretament contra Monilinia spp. causant de la podridura marró en fruita de pinyol (Capítol 2). Mitjançant la combinació d’eines d‘anàlisi químic, moleculars i biològiques es van determinar els principals factors implicats en la capacitat antagònica de la soca CPA–8 contra Monilinia spp. El pas següent fou optimitzar la producció de B. subtilis CPA–8, en aquest sentit es va desenvolupar un medi de cultiu de baix cost que proporcionés un creixement alt i mantingués l’eficàcia de biocontrol (Capítol 3). Primer es van buscar fonts de nitrogen i de carboni econòmiques entre productes comercials i subproductes agroalimentaris. Posteriorment es va dur a terme l’escalat de la producció de la bactèria en un bioreactor de 5 L i es va comprovar l’efectivitat per al control de Monilinia spp. en préssecs. El pas final fou la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant l’assecat per atomització (Capítols 4 i 5). Aquest mètode fou seleccionat per dos motius, d’una banda perquè aquesta és una tècnica d’assecat viable per a formulació de bactèries a baix cost i per l’altra banda en base als resultats obtinguts en el capítol 1 sobre la capacitat de la bactèria per produir endòspores resistents al calor i efectives contra patògens de postcollita de fruita. Primer es va dur a terme un estudi comparatiu de l’efecte de l’atomització sobre la supervivència de B. subtilis CPA–8 i de l’agent de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítol 4). Posteriorment es va realitzar una avaluació de les substàncies protectores/material de suport més adequades per a l’atomització de la soca CPA–8, i amb els millors productes atomitzats es van avaluar diferents medis de rehidratació i l’activitat antifúngica; així com la vida útil y l’efectivitat durant l’emmagatzemament (Capítol 5) Els resultats obtinguts en el capítol 1 demostraren que B. subtilis CPA–8 produeix cèl lules, endòspores resistents al calor i compostos que tenen una alta activitat antagònica in vitro contra els principals patògens de postcollita de fruita Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum i Penicillium expansum. Els tractaments de cèl lules, endòspores y sobrenedants lliures de cèl lules de la soca CPA–8 mostraren diferents nivells d’efectivitat per al control de podridures en taronja, poma i fruita de pinyol, presentant els millors resultats contra Monilinia spp. en préssecs i nectarines amb reduccions de la incidència de la malaltia fins al 100 %. L’assaig de dosis de diferents tractaments de la soca CPA–8 a 108, 107 i 106 UFC mL–1 foren efectius contra Monilinia spp. de forma semblant o millor al Serenade Max®. L’estudi del mode d’acció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 2) va demostrar que els sobrenedants lliures de cèl lules provinents de cultius líquids tenen una alta activitat antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a l’observada amb suspensions cel lulars. Les anàlisis mitjançant PCR i bioautografia en TLC d’extractes butanòlics d’aquests sobrenedants en comparació amb els de les soques de referència de B. subtilis UMAF6614 i UMAF6639, van revelar la producció de les principals famílies de lipopèptids antifúngics coneguts en Bacillus (fengicines, iturines i surfactines), fet que apuntava l’antibiosi com a principal mecanisme d’acció implicat en la capacitat de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Les fraccions corresponents a les fengicines foren les responsables de l’activitat inhibitòria de la soca CPA–8 enfront de Monilinia spp. Aquests resultats van ser corroborats definitivament mitjançant la construcció de mutants de B. subtilis CPA–8 defectius per a la producció de fengicina interrompent l’expressió del gen fenB. Les anàlisis per PCR i bioautografia en TLC revelaren que els mutants defectius de la soca CPA–8 perdien la capacitat d’inhibir a Monilinia spp. per la seva incapacitat per a produir fengicines. Els assaigs d’efectivitat en fruita utilitzant tractaments provinents dels mutants de la soca CPA–8 van demostrar que aquests havien perdut la capacitat de controlar la podridura causada per Monilinia spp. amb percentatges d’incidència similars als observats en el control sense tractar, mentre que els tractaments amb la soca parental o Serenade Max® presentaven reduccions de la malaltia de fins el 100 %. Tots aquests resultats demostraren que la producció de fengicines juga un paper molt important en l’efectivitat de B. subtilis CPA–8 per a controlar la podridura marró del préssec; i que aquest resulta ser el principal mode d’acció implicat en la seva capacitat de biocontrol. En l’optimització de la producció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 3) els resultats obtinguts van demostrar que és possible aconseguir alts nivells de biomassa (superiors a 3×109 UFC mL–1) emprant dos medis de baix cost composats per farina de soja desengreixada 44 % a 40 g L–1 com a font de nitrogen en combinació amb sacarosa a 20 g L–1 o melassa a 5 g L–1 com a fonts de carboni. A més a més, la producció de la soca CPA–8 en aquest medi de baix cost va poder ser escalada a nivell de laboratori en un bioreactor de 5 L de capacitat a 30 °C, amb agitació de 200 rpm i flux d’aire de 100 L h–1, mantenint les concentracions de la bactèria a 3×109 UFC mL–1. Els assaigs en fruita amb tractaments de la soca CPA–8 crescuda en el medi optimitzat de baix cost van demostrar que aquesta mantenia la seva eficàcia de biocontrol contra M. fructicola en préssecs amb reduccions de la malaltia de fins al 95 %, similar als tractaments de la bactèria crescuts en medis de laboratori. Les poblacions de CPA–8 van sobreviure en ferides de préssecs inoculats, independentment dels medis de cultiu utilitzats. Aquests resultats proporcionen una base fiable per a la producció de la soca CPA–8 a nivell industrial. En la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant assecat per atomització (Capítols 4 i 5) els resultats demostraren que aquesta bactèria és capaç de sobreviure a les altes temperatures del procés (32.3 % de viabilitat i 3.3×109 UFC g–1 de concentració final de producte), comparada amb P. agglomerans CPA–2 utilitzada com a model de bactèria sensible a la calor i no formadora d’endòspores que no fou resistent (menys del 2 % de viabilitat). La supervivència de la soca CPA–8 a l’atomització va estar directament relacionada amb la seva capacitat per a produir endòspores resistents a les altes temperatures. La resistència a la calor de la soca CPA–8 a més a més va dependre de la fase de creixement, essent el cultiu de 72 h, més resistent que el de 24 h, probablement pel seu major contingut d’endòspores. Els resultats obtinguts en l’estudi de la substància protectora/material de suport més adequada per a l’atomització de B. subtilis CPA–8 van demostrar que quatre diferents combinacions de llet desnatada en pols i MgSO4 proveïen una bona recuperació de pols (28–38 %) i continguts d’humitat del 7–13 %. La supervivència de la soca CPA–8 fou diferent en els atomitzats dels cultius de 24 i 72 h. Les formulacions de 72 h mostraven una major supervivència (28–32 %) y amb concentracions finals al voltant d’1.6–3.3×109 UFC g–1, mentre que la viabilitat dels atomitzats de 24 h fou inferior a l’1 %, fet pel qual les primeres van seleccionar–se per a la seva posterior avaluació. Diferents rehidratants como l’aigua o el tampó fosfat van proporcionar una bona recuperació de cèl lules viables en les formulacions de CPA–8 similars a les obtingudes amb llet desnatada en pols o sacarosa al 10 % amb el que es dedueix que l’aigua pot utilizar–se com a rehidratant amb l’avantatge a nivell pràctic que això suposa. L’estudi de la vida útil de les formulacions de la soca CPA–8 emmagatzemades a 4 °C (fred) i a 20 °C (temperatura ambient) va demostrar que la viabilitat es mantenia o disminuïa lleugerament (0.2–0.3 log) durant 6 mesos d’emmagatzematge. A més a més, després de 4 i 6 mesos de conservació aquestes formulacions controlaven la podridura marró causada per Monilinia spp. en nectarines i préssecs mostrant reduccions de la incidència de la malaltia entre el 90 i 100 %. Els resultats obtinguts van demostrar que l’atomització podria ser un mètode d’assecat adequat per a obtenir formulacions estables i efectives de B. subtilis CPA–8.En conclusió els estudis realitzats en aquesta tesi demostren el potencial de l’antagonista B. subtilis CPA–8 per al control de malalties de postcollita de fruita i estableixen les bases per a la seva posterior implementació de la producció i formulació a nivell comercial. / La limitación en el uso de fungicidas para el control de enfermedades en postcosecha de fruta es un grave problema en el sector frutícola actual. Debido a esto, el uso de estrategias alternativas como el control biológico microbiano son fundamentales para la producción de fruta de calidad. Sin embargo, el desarrollo de programas de biocontrol eficaces requiere de un fuerte conocimiento de la capacidad de control y los mecanismos de acción usados por el agente microbiano que se pretende emplear, así como de la posibilidad para que éste pueda ser producido y formulado a nivel comercial. En este contexto, la bacteria Bacillus subtilis cepa CPA–8 aislada de la superficie de nectarinas en el Laboratorio de Patología de Postcosecha del Centro IRTA (Lleida) ha demostrado tener una importante capacidad de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta de hueso. Su futuro uso a nivel comercial depende del estudio de su potencial de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta; así como del desarrollo de procesos para su óptima producción y formulación. La presente tesis tiene como objetivo fundamental evaluar aspectos clave para el desarrollo de B. subtilis CPA–8 como agente eficaz de control biológico de enfermedades de postcosecha de fruta. Para cumplir con este objetivo, en primer lugar, se realizó un análisis detallado de las características biológicas de la cepa CPA–8 como su crecimiento en medio de cultivo, producción de endosporas y sustancias antifúngicas; así como su potencial para el control de importantes podredumbres de postcosecha de naranja, manzana y fruta de hueso (Capítulo 1). Con estos resultados el siguiente paso fue estudiar el modo de acción usado por B. subtilis CPA–8 para la supresión de patógenos de postcosecha, concretamente contra Monilinia spp. causante de la podredumbre marrón en fruta de hueso (Capítulo 2). Mediante la combinación de herramientas de análisis químico, molecular y biológico se determinaron los principales factores implicados en la capacidad antagónica de la cepa CPA–8 contra Monilinia spp. El siguiente paso fue optimizar la producción de B. subtilis CPA–8, para lo cual se desarrolló un medio de cultivo de bajo coste que proporcionase un crecimiento alto y mantuviese la eficacia de biocontrol (Capítulo 3). Primero se buscaron fuentes de nitrógeno y carbono económicas entre productos comerciales y subproductos agroalimentarios. Posteriormente se realizó el escalado de producción de la bacteria en un bioreactor de 5 L y se comprobó la efectividad para el control de Monilinia spp. en melocotones. El paso final fue la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5). Este método fue seleccionado por dos motivos, por un lado porque ésta es una técnica de secado viable para formulación de bacterias a bajo coste y en base a los resultados obtenidos en el capítulo 1 sobre la capacidad de la bacteria para producir endosporas resistentes al calor y eficaces contra patógenos de postcosecha de fruta. Primero se realizó un estudio comparativo del efecto de la atomización sobre la supervivencia de B. subtilis CPA–8 y del agente de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítulo 4). Posteriormente se realizó una evaluación de las sustancias protectoras/material de soporte más adecuadas para la atomización de la cepa CPA–8, y de los mejores productos atomizados se evaluaron los distintos medios de rehidratación y la actividad antifúngica; así como su vida útil y efectividad durante conservación (Capítulo 5).Los resultados obtenidos en el capítulo 1 indicaron que B. subtilis CPA–8 produce células, endosporas resistentes al calor y compuestos que tienen una alta actividad antagónica in vitro contra los principales patógenos de postcosecha de fruta Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum y Penicillium expansum. Los tratamientos de células, endosporas y sobrenadantes libres de células de la cepa CPA–8 mostraron diferentes niveles de efectividad para el control de podredumbres en naranja, manzana y fruta de hueso, presentando los mejores resultados contra Monilinia spp. en fruta de hueso con reducciones de la incidencia de la enfermedad hasta del 100 %. El ensayo de dosis de diferentes tratamientos de la cepa CPA–8 a 108, 107 y 106 UFC mL–1 fueron efectivos contra Monilinia spp., de forma similar o mejor que Serenade Max®. El estudio del modo de acción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 2) demostró que los sobrenadantes libres de células provenientes de cultivos líquidos tenían una alta actividad antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a la observada con suspensiones celulares. Los análisis mediante PCR y bioautografía en TLC de extractos butanólicos de estos sobrenadantes en comparación con los de las cepas de referencia de B. subtilis UMAF6614 y UMAF6639, revelaron la producción de las principales familias de lipopéptidos antifúngicos conocidos en Bacillus (fengicinas, iturinas y surfactinas), lo que apuntó a la antibiosis como el principal mecanismo de acción implicado en la capacidad de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Las fracciones correspondientes a las fengicinas fueron las responsables de la actividad inhibitoria de la cepa CPA–8 frente a Monilinia spp. Estos resultados fueron definitivamente corroborados mediante la construcción de mutantes de B. subtilis CPA–8 defectivos para la producción de fengicina interrumpiendo la expresión del gen fenB. Los análisis por PCR y bioautografía en TLC revelaron que los mutantes defectivos de la cepa CPA–8 perdieron la capacidad de inhibir a Monilinia spp. por su incapacidad para producir fengicinas. Los ensayos de efectividad en fruta utilizando tratamientos provenientes de los mutantes de la cepa CPA–8 demostraron que éstos habían perdido su capacidad para controlar la podredumbre causada por Monilinia spp. con porcentajes de incidencia similares a los observados en el control sin tratar, mientras que los tratamientos con la cepa parental o Serenade Max® presentaron reducciones de enfermedad de hasta el 100 %. Todos estos resultados demostraron que la producción de fengicinas juega un papel muy importante en la efectividad de B. subtilis CPA–8 para controlar la podredumbre marrón del melocotón; y que éste resulta ser el principal mecanismo de acción implicado en su capacidad de biocontrol. En la optimización de la producción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 3) los resultados obtenidos demostraron que se pueden conseguir altos niveles de biomasa (superiores a 3×109 UFC mL–1) usando dos medios de bajo coste compuestos por harina de soja desengrasada 44 % a 40 g L–1 como fuente de nitrógeno en combinación con sacarosa a 20 g L–1 o melaza a 5 g L–1 como fuentes de carbono. Además la producción de la cepa CPA–8 en este medio de bajo coste pudo ser escalada a nivel de laboratorio en un bioreactor de 5 L de capacidad a 30 °C, con agitación de 200 rpm y flujo de aire de 100 L h–1, manteniendo las concentraciones de la bacteria a 3×109 UFC mL–1. Los ensayos en fruta con tratamientos de la cepa CPA–8 crecida en el medio optimizado de bajo coste demostraron que ésta mantenía su eficacia de biocontrol contra M. fructicola en melocotones con reducciones de enfermedad de hasta el 95 %, similar a los tratamientos de la bacteria crecidos en medios de laboratorio. Las poblaciones de CPA–8 sobrevivieron en heridas de melocotones inoculados, independientemente de los medios de cultivo utilizados. Estos resultados proporcionan una base fiable para la producción de la cepa CPA–8 a nivel industrial. En la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5) los resultados demostraron que esta bacteria es capaz de sobrevivir a las altas temperaturas del proceso (32.3 % de viabilidad y 3.3×109 UFC g–1 de concentración final de producto), comparado con P. agglomerans CPA–2 utilizada como modelo de bacteria sensible al calor y no formadora de endosporas que no fue resistente (menos del 2 % de viabilidad). La supervivencia de la cepa CPA–8 a la atomización estuvo directamente relacionada con su capacidad para producir endosporas resistentes a las altas temperaturas. La resistencia al calor de la cepa CPA–8 además dependió de la fase de crecimiento, siendo el cultivo de 72 h, más resistente que el de 24 h, probablemente por su mayor contenido de endosporas. Los resultados obtenidos en el estudio de la sustancia protectora/material de soporte más adecuada para la atomización de B. subtilis CPA–8 demostraron que cuatro diferentes combinaciones de leche desnatada en polvo y MgSO4 proveían una buena recuperación de polvo (28–38 %) y contenidos de humedad del 7–13 %. La supervivencia de la cepa CPA–8 varió considerablemente en los atomizados con los cultivos de 24 h y los de 72 h. Las formulaciones de 72 h mostraron una mayor supervivencia (28–32 %) y con concentraciones finales entorno a 1.6–3.3×109 UFC g–1, mientras que la viabilidad de los atomizados de 24 h fue inferior al 1 %, por lo cual se seleccionaron para su posterior evaluación. Diferentes rehidratantes como el agua o tampón fosfato proporcionaron una buena recuperación de células viables en las formulaciones de CPA–8 similares a las obtenidas en leche desnatada en polvo o sacarosa al 10 % por lo que el agua puede utilizarse como rehidratante con la ventaja a nivel práctico que supone. El estudio de la vida útil de las formulaciones de la cepa CPA–8 almacenadas a 4 °C (frío) y a 20 °C (temperatura ambiente) demostró que la viabilidad se mantuvo o disminuyó ligeramente entorno a 0.2–0.3 log durante 6 meses de almacenamiento. Además después de 4 y 6 meses de almacenamiento estas formulaciones controlaron la podredumbre marrón causada por Monilinia spp. en nectarinas y melocotones mostrando reducciones de la incidencia de la enfermedad entre el 90 y 100 %. Los resultados obtenidos demostraron que la atomización podría ser un método de secado adecuado para obtener formulaciones estables y eficaces de B. subtilis CPA–8. En conclusión los estudios realizados en esta tesis demuestran el potencial del agente de biocontrol B. subtilis CPA–8 para el control de enfermedades de postcosecha de fruta y sientan las bases para su posterior implementación de la producción y formulación a nivel comercial / Synthetic fungicides are the primary means to reduce losses caused by postharvest diseases. However, public concern for their negative impact on human health and environment associated with undesirable chemical residues on fruit and proliferation of fungicide–resistant isolates have impelled the search for alternative methods. Biological control using microorganisms has emerged as an effective alternative to control postharvest diseases and to produce quality fruit free of fungicide residues. However, the development of a successful biocontrol product requires a strong knowledge about the antagonistic ability and mechanisms of action used by the microbial agent to disease suppression and the possibility for its production and formulation to commercial application. In this context, Bacillus subtilis strain CPA–8 isolated from nectarines surface in the Postharvest Pathology Laboratory from IRTA centre (Lleida) has shown a significant capacity for biocontrol of postharvest diseases of stone fruit. Its future use on a commercial level depends on its antagonistic potential to control fruit postharvest diseases as well as an optimum production and formulation systems. This thesis has the main objective to evaluate key aspects involved in development of B. subtilis CPA–8 as an effective biocontrol agent of postharvest diseases on fruit. To achieve this objective, first, the CPA–8 growth and production of endospores and antifungal substances were characterized. Then, biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 was tested against the main postharvest decay on oranges, apples and stone fruit (Chapter 1). Based on these results, the mechanism of action used by CPA–8 to suppress postharvest pathogens, particularly against Monilinia spp. causing brown rot in stone fruit was studied (Chapter 2). Based on chemical, molecular and biological analysis the key factors involved in the biocontrol activity of CPA–8 against Monilinia spp. were identified. Next step was optimizing B. subtilis CPA–8 production by developing a low cost medium that provide maximum bacterium growth and maintain its biocontrol efficacy (Chapter 3). First, different media combining economical nitrogen and carbon sources from commercial products and by–products were evaluated. Second, CPA–8 production was scaled up in a 5–liter bioreactor and the efficacy to control of Monilinia spp. in peaches was evaluated. The final step was B. subtilis CPA–8 formulation by spray drying (Chapters 4 and 5). This method was selected because it is a cost effective technique for bacteria preservation and results of Chapter 1 indicated that CPA–8 was heat resistant by endospores production capacity. These endospores had also demonstrated good antifungal activity against fruit postharvest pathogens. First, the role of endospore production by B. subtilis CPA–8 on its survival to spray–drying process was investigated by comparing CPA–8 with the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA–2 as model of heat–sensitive and non–spore forming bacterium (Chapter 4). Finally, carriers/protectants were evaluated to prepare CPA–8 formulations by spray drying; and with the best CPA–8 formulations rehydration media, shelf life stability and biocontrol efficacy during storage were evaluated (Chapter 5). The results obtained in Chapter 1 indicated that CPA–8 produces cells, heat–resistant endospores and compounds with high antifungal activity in vitro against the major fruit postharvest pathogens Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum and Penicillium expansum. Treatment of cells, endospores and cell–free supernatants of CPA–8 showed different efficacy levels to control fugal decay on oranges, apples and stone fruit, obtaining the best results against Monilinia spp. on stone fruit with disease reductions up to 100%. Dose tests demonstrated that different CPA–8 treatments at 108, 107 and 106 CFU mL–1 were effective against Monilinia spp., similar or better than Serenade Max®, a commercial biocontrol product based in a B. subtilis strain. Experimental evidence suggested that B. subtilis CPA–8 has biocontrol potential to control postharvest diseases on several fruit types, particularly against peach brown rot. The mode of action study (Chapter 2) showed that cell free supernatants and butanolic extracts from liquid cultures of B. subtilis CPA–8 had a strong antifungal activity in vitro against Monilinia spp. similar to that observed with cell suspensions. Fengycin, iturin and surfactin lipopeptides were identified by TLC in butanolic extracts from cell free supernatants of CPA–a by comparison with the B. subtilis reference strains UMAF6614 and UMAF6639, indicating that antibiosis could be the major factor involved in the CPA–8 biological control ability. TLC–bioautography analysis showed that CPA–8 antifungal activity was associated only with fengycin lipopeptide. These results were definitively supported by mutagenesis analysis targeted to suppress fengycin biosynthesis by disruption of the fenB gene. PCR and TLC–bioautography analysis allowed to identify CPA–8 transformants with reduced or suppressed antifungal activity and to select the defective phenotype associated with the lack of fengycin bands. Fruit trials confirmed that fengycin–defective mutants lost their ability to control peach brown rot disease in comparison with CPA–8 wild type strain or Serenade Max®. Taken together our data indicate that fengycin–like lipopeptides play a major role in the biological control potential of B. subtilis CPA–8 against peach brown rot. The results obtained in Chapter 3 indicate that high production levels of B. subtilis CPA–8 (>3×109 CFU mL–1) could be achieved in a low cost medium based on defatted soy flour 44 % (40 g L–1) with sucrose (20 g L–1) or molasses (5 g L–1). CPA–8 production in the optimized low cost medium was scaled–up in a 5–L bioreactor at 30 °C under shaking at 200 rpm and with air flow of 100 L h–1 and production was maintained around 3×109 CFU mL–1. Fruit trials with cells and cell free supernatants obtained from CPA–8 grown in optimized medium maintained biocontrol efficacy against M. fructicola in peaches showing disease reduction up to 95 %, similar to the treatment from bacterium grown in expensive laboratory media. CPA–8 populations survived in wounds on inoculated peaches, regardless of the culture media used. The results could be used to provide a reliable basis for the fermentation scaling–up process to an industrial level. The results obtained in Chapters 4 and 5 indicate that B. subtilis CPA–8 is heat resistant to high temperatures involved in spray–drying process by endospore production comparing with the heat sensitive and non–spore forming P. agglomerans CPA–2. The 72–h–old CPA–8 cultures spray–dried showed the best survival with 32.3 % viable cells recovery and a final concentration product of 3.3×109 CFU g–1, while CPA–2 viability was lower than 2 %. Heat resistance of CPA–8 was also depending on growth time, being 72–h–old culture more resistant than 24–h–old culture, probably due to the higher content of endospores. These results suggest that endospore production improves CPA–8 resistance to spray–drying formulation system. The study of carriers/protectants addition in spray–drying CPA–8 formulations showed that four different combinations of skim milk and MgSO4 provided reasonable recovery powder (28–38 %) and moisture content (7–13 %). CPA–8 survival varied considerably among spray–dried 24– and 72–h–old formulations. The 72 h–old CPA–8 culture spray dried showed the highest survival (28–32 %) and a final concentration product of 1.6–3.3×109 CFU g–1, while viability of 24 h–old culture formulations were lower than 1 %. Rehydration media as water or phosphate buffer provided good recovery of dried cells from CPA–8 formulations as well as skim milk or sucrose both at 10%. This result is a practical advantage. CPA–8 formulations after 4 and 6 month of storage at 4 ºC (cold) or at 20 ºC (room temperature) maintained survival and efficacy to control brown rot caused by Monilinia spp. on nectarines and peaches achieving disease incidence reductions among 90 and 100 %. Spray drying could be considered a suitable method to obtain stable and effective formulations of B. subtilis CPA–8. In conclusion, the studies in this thesis demonstrated the biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 to control postharvest diseases of fruit and established the bases for subsequent implementation of production and formulation at commercial level.

Desde 1988, año en que se descubrieron las fumonisinas, toxinas de origen füngicoproducidas básicamente por especies del género Fusarium, numerosos estudiostoxicológicos han puesto de manifiesto su implicación en la problemática para la saludanimal que se deriva del consumo de piensos y otros productos agrícolas contaminados porFusarium sección Liseola por parte del ganado. Asimismo, se ha llegado a asociar de algunamanera el consumo directo de maíz contaminado, con el desencadenamiento de cánceresofágico en humanos, sin embargo la relación causa-efecto no ha sido demostrada.Si bien la contaminación masiva de materias primas por fumonisinas por lo general se asociaa países subdesarrollados del continente africano, asiático y Sudamérica, estudios deincidencia llevados a cabo en otros muchos países han demostrado que en mayor o menorcantidad, las fumonisinas se hallan presentes en la mayoría de muestras de maíz paraalimentación animal ensayadas. Este hecho ha dado lugar a la proliferación de estudios detodo tipo, dentro de los cuales se enmarca esta tesis, encaminados a dilucidar en quémomento y bajo qué condiciones se producen estas micotoxinas.Los objetivos de la presente tesis han sido en primer lugar, determinar el impacto que, la aw,la temperatura y los conservantes químicos, como factores abióticos, ejercen sobre lagerminación, crecimiento y producción de FB] por F. monili/orme y F. proliferatum enmaíz. En segundo lugar se ha determinado el efecto de las interacciones rungicas, es decir,cómo influyen cepas füngicas propias del maíz sobre el desarrollo y producción de FB] porlas cepas de Fusarium, y su relación con el resto de factores abióticos. Posteriormente, a lavista de estos resultados, se ha pasado a evaluar el potencial que la manipulación de losfactores abióticos puede tener como sistema de control del grano almacenado. Por último, sehan ensayado la cuantificación de la producción de enzimas hidrolíticos por Fusariumsección Liseola, como método alternativo de detección de su presencia en grano, así como ladeterminación del valor calórico del grano contaminado por estas mismas cepas, comométodo alternativo de cuantificación de la pérdida de calidad del grano.Se ha demostrado que a pesar de que las cepas de Fusarium son capaces de crecer endiferentes substratos, la producción masiva de fumonisinas únicamente se da en el maíz. Seha visto que sobre este cereal la germinación de estas cepas es posible entre 5 y 37°C y a awà 0,88, el intervalo se estrecha ligeramente para el crecimiento (7-37°C, arw ä 0,90), y porúltimo, y lo que es más importante, la producción de FBt solo es posible entre 10 y 37°C y aaw > 0,93, con las consecuencias que este dato reporta desde el punto de vista del control enmaíz y productos derivados. Se ha demostrado que los conservantes a base de propionatosexistentes en el mercado son útiles para el control del crecimiento de Fusaríum spp. in situ,pero para el control de la producción de FBi sólo es eficaz a concentraciones > 0,07%.La presencia de otras cepas füngicas en cultivos mixtos, en general, inhibió el desarrollo deFusarium, siendo A. flaws y A. niger las especies que causaron mayor impacto. Su efecto,sin embargo, dependió de los factores abióticos involucrados. En general, las especies deFusarium compitieron con éxito a aw altas, y mejor a temperaturas cercanas a los 15°C. Sinembargo, se observó que a a^ altas, la producción de FBi podía verse potenciada pordeterminadas especies, principalmente A. niger.Finalmente, además de la determinación de fumonisinas en materias primas, se ha visto quela monitorización de la actividad enzimàtica en el grano, y de la pérdida de valor calórico delmismo pueden ser buenos índices de la infección del grano por Fusarium. +En conclusión, de la presente tesis se deriva que, en condiciones normales, el control de lacontaminación por fumonisinas del grano en post-cosecha puede llevarse a cabo con éxitopor el simple control de la ÜTW; en esta etapa la flora acompañante puede incluso actuar comofactor adicional de control. Sin embargo, cabe resaltar que a partir de estos mismosresultados se puede deducir que la presencia de fumonisinas en maíz puede ser ya muy altaen el campo, y que años lluviosos puedan provocar niveles altos de las mismas antes delsecado.

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El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patògens enpostcollita de fruita i vegetals, una manca d'adequats substituts pels fungicides iuna preocupació creixent de la societat respecte als perills sanitaris imediambientals que comporten els pesticides i els seus residus, han generat ungran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius, efectius però mésrespectuosos amb el medi ambient. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes ha sorgit com una de les alternatives més prometedores. La socaCPA-1 del llevat Candida sake, el qual s'ha aïllat de la superfície de,mançanes alnostre laboratori, ha demostrat tenir una bona capacitat antagònica enfront elsprincipals fongs patògens en postcollita de fruita de llavor. L'aplicaciód'antagonistes en precollita per controlar les malalties de la fruita de llavor enpostcollita podria ser un mètode avantatjós ja que podria prevenir infeccionslatents, permetria una menor manipulació de la fruita i disminuiria potencialmentels danys i ferides que es donen durant qualsevol dels tractaments de postcollita.Així mateix, es reduiria el període entre la collita i l'emmagatzemament en fred is'evitaria la contaminació addicional per patògens que suposa el tractament químicde la fruita en el "drencher". No obstant, fins ara l'aplicació d'agents de biocontrolen el camp s'ha vist limitada per la sensibilitat que aquests tenen a l'estrèsmediambiental, ja que els microorganismes tenen uns intervals de creixement moltlimitats tant pel que fa a la temperatura com a la humitat.Els objectius del present estudi han estat la determinació de la dinàmicapoblacional de la microflora natural de les mançanes "Golden Delicious" durantdiferents estadis de desenvolupament (Capítol 2), durant la conservació en fred idurant el període de simulació de la comercialització o "shelf life" de la fruita, iavaluar l'efecte que té el tractament amb C. sake en la microflora pròpia de lesmançanes (Capitol 3). D'altra banda, volia avaluar-se el potencial pràctic de lautilització de l'antagonista al camp per aconseguir un bon control de l'agentcausant de la principal malaltia en postcollita de mançanes, Pénicillium expansum(Capitol 4). Tantmateix, els estudis detallats sobre l'ecofisiologia de C. sake hanpermès identificar mètodes per millorar la tolerància de les cèl·lules a l'estrèsmediambiental, la seva viabilitat i adaptació (Capítols 5 i 6); i, mitjançant lamanipulació del contingut de les reserves endògenes acumulades, millorar elcreixement en el camp i aconseguir un bon nivell de biocontrol de la podriduracausada per Pénicillium mitjançant el tractament a camp (Capítol 6).La població microbiana total va variar segons l'estat de desenvolupament del fruit,així com també amb les condicions climàtiques. La microflora predominant en lesmançanes durant el seu desenvolupament van ser les floridures Cladosporium,Alternaria spp. i els llevats blancs. D'altra banda, les floridures patògenes mésimportants en postcollita, P. expansum i Botrytis cinérea, rarament es van aïllardurant el desenvolupament del fruit. En canvi, la presència del gènere Pénicilliumen les mançanes va esdevenir important durant la seva conservació en fred i durantel període de "shelf life" després de la conservació. La població bacteriana va sermàxima a l'estadi de borró i va disminuir durant el període de desenvolupamentdel fruit, essent rarament aïllades durant la collita i la conservació en fred.L'aplicació de C. sake en mançanes, dos dies abans de la collita, va reduirsignificativament la població de Cladosporium i Pénicillium spp. al final de laconservació en fred i durant el període de simulació de la comercialització. Noobstant, l'aplicació del llevat antagonista en precollita, en mançanes foradades iinoculades artificialment va resultar menys efectiva contra la podridura perP. expansum que el tractament en postcollita amb C. saké. La població del'antagonista aplicada en precollita sobre mançanes "Golden Delicious" i ambdanys artificials, disminueix abans i més ràpidament que quan es tracta enpostcollita. Es fa necessària doncs, més recerca per entendre la raó per la qual esdóna aquesta supervivència més baixa de C. sake quan s'aplica en precollita idesprés s'emmagatzema en fred.Es van dur a terme estudis detallats d'ecologia i fisiologia de C. sake per aidentificar l'efecte de l'activitat d'aigua (ow), temperatura, pH i la seva interaccióen el seu creixement per així identificar els seus límits de creixementmediambientals. Es va trobar que les condicions mediambientals en les que l'agentde biocontrol pot desenvolupar-se estan limitades per una aw mínima entre 0.90 i0.92. C. sake va resultar tolerant a un ampli rang de pH (entre 3 i 7),independentment de l'aw i la temperatura.Els polihidroxialcohols i els sucres que es van acumular en major proporció en lescèl·lules de C. sake crescudes en medi basal no modificat (NYDB) van ser arabitol,trealosa i glucosa, amb petites quantitats de glicerol i eritritol. En experimentsin vitro, el creixement de C. sake en medi amb aw reduïda (0.96) va resultar en unamodificació d'aquestes reserves endògenes i una millora de la viabilitat a baixaowquan es compara amb cèl·lules no modificades. En assaigs de laboratori, lescèl·lules de C. sake modificades van mantenir la seva efectivitat i fins i tot la vanmillorar enfront la podridura causada per P. expansum en mançanes "GoldenDelicious". En assaigs de camp, però, no es van observar millores significatives enel control de la podridura per P. expansum en postcollita de mançanes foradadesartificialment i infectades quan comparem cèl·lules no modificades i cèl·lulestolerants a aw baixes. Immediatament després de l'aplicació de l'antagonista enprecollita, es va observar que les cèl·lules no modificades es van adherir millor a lasuperfície de la poma que no pas les modificades. No obstant, després d'unes horessota condicions de camp, la població de cèl·lules aw-tolerants va augmentarsignificativament, mentre que la població de cèl·lules no modificades va romandreconstant. És possible que els requeriments energètics per a la producció d'elevadesconcentracions de reserves endògenes puguin resultar en una modificació de laconcentració o característiques de la matriu extracel.lular del llevat.Probablementuna millora de l'adherència de les cèl·lules modificades podria donar lloc amillores en l'efectivitat.Així doncs, aquest enfoc es presenta com una via interessant per a poderaconseguir alguns avantatges en la formulació dels antagonistes, intentant fer-losmés tolerants a baixes aw permetent-los-hi així, un establiment més efectiu al camp,conservant l'eficàcia com a agents de biocontrol. En aquest aspecte, l'estudi vademostrar que existeix un gran potencial per a la utilització de mitjansecofisiològics que millorin l'adaptació ecològica dels agents de biocontrol aplicatsal camp. / El desarrollo de resistencia a los fungicidas por parte de muchos patógenos depostcosecha de frutas y vegetales, la falta de substitutos adecuados a losfungicidas, y el creciente interés social sobre los peligros ambientales y de saludque tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo demétodos de control alternativos que sean ambientalmente más favorables. Elcontrol biológico empleando microorganismos ha surgido como una de lasalternativas más prometedoras. La levadura Candida sake (cepa CPA-1), aislada ennuestro laboratorio a partir de manzanas, ha demostrado tener actividad antagónicafrente a los principales patógenos de postcosecha en fruta de pepita. Su aplicaciónen precosecha para el control de las enfermedades presentes en fruta de pepita enpostcosecha sería beneficiosa por varias razones. En primer lugar conseguiríamosuna prevención de infecciones latentes, además se requeriría una menormanipulación de la fruta y disminuiría la posibilidad de daños y heridas durante lostratamientos de postcosecha. Los períodos de tiempo entre la cosecha y laconservación en frío se reducirían y finalmente se evitaría la contaminaciónadicional debida a patógenos fúngicos procedentes de los tratamientos químicos dela fruta en el "drencher". Sin embargo, la aplicación de agentes de biocontrol encampo se ve limitada por la sensibilidad de los microorganismos al estrésambiental, especialmente a la humedad relativa y a la temperatura.Los objetivos del presente estudio han sido, la determinación de la dinámica depoblación microbiana propia de las manzanas "Golden Delicious" a lo largo de lasdiferentes fases de su crecimiento (Capítulo 2), durante la conservación en frío y elperíodo de vida útil o "shelf life", y la evaluación del efecto del tratamiento deC. sake sobre la microflora natural (Capítulo 3) . También se han llevado a caboestudios de la aplicabilidad del agente de biocontrol en precosecha; para ello serealizaron inoculaciones en campo del antagonista con el fin de lograr un controladecuado del agente causal de la principal enfermedad de postcosecha demanzanas, P. expansum (Capítulo 4). Los estudios detallados de la ecofisiología deC. sake han fijado los métodos para mejorar la tolerancia de las células al estrésambiental, su viabilidad y adaptación ecológica (Capítulos 5, 6) y, mediantemanipulación del contenido de azúcares y polialcoholes intracelulares, el aumentode su crecimiento en campo y el mantenimiento del biocontrol de la podredumbrede Pénicillium en el tratamiento en precosecha (Capítulo 7).Se ha encontrado que la población microbiana total varía con el estado dedesarrollo de la fruta y con las condiciones climáticas. La flora predominantedurante el desarrollo de las manzanas fueron los mohos filamentososCladosporium y Alternaria spp. y las levaduras blancas. Sin embargo, los patógenos más importantes en postcosecha, P. expanswn y Botrytis cinérea,raramente fueron aislados de manzanas durante los diferentes estadios dedesarrollo. Por el contrario, la presencia del género Pénicillium llegó a serimportante en las manzanas durante las etapas finales de la conservación en frío yen el período de "shelf life". La población bacteriana fue máxima en el estadio deyema y disminuyó durante el período de desarrollo de las manzanas, aislándoseraramente en el momento de la cosecha y durante la conservación en frío. Laaplicación en precosecha de C. saké a las manzanas dos días antes de surecolección disminuyó significativamente las poblaciones de Cladosporium yPénicillium spp. al final de las condiciones de conservación en frío y durante elperíodo de vida útil ambiental. Sin embargo, la aplicación en precosecha de lalevadura antagonista fue menos efectiva contra la podredumbre de Pénicillium enmanzanas artificialmente heridas e inoculadas que el tratamiento de postcosechacon C. sake. Las poblaciones de C. sake aplicada en precosecha sobre manzanas"Golden Delicious" y con daños artificiales, disminuyen antes y más rápidamenteque cuando el tratamiento es en postcosecha. Por esta razón se necesita unainvestigación adicional que permita entender por qué C. sake presenta una menorsupervivencia cuando la aplicación se realiza en precosecha y posteriorconservación en frío. Para ello, se llevaron a cabo estudios de la ecología yfisiología de C. sake con el fin de determinar el efecto de la actividad de agua (a .),temperatura, pH y su interacción en el crecimiento del microorganismo, y poder asífijar los límites ambientales del antagonista. Se encontró que las condicionesambientales en las cuales este agente de biocontrol crece efectivamente estabanlimitadas por una aw entre 0.90 - 0.92. C. sake fue tolerante a un amplio intervalode pH (3-7), independientemente de la temperatura y de la aw.Los principales polihidroxialcoholes y los azúcares intracelulares acumulados enC. sake crecida en un medio base no modificado (NYDB) fueron el arabitol, latrealosa y la glucosa junto con pequeñas cantidades de glicerol y eritritol. Enexperiencias in vitro la producción de C. sake en un medio con aw reducida (0.96)dio como resultado una modificación significativa de estas reservas endógenas yuna mejora en la viabilidad a baja aw, comparada con células no modificadas. Elbiocontrol de P. expansum en .manzanas "Golden Delicious" se mantuvo con esteinoculo modificado tolerante a baja a , y en algunos casos, incluso fue mejor enensayos de laboratorio. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en elbiocontrol en postcosecha de la podredumbre de P. expansum en manzanasartificialmente heridas e inoculadas en ensayos de campo con células de C. sake« .-tolerantes y no modificadas. Inmediatamente después de la aplicación enprecosecha del antagonista se observó una mejor adherencia a la superficie de lamanzana de las células de levadura no modificadas frente a las del inoculo modificado. No obstante, después de unas pocas horas en condiciones de campolas poblaciones del inoculo aw-tolerantes aumentaron significativamente, mientrasque las poblaciones del tratamiento no modificado permanecieron sin cambios.Estos resultados nos hacen pensar que la energía necesaria para la producción dealtas concentraciones de reservas endógenas pueda producir una modificación dela concentración o características de la matriz extracelular de la levadura.Probablemente una mejora en la adherencia de las células modificadas podríatraducirse en una mayor efectividad.Así pues, algunas de estas ventajas ecológicas deberían ser aprovechadas en laformulación del inoculo tolerante a aw bajas para de esta forma lograr unaestabilidad más efectiva en el campo, conservando su eficacia en el biocontrol.Este aspecto del estudio demostró que el empleo de medios ecofisiológicos paramejorar la adaptación ecológica de los agentes de biocontrol y para su aplicaciónen campo es altamente prometedora, y que ésto podría tener un profundo impactoen el desarrollo de agentes de control biológico efectivos en precosecha. / The development of resistance to fungicides by many postharvest pathogens offruits and vegetables, a lack of adequate fungicide replacements, and growingpublic concern over health and environmental hazards from pesticides, havetogether generated new interest in the development of alternative moreenvironmentally friendly control methods. Biological control usingmicroorganisms has emerged as one of the most promising alternatives. The yeastCandida sake (strain CPA-1), which was isolated from the apple surface in ourlaboratory, has been demonstrated to have antagonistic activity against the majorpostharvest pathogens of pome fruits. Preharvest antagonist application forpostharvest control of pome fruit diseases would be advantageous as latentinfections may be prevented, less fruit manipulation would be required, and itwould decrease the potential for damage and injuries during any postharvesttreatments. The time periods between harvest and cold storage would be reducedand additional contamination by pathogenic fungi from drenching solutions usedduring chemical treatments would be avoided. However, application of biocontrolagents in the field has been limited by sensitivity to environmental stressesincluding a narrow relative humidity and temperature range.The aims of the present study were to determine the microbial population dynamicson Golden Delicious apples during different developmental stages (Chapter 2),during cold storage and the ambient shelf-life period, and evaluate the effect ofC. sake treatment on the resident microflora (Chapter 3). Studies of the practicalpotential of using field inoculation of the antagonist to achieve good control theresponsible agent of the major postharvest disease of apples in Spain, Pénicilliumexpansum, was investigated (Chapter 4). Detailed studies of the ecophysiology ofC. sake identified methods for improving the environmental stress tolerance ofcells, their viability and ecological fitness (Chapters 5, 6); and by manipulation ofintracellular sugar alcohol and sugar content, to enhance growth in the field andconserve biocontrol of Pénicillium rot by field treatment (Chapter 7).Total microbial populations were found to vary with development stage, and withprevailing climatic conditions. The predominant mycoflora on apples duringdevelopment were the filamentous fungi Cladosporium mú Alternaria spp. andwhite yeasts. However, the most important postharvest pathogens/1, expansum andBotrytis cinérea were seldom isolated from ripening apples. On the contrary, thepresence of the Pénicillium genus became important on apples during later coldstorage and ambient shelf-life period. Bacterial populations were maximum at thebud stage and decreased during the development period of apples, isolated at harvest and during cold storage. Preharvest application of C. sake toapples two days before harvest significantly decreased populations ofCladosporium and Pénicillium spp. by the end of cold storage conditions andduring ambient shelf-life period. However, preharvest application of theantagonistic yeast was less effective against Pénicillium rot in artificiallyinoculated and wounded apples than postharvest treatment with C. sake. C, sakepopulations decreased faster after preharvest application than when appliedpostharvest during subsequent cold storage. Further research was thus needed tounderstand the reason for the lower survival of C. sake, when applied preharvestduring subsequent cold storage. Detailed studies were carried out on the ecologyand physiology of C. sake to identify the effect water activity (aw), temperature, pHand their interaction on growth and identify environmental limits of the antagonist.The environmental niche within which this biocontrol agent will effectively growwas found to be limited by about 0.90-0.92 aw. C. sake was tolerant of a wide rangeof pH levels (3-7) regardless of aw and temperature. The major intracellularpolyols/sugars accumulated in C. sake cells grown on unmodified basal medium(NYDB) were arabitol, trehalose and glucose with small amounts of glycerol anderythritol. Production of C. sake in reduced aw media (0.96) resulted in asignificant modification of these endogenous reserves and an improvement inviability at lowered aw when compared to unmodified cells in in vitro experiments.Biocontrol of P. expansum on Golden Delicious apples by these modified low owtolerantinocula was maintained, and in some cases improved in laboratory assays.However, no significant improvements were observed in postharvest biocontrol ofP. expansum rot in apples artificially wounded and infected in field trials with tocompare unmodified and aw-tolerant cells of C. sake. Immediately after preharvestapplication of the antagonist it was notable that unmodified yeast cells adheredbetter to the apple surfaces than the modified inocula. However, after a few hoursunder field conditions populations of the ow-tolerant inocula increasedsignificantly, while those of unmodified treatment populations remainedunchanged. It is also possible that the energy requirements for the production ofhigh concentrations of endogenous reserves could result in a modification of theconcentration or characteristics of the matrix. Some ecological advantages may begained in formulating low-aw tolerant inocula for more effective establishment inthe field, while conserving biocontrol efficacy. This aspect of the studydemonstrated that great potential exists for using ecophysiological means forimproving the ecological fitness of biocontrol agents applied in the field, and thiscould have a profound impact on the development of effective preharvestbiological control agents for use in the field.

El objetivo de este trabajo ha sido la experimentación condistintos equipos industriales de microfiltración tangencialy probarlos con diferentes tipos de vino para determinar elefecto de este sistema de filtración en los vinos filtrados.t ».Ha habido una evolución en el diseño y funcionamiento de losequipos de microfiltración tangencial. Desde el primer equipoutilizado en el año 1992, se han ido incorporando mejoras, en1 !·el segundo del año 1993 y en el tercero del año 1996. Cadaaño ha aportado nuevas prestaciones en los equiposfiltrantes.En cuanto al funcionamiento de los equipos de microfiltracióntangencial se ha pasado de incorporar todo el concentrado enel depósito pulmón del vino a filtrar caso Romicon®, amezclar el vino a filtrar con un porcentaje pequeño deconcentrado (entre el 1% al 1,5%) según el tipo de vino, enlos modelos de Seitz y de Vaslin Bucher.Otra mejora en los equipos de microfiltración tangencial hasido en el aspecto de la limpieza de las membranas. Laposibilidad de limpiar la membrana sin necesidad de parar lafiltración, ya sea con el sistema de parada de la bomba derecirculación por cinco segundos cada veinte minutos en elequipo Seitz o por el sistema de retrofiltración y enjuaguesintermedios en el equipo Vaslin Bucher.Se ha adoptado el criterio expresado en diferetes trabjos deque la microfiltración tangencial no tiene ningún efectonegativo sobre los parámetros físico-químicos que controlanla calidad de los vinos.La calidad de limpidez obtenida en una sola filtración esbuena entre brillante y clara, dependiendo del tipo de vino afiltrar y las características del aparato.En la actualidad las ventajas de la microfiltracióntangencial en el sector enológico son:a) el respeto por el medio ambiente, al no producir residuoscontaminantes.b) la total automatización de su funcionamiento.c) la mínima merma de vino.d) la eliminación de los coadyuvantes de filtración.e) la simplificación de los distintos procesos de filtraciónquedando reducido a un solo proceso: la microfiltracióntangencial.Como desventaja, el coste inicial del equipo demicrofiltración tangencial respecto a filtros de tierra, deplacas o cartuchos.

Es fiimonisines, produïdes principalment per Fusariumverticillioides i F. proliferatum, i la zearalenona (ZEA) i el deoxinivalenol(DON), produïdes per F. graminearum entre altres espècies de Fusarium,són micotoxines que es troben freqüentment al panís. Donat que laproducció de micotoxines es veu influenciada per diferents factors biòtics iabiòtics, el grau de contaminació amb aquestes toxines varia any rera any,depenent tant de las condicions climàtiques com de les pràctiques agràries.Les espècies del gènere Fusarium os consideren com a fongs de camp, ja quecolonitzen els conreus abans de la collita; la prevenció mitjançant el controlprecollita és el primer pas per a minimitzar la contaminació amb lesmicotoxines produïdes per aquestes espècies. L'ús de fungicides sintèticss'està controlant cada cop més i la pressió per a trobar alternatives méssegures augmenta. Diversos estudis s'han centrat en trobar fungicides quesiguin segurs tant per a la salut com per al medi ambient. Els extractesnaturals de plantes poden proveir una alternativa als fungicides sintètics.Diferents investigadors han realitzat estudis observant l'efecte dels olisessencials en el creixement fúngic i han constatat que alguns d'ells podrienservir com fungicides naturals.Els objectius d'aquesta tesi han estat a) avaluar la contaminació perfumonisines Bi (FBO en panís i productes derivats del panís. destinats alconsum humà i animal a Espanya. En segon lloc, b) s'ha determinat l'efectede les interaccions fúngiques, entre soques de F. verticillioides i F.proliferatum productores de fumonisines, amb soques de F. graminearum,productores de zearalenona i deoxinivalenol, en el creixement i la produccióde micotoxines y la relació amb els factors abiòtics. Posteriorment, c) s'harealitzat una avaluació in vitro d'una sèrie d'olis essencials per a determinarel seu efecte inhibitor! del creixement de F. verticillioides, F. proliferatum iF. graminearum. Finalment, d) s'han seleccionat cinc olis essencials amb elsquals s'han continuat els estudis, a fi d'avaluar el seu efecte com inhibidorsdel creixement de F. verticillioides, F. proliferatum i F. graminearum i de laproducció de fumonisines, zearalenona i deoxinivalenol en funció delsfactors abiòticos (aw i temperatura) en grans de panís irradiats.Es va veure que el 86 % de les mostres recollides durant els anys1998-2000, destinades al consum animal contenien FBi en un interval de 89-8760 ng g"1. Quatre d'aquestes mostres presentaren nivells de FBi superiorsa 5000 ng g"1, que és el límit recomanat pel Comité de Micotoxines de 1'Associació Americana de Veterinaris de Laboratoris de Diagnosi per cavallsi altres equins. El 23 % de las mostres destinades al consum humà estavencontaminades amb FBl5 tot i que els valors trobats van ser generalmentbaixos. Es va veure que els productes de panís que han estat processatsindustrialment, principalment per via tèrmica, presenten concentracionsmenors de FBi.En general, la producció de les micotoxines estudiades no semblatenir un paper lligat a l'obtenció d'un avantatge competitiu davant d'altresespècies. Tampoc s'observà una inhibició de la producció de micotoxinesdeguda a la presència d'altres espècies competidores. La producció va estarmés condicionada pels factors abiòtics, com la temperatura i la aw que per lapossible interacció entre diferents espècies de floridures.Els olis essencials que mostraren major activitat antifúngica forenels de canyella, clau, lemongrass, orenga i palmarosa. L'acció antimicòtica iantimicotoxigènica d'aquests cinc olis essencials fou més accentuada quan elgra tenia la màxima aw estudiada (0,995). Els olis essencials de orenga, clau ilemongrass inhibiren significativament el creixement de totes les soques deles tres espècies de Fusarium estudiades quan el gra de panís tenia una a^inicial de 0,995 i s'incubava a 20 o a 30 °C. La producció de FI?! per F.verticillioides i F. proliferatum, i la producció de DON per F. graminearumforen significativament inhibides pels cinc olis essencials estudiats quan elsgrans de panís tenien una aw inicial de 0,995 y s'incubaven a 30 °C. Noobstant, al realitzar la incubació a 20 °C, la producció de FB] per F.verticillioides fou estimulada pels olis essencials de clau i orenga. D'altrabanda, la producció de ZEA fou inhibida només per l'oli essencial depalmarosa, a les dues temperatures quan la aw inicial del panís era de 0,995Realitzar un seguiment de la temperatura, la precipitació y la humitatrelativa durant el desenvolupament del gra de panís al camp permetriaefectuar una sèrie de recomanacions sobre els tractaments a seguir. Eltractament amb olis essencials com a fungicides podria ser una alternativa,encara que prèviament s'haurien de fer més estudis per a determinar laviabilitat. La implementació d'un sistema integrat, que consistiriabàsicament en un programa de control basat en l'Anàlisi de Perills y PuntsCrítics de Control (APPCC), seria necessari per a assegurar una baixacontaminació en els aliments. / Fumonisins, which are mostly produced by Fusarium verticillioidesand F. proliferatum, and zearalenone (ZEA) and deoxynivalenol (DON),which are produced by F. graminearum among other Fusarium species, arecommon contaminants in maize. These mycotoxins production is influencedby some biotic and abiotic factors, therefore contamination level varies everyyear, and depends on environmental conditions and agricultural practices.Fusarium spp. is usually described as a field fungi, because it colonises thecrop before harvest; the preharvest control is the first step to prevent fromthe invasion of these Fusarium species and mycotoxins production underfield conditions. The use of synthetic fungicides is becoming morecontrolled, and there is an increasing pressure to find safer alternatives.Several researchers have focused in the search for fungicides that are safe tohumans and for the environment. Natural extracts from plants may providean alternative to synthetic fungicides. Researchers have examined the effectof some essential oils on growth rates of some fungi and have shown thatsome of them could be used as natural fungicides.The objectives of the present thesis were to investigate a) thefumonisin Bi (FBO contamination on corn and corn-based food productsfrom Spain, intended for animal and human consumption; b) the effect offungal interactions between producing fumonisin isolates, and isolates of F.graminearum producing zearalenone and deoxynivalenol, on growth rate andmycotoxins production and the relationship with abiotic factors; c) an invitro screening of some essential oils on inhibition of mycelial growth of F.verticillioides, F. proliferatum and F. graminearum; and d) the study wascontinued with five selected essential oils from the screening assess theirefficacy on growth rate of F. verticillioides, F. proliferatum and F.graminearum and inhibition of FBb zearalenone and deoxynivalenolproduction at different aw and temperature conditions in maize grain.

En l'actualitat, el mètode més utilitzat per a la pasteurització d'aliments es l'aplicació decalor, encara que en aquestes darreres dècades estan sorgint tecnologies alternatives, entreles quals cal destacar l'ús dels polsos elèctrics d'alta intensitat de camp (PEAIC).En llet, s'ha vist que amb l'aplicació d'aquesta tècnica es poden aconseguir alts nivellsd'inactivació microbiana, encara que igual que en altres productes, hi ha pocs estudis sobrel'efecte que produeixen en enzims i components minoritaris. En aquest treball, s'ha estudiatl'efecte dels PEAIC en una lipasa i una proteasa produides per dos bacteris psicròtrofs,Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis, respectivament, en llet o solució modeld'ultrafiltrat de llet (SMUL). A més, s'ha estudiat l'efecte dels PEAIC en diversesvitamines tant hidrosolubles como liposolubles; per així, avaluar 1' efectivitat d'aquestatècnica en la inactivació d'enzims i el grau d'alteració que provoca en el valor nutricionalde la llet.En primer lloc, es van elegir i validar els mètodes que s'utilitzarien per quantificar lesactivitats d'ambdós enzims i el contingut en vitamines, observant-se que en tots els casos,els mètodes van resultar fiables pel seu ús previst.La llet o la SMUL amb la lipasa o proteasa es van processar mitjançant PEAIC o calor,observant-se que amb PEAIC es va poder reduir en un elevat percentatge l'activitatd'aquests enzims termoresistents, encara que l'efectivitat del tractament depèn de lescaracterístiques del medi, les condicions de processat i de les característiques de l'equip detractament.La lipasa de Pseudomonas fluorescens suspesa en SMUL va resultar resistent alstractaments tèrmics de pasteurizació, mentre que quan es va sotmetre a un tractamentmitjançant PEAIC per tandes o en fluxe continu, l'activitat va disminuir amb l'augment dela intensitat de camp (16.4-37.3 kV/cm) i el nombre de polsos (fins a 80 polsos). Eltractament per tandes va ser molt més efectiu que el continu, ja que aplicant densitats d'energia similars (504.97 y 424.36 kJ/1) l'activitat es va reduir un 62.1% i un 13%,respectivament.La proteasa de Bacillus subtilis va resultar molt més resistent que la lipasa estudiada alstractaments mitjançant PEAIC, tant en SMUL com en llet desnatada, ja que després d'aplicar fins a 500 kJ/1 en tres equips diferents es va observar poca efectivitat en lainactivació de la proteasa tant en el procés en tandes com en el continu. Per aconseguir unainactivació considerable de l'enzim es van requerir tractaments de densitats d' energiasuperiors a 6000 kJ/1. L'activitat de l'enzim suspès en SMUL o en llet (desnatada i sencera)es va reduir amb 1' increment de la duració del tractament (fins a 895.8 (is), la intensitat decamp (19.7-35.5 kV/cm), la densitat d'energia (fins a 6786.8 kJ/1) i la freqüència (66.66-111.11 Hz). El medi en que els tractaments van resultar més efectius va ser la lletdesnatada, on es va aconseguir una inactivació del 81.1% després d'un tractament de6559.8 kJ/1 a 111.11 Hz. Al pasteuritzar les mostres tèrmicamente es va observar uncomportament similar, ja que en condicions de pasteurización alta (75°C-15 s) l'enzim varesultar molt més sensible en llet desnatada que en SMUL.En ambdós casos, la reducció de l'activitat enzimàtica es va poder relacionar mitjançantdiversos models matemàtics respecte a la densitat d'energia, temps de tractament i/ointensitat de camp.L'efecte dels PEAIC en les vitamines (tiamina, riboflavina, àcid ascorbic, colecalciferol itocoferol) en llet i SMUL, es va estudiar aplicant tractaments de fins a 400 (is a intensitatsde camp de 18.3 a 27.1 kV/cm. L'efecte també es va comparar amb el resultant d'aplicardiversos tractaments tèrmics. A excepció de l'àcid ascorbic, en cap cas es va produirpèrdues significatives del contingut en vitamines. La llet va retenir major quantitat d'àcidascorbic després d'un tractament de 400 |j.s a 22.6 kV/cm (93.4%) que després d'aplicarprocessos tèrmics de pasteurització baixa (49.7%) o alta (86.7%). La disminució delcontingut en àcid ascorbic va seguir una tendència de tipus exponencial en ambdós tipus detractament (PEAIC i calor). També es va observar que la retenció de vitamina després d'aplicar el tractament mitjançant PEAIC va ser més alta en llet que en SMUL, demostrant-seun efecte protector dels components naturals de la llet.En aquest treball s'ha provat que els PEAIC poden ser una bona alternativa al tractamenttèrmic per la conservación de llet; ja que amb aquesta tècnica es poden aconseguir nivellsalts d'inactivació d'enzims indesitjables sense causar grans alteracions en el contingut envitamines. / En la actualidad, el método más usado para la pasteurización de alimentos es la aplicaciónde calor, aunque en estas últimas décadas están surgiendo tecnologías alternativas entre lasque cabe destacar el uso de los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC).Se ha visto que con esta técnica se pueden conseguir altos niveles de inactivaciónmicrobiana en leche, aunque al igual que en otros productos, hay pocos estudios acerca delefecto que produce en enzimas y componentes minoritarios. En este trabajo, se ha estudiadoel efecto de los PEAIC en una lipasa y una proteasa producidas por dos bacteriaspsicrótrofas, Pseudomonas flúor escens y Bacillus subtilis, respectivamente, suspendidas enleche o solución modelo de ultrafiltrado de leche (SMUL). Además, se ha estudiado elefecto de los PEAIC en diversas vitaminas tanto hidrosolubles como liposolubles; para así,evaluar la efectividad de esta técnica en la inactivación de enzimas y el grado de alteraciónque provoca en el valor nutricional de la leche.En primer lugar, se eligieron y validaron los métodos que iban a ser usados para lacuantificación de las actividades de ambos enzimas y el contenido en vitaminas,observándose que en todos los casos, los métodos resultaron fiables para el uso previsto.La leche o la SMUL conteniendo la lipasa o proteasa se procesó mediante PEAIC o calor,observándose que mediante PEAIC se pudo reducir en un elevado porcentaje la actividadde estos enzimas termoresistentes, aunque la efectividad del tratamiento dependió de lascaracterísticas del medio, las condiciones de procesado y de las características del equipode tratamiento.La lipasa de Pseudomonas fluorescens suspendida en SMUL resultó resistente a lostratamientos térmicos de pasteurización, mientras que cuando se sometió a tratamientosmediante PEAIC por tandas o en flujo continuo, la actividad disminuyó con el aumento dela intensidad de campo (16.4-37.3 kV/cm) y el número de pulsos (hasta 80 pulsos). Eltratamiento por tandas fue mucho más efectivo que el continuo, ya que aplicandodensidades de energía similares (504.97 y 424.36 kJ/1) la actividad se redujo un 62.1% y un13%, respectivamente.La proteasa de Bacillus subtilis resultó mucho más resistente a los tratamientos mediantePEAIC que la lipasa estudiada, tanto en SMUL como en leche desnatada, ya que despuésde aplicar hasta 500 kJ/1 en equipos diferentes se observó poca efectividad en lainactivación de la proteasa tanto en tratamiento por tandas como en flujo continuo. Paraconseguir una inactivación considerable del enzima se requirieron tratamientos dedensidades de energía superiores a 6000 kJ/1. La actividad del enzima suspendido en SMULo en leche (desnatada y entera) se redujo al aumentar la duración del tratamiento (hasta895.8 u.s), la intensidad de campo (19.7-35.5 kV/cm), la densidad de energía (hasta 6786.8U/1) y la frecuencia (66.66-111.11 Hz). El medio en que los tratamientos resultaron másefectivos fue la leche desnatada, consiguiéndose una inactivación del 81.1% después de untratamiento de 6559.8 kJ/1 a 111.11 Hz. Al pasteurizar las muestras térmicamente, seobservó un comportamiento similar, ya que en condiciones de pasteurización alta (75°C-15s) el enzima resultó mucho más sensible en leche desnatada que en SMUL.En ambos casos, la reducción de la actividad enzimàtica se pudo relacionar mediantediversos modelos matemáticos respecto a la densidad de energía, tiempo de tratamiento y/ointensidad de campo.El efecto de los PEAIC en las vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido ascòrbico,colecalciferol y tocoferol) en lèche y SMUL, se estudió aplicando tratamientos de hasta 400(is a intensidades de campo de 18.3 a 27.1 kV/cm. El efecto también se comparò con elresultante de aplicar diversos tratamientos térmicos. A excepción del ácido ascòrbico, enningún caso se produjeron pérdidas significativas del contenido en vitaminas. La lecheretuvo mayor cantidad de ácido ascòrbico después de un tratamiento de 400 jas a 22.6kV/cm (93.4%) que después de aplicar procesos térmicos de pasteurización baja (49.7%) oalta (86.7%). La disminución del contenido en ácido ascòrbico siguió una tendencia de tipoexponencial en ambos tipos de tratamiento (PEAIC y calor). También se observó que laretención de vitamina después de aplicar el tratamiento mediante PEAIC fue mayor enleche que en SMUL, demostrándose un efecto protector de los componentes naturales de laleche.En este trabajo se ha probado que los PEAIC pueden ser una buena alternativa altratamiento térmico para la conservación de leche; ya que con esta técnica se puedenconseguir niveles altos de inactivación de enzimas indeseables sin causar grandesalteraciones en el contenido en vitaminas. / Nowadays, the most used method for food pasteurization is the application of heat.Nevertheless, in the last decades, several alternative technologies are emerging and one ofthe most promising is high intensity pulsed electric fields (HIPEF).In milk, high levels of microbial destruction can be achieved using this technology.However, as for other products, few studies exist about the effect of HIPEF on enzymesand other minor food components. In this work, the effect of HIPEF on a lipase and aprotease produced by the psychrothophic bacteria Pseudomonas fluorescens and Bacillussubiilis, suspended in milk or simulated milk ultrafiltrate (SMUF) has been studied. Theeffect of HIPEF on several hidro or liposoluble vitamins has also been studied in order toknow the effectiveness of this technology in inactivating undesirable enzymes and thechanges that cause on the nutritional value of milk.First or all, the methods required for the quantification of enzyme activities and vitamincontent were chosen and validated. It was observed that in all the cases, the methodsresulted reliable for their use.Milk or SMUF samples containing lipase or protease were processed by HIPEF or heat.HIPEF could reduce quite a lot the activity of this thermorésistant enzymes, althoughtreatments effectiveness depended on the medium characteristics, process conditions andequipment configuration.Lipase from Pseudomonas fluorescens suspended in SMUF resulted resistant to thermalpasteurization, whereas when subjected to a batch or a continuous mode HIPEF treatment,its activity decreased with the increase of the field strength (16.4-37.3 kV/cm) and thenumber of pulses (up to 80 pulses). The batch mode treatment was much more effectivethan that on continuous mode, since after applying similar energy densities (504.97 and424.36 kJ/1) the activity was reduced a 62.1% and a 13%, respectively.Protease from Bacillus subtilis resulted much more resistant than the evaluated lipase toHIPEF processes whatever was the treatment medium (SMUL, skim milk). After FflPEFtreatments of up to 500 kJ/1 using different equipments (batch or continuous), loweffectiveness on protease inactivation was observed. To achieve a notable level of enzymeinactivation, treatments of energy densities higher than 6000 kJ/1 were required.Protease activity suspended in SMUF or milk (skim or whole milk) subjected to HIPEFdecreased with the increase of the treatment duration (up to 895.8 (as), field strength (19.7-35.5 kV/cm), energy density (up to 6786.8 kJ/1) and the pulse repetition rate (66.66-111.11Hz).Treatments resulted more effective in skim milk than in SMUF and whole milk, since up toa 81.1% inactivation was achieved after a HIPEF treatment of 6559.8 kJ/1 at 111.11 Hz.When samples were processed thermally, a similar behavior was observed, since theenzyme resulted more sensitive in skim milk than in SMUF after a pasteurization process(75°C-15 s).In both cases, the reduction of enzyme activity could be fitted to several mathematicalmodels related to the energy density, treatment time and/or field strength.The effect of HIPEF on vitamins (thiamin, riboflavin, ascorbic acid, cholecalciferol andtocopherol) in milk and SMUF, was studied by applying treatments of up to 400 (is at fieldstrengths form 18.3 to 27.1 kV/cm. The effect of HIPEF on vitamins was also compared tothat of thermal pasteurization. Only ascorbic acid showed changes on its content afterHIPEF or thermal treatments. Milk retained higher levels of ascorbic acid after a HIPEFtreatment of 400 (is at 22.6 kV/cm (93.4%) than after thermal pasteurization processes of63°C-30 min (49.7%) or 75°C-15 s (86.7%). Ascorbic acid content reduction followed anexponential model in both cases (HIPEF and heat). It was also observed that vitaminretention after a HIPEF treatment was higher in milk than in SMUF, demonstrating aprotective effect of milk components.In this work, it has been proved that HIPEF might be a good alternative to thermal processfor food preservation. Using this technology, high levels of enzyme inactivation can beachieved without causing important changes in the vitamin content.